动物细胞用培养液、以及培养容器的制造方法
【专利摘要】本发明提供一种动物细胞用培养液，其可以充分地发挥高气体透过性培养容器的性能、能够获得高的细胞增殖效率。本发明的动物细胞用培养液是用于提高在动物细胞的呼吸中进行的TCA循环(tricarboxylic acid cycle)的代谢活性的动物细胞用培养液，以2.3mmol/L～6.0mmol/L的浓度作为有效成分含有属于构成TCA循环的要素的被代谢为琥珀酰辅酶A的氨基酸。
【专利说明】
动物细胞用培养液、以及培养容器
技术领域
[0001]本发明涉及一种细胞的培养技术，特别涉及用于提高动物细胞的增殖效率的动物细胞用培养液、以及培养容器。
【背景技术】
[0002]近年来，在医药品的生产、基因治疗、再生医疗、免疫细胞疗法等领域中，要求在人工环境下高效地大量培养细胞和组织、微生物等。
[0003]在这样的状况下，向由气体透过性膜构成的培养容器中封入细胞和培养液，在封闭系统中大量培养细胞。
[0004]本
【申请人】为了在这样的细胞培养中获得优异的细胞增殖效率，开发出具有高气体透过性的多层膜，已经完成了使用了该多层膜的高气体透过性培养容器(参照专利文献I)。可以认为，若使用该高气体透过性培养容器进行细胞培养，则可以高效地进行细胞的呼吸中所必需的气体交换，因而细胞增殖效率有望大幅度提高。
[0005]因此，本
【申请人】使用图1中所示的作为高气体透过性培养容器的培养容器A(氧透过度9300ml/m2.day.atm)、和由以往的气体透过性膜构成的通常的培养容器B(氧透过度5200ml/m2.day.atm)，进行了用于使人的淋巴细胞增殖的细胞培养(对应于后述的比较例1、2)。其结果是，如图2所示，在培养容器A和培养容器B中，得到显示细胞增殖效率基本上没有变化的数据。
[0006]其理由虽然并不确定，然而可以推测可能是因为，在细胞培养中没有进行能够尽可能充分地发挥高气体透过性培养容器的性能的氧呼吸。另外，作为无法进行充分氧呼吸的理由，可以认为可能是因为在培养中所用的培养液中对于氧呼吸而言所必需的营养素不足。
[0007]此处，细胞在增殖时，利用了因呼吸而产生的能量，然而在该呼吸中，有糖酵解和氧化磷酸化，利用这些来进行ATP(三磷酸腺苷)的生产。
[0008]糖酵解是厌氧的代谢，在将葡萄糖变换为丙酮酸的过程中，每I个分子葡萄糖生产2ATP，由丙酮酸生成乳酸。一旦生成乳酸，培养液的pH就会下降，增殖效率降低。
[0009]氧化磷酸化是好氧的(利用氧的)代谢，将丙酮酸变换为乙酰辅酶A而提供给TCA循环(tricarboxylic acid cycle，三羧酸循环)，不生成乳酸，而将TCA循环中产生的NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide))等提供给电子传递系统，每I个分子葡萄糖生产38个ATP。通过像这样在好氧的环境下进行氧化磷酸化，能量生产效率就会提高，因此葡萄糖的消耗量减少。
[0010]但是，即使是进行好氧呼吸的细胞，有时也未必要使用氧。例如，癌细胞在好氧的环境下也不是利用氧化磷酸化，而是利用糖酵解来生产ATP。对此可以认为，由于癌细胞旺盛地进行分裂，因此与有利于能量生产的氧化磷酸化相比，还是要使用有利于核酸、NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate))的生产的糖酵解(包含戊糖-磷酸路径)。[0011 ]前述的淋巴细胞的培养中，可以推测可能是，由于产生大量的乳酸，因此积极地使用糖酵解，没有进行可以充分地发挥高气体透过性培养容器的性能的氧化磷酸化。
[0012]然而，若进行可以充分地发挥高气体透过性培养容器的性能的氧化磷酸化，能否像期待那样提高细胞的增殖效率也并不确定。另外，对于如何操作才能提高细胞的呼吸中的氧化磷酸化的比例也并不明确。
[0013]作为有关于这样的提高细胞的呼吸中的氧化磷酸化的比例的记载的现有技术文献，可以举出专利文献2及专利文献3。
[0014]专利文献2中，公开过减少哺乳类细胞的增殖时的葡萄糖消耗、减少乳酸盐形成的方法。具体而言公开过:在I?50mmol/L的柠檬酸或柠檬酸盐的存在下利用在不含血清的培养基中进行培养的哺乳类细胞的培养来产生蛋白质的方法。根据该方法，由于可以减少细胞的增殖时的葡萄糖消耗和乳酸盐形成，因此认为细胞的呼吸中的氧化磷酸化的比例提尚O
[0015]另外，专利文献3中，公开过如下的培养基，是用于不使用血清而仅利用有限的氨基酸的添加来改善细胞增殖的无血清培养用培养基，添加有精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸。
[0016]现有技术文献
[0017]专利文献
[0018]专利文献1:日本专利第5191970号公报
[0019]专利文献2:日本专利第5344094号公报
[0020]专利文献3:日本特开2004 — 275047号公报
【发明内容】
[0021]发明所要解决的问题
[0022]然而，这些专利文献中记载的技术中，很难充分地发挥高气体透过性培养容器的性能而大幅度提高细胞的增殖效率。
[0023]因而，本发明人等进行了深入研究，结果发现，通过在培养液中以2.3mmol/L?6.0mmol/L的浓度作为有效成分含有被代谢为属于构成TCA循环的要素的琥珀酰辅酶A的氨基酸，就可以提高细胞的呼吸中的TCA循环的代谢活性，提高氧化磷酸化的比例。此外，在使用填充有该培养液的高气体透过性培养容器进行细胞培养的情况下，与使用了通常的气体透过性培养容器的情况相比，成功地明显提高细胞增殖效率，从而完成了本发明。
[0024]即，本发明的目的在于，提供可以充分地发挥高气体透过性培养容器的性能、能够获得高的细胞增殖效率的动物细胞用培养液、以及培养容器。
[0025]用于解决问题的方法
[0026]为了达成上述目的，本发明的动物细胞用培养液是用于提高在动物细胞的呼吸中进行的TCA循环(tricarboxylic acid cycle)的代谢活性的动物细胞用培养液，采用了以2.3mmol/L?6.0mmol/L的浓度作为有效成含有被代谢为属于构成TCA循环的要素的琥?白酰辅酶A的氨基酸的构成。
[0027]另外，本发明的培养容器采用了在气体透过性容器中填充有本发明的动物细胞用培养液的构成。
[0028]发明效果
[0029]根据本发明，能够提供可以充分地发挥高气体透过性培养容器的性能、能够获得高的细胞增殖效率的动物细胞用培养液、以及培养容器。
【附图说明】
[0030]图1是示出表示高气体透过性培养容器及通常的气体透过性培养容器的氧透过度的图表的图。
[0031 ]图2是示出向高气体透过性培养容器及通常的气体透过性培养容器中分别填充以往的动物细胞用培养液而进行细胞培养的结果的图。
[0032]图3是用于说明在细胞的呼吸中进行的TCA循环的图。
[0033]图4是示出本发明的实施方式的动物细胞用培养液与以往的动物细胞用培养液的氨基酸组成的图。
[0034]图5是示出表示借助使用了分别填充有本发明的实施方式的动物细胞用培养液和以往的动物细胞用培养液的高气体透过性培养容器及通常的气体透过性培养容器的细胞培养得到的培养细胞数的比较结果的折线图的图。
[0035]图6是示出表示借助使用了分别填充有本发明的实施方式的动物细胞用培养液和以往的动物细胞用培养液的高气体透过性培养容器及通常的气体透过性培养容器的细胞培养得到的培养细胞数的比较结果的条形图的图。
[0036]图7是示出表示借助使用了分别填充有本发明的实施方式的动物细胞用培养液和以往的动物细胞用培养液的高气体透过性培养容器及通常的气体透过性培养容器的细胞培养得到的葡萄糖消耗率的比较结果的条形图的图。
[0037]图8是示出表示借助使用了分别填充有本发明的实施方式的动物细胞用培养液和以往的动物细胞用培养液的高气体透过性培养容器及通常的气体透过性培养容器的细胞培养得到的乳酸产生率的比较结果的条形图的图。
[0038]图9是示出本发明的实施方式的各动物细胞用培养液和以往的动物细胞用培养液的氨基酸组成的图。
[0039]图10是示出表示借助使用了分别填充有本发明的实施方式的各种动物细胞用培养液和以往的动物细胞用培养液的高气体透过性培养容器的细胞培养得到的细胞增殖率的比较结果的条形图的图。
[0040]图11是示出表示两种的高气体透过性培养容器及通常的气体透过性培养容器的氧透过度的图表的图。
[0041]图12是示出表示借助使用了分别填充有本发明的实施方式的各种动物细胞用培养液和以往的动物细胞用培养液的两种的高气体透过性培养容器及通常的气体透过性培养容器的细胞培养得到的细胞增殖率的比较结果的条形图的图。
[0042]图13是示出本发明的实施方式的动物细胞用培养液和以往的动物细胞用培养液等的氨基酸组成的图。
[0043]图14是示出本发明的实施方式的各动物细胞用培养液的组成的图。
[0044]图15是示出表示借助使用了分别填充有本发明的实施方式的各种动物细胞用培养液和以往的动物细胞用培养液的高气体透过性培养容器的细胞培养得到的细胞增殖率的比较结果的条形图的图。
【具体实施方式】
[0045]以下，对本发明的动物细胞用培养液的一个实施方式进行详细说明。
[0046]本实施方式的动物细胞用培养液是用于提高动物细胞的呼吸中进行的TCA循环的代谢活性的动物细胞用培养液，以6.0mmol/L?15mmol/L的浓度作为有效成分含有必需氨基酸。
[0047]本实施方式的必需氨基酸是指包括完全必需氨基酸和准必需氨基酸的12种氨基酸，具体而言，是半胱氨酸、苏氨酸、色氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、以及苯丙氨酸。在本实施方式的动物细胞用培养液中，含有这些全部的必需氨基酸。
[0048]不一定是动物细胞用培养液中的必需氨基酸的含量越多，细胞增殖效率就越是提高。即因为，在氨基酸被代谢时作为氮系排泄物产生氨，因此当它在培养液中蓄积时，培养液的PH就会升高而使培养环境恶化，细胞的增殖受到阻碍。因而，在制成动物细胞用培养液时，最好压低氨基酸的总含量。
[0049]从这样的观点考虑，为了合适地提高细胞增殖效率，更优选将本实施方式的动物细胞用培养液中的必需氨基酸的含有比例设为6.5mmol/L?13mmol/L，进一步优选设为
6.Qmmol /I,?11mmol /L
[0050]细胞的呼吸中的TCA循环如图3所示，作为其构成分子，具有琥珀酰辅酶A(Succinyl CoA)、α-酮戊二酸、丙酮酸等羧酸。
[0051]根据本实施方式的动物细胞用培养液，通过在上述的浓度范围中含有必需氨基酸，与以往的动物细胞用培养液相比，使得被代谢为属于TCA循环的构成分子的羧酸的碳源的供给量增加，能够使细胞的呼吸中的氧化磷酸化活化。
[0052]而且，由此，本实施方式的动物细胞用培养液使得细胞的氧需要增加，成为可以实现与气体透过性培养容器的性能相称的细胞增殖效率的培养液。
[0053]在本实施方式的动物细胞用培养液中所含的必需氨基酸中，优选以2.3mmol/L?
6.0mmol/L的浓度含有被代谢为属于TCA循环的构成分子的琥珀酰辅酶A的氨基酸，更优选设为2.3mmol/L ?5.0mmo 1/L，进一步优选设为2.7mmol/L ?4.0mmol/L。
[0054]本实施方式的动物细胞用培养液中，通过在这样的浓度范围中含有被代谢为琥珀酰辅酶A的氨基酸，能够使细胞增殖效率特别提高。
[0055]作为被代谢为琥珀酰辅酶A的氨基酸，优选使用异亮氨酸、缬氨酸、以及蛋氨酸的至少任意一种，更优选使用它们的全部。
[0056]在本实施方式的动物细胞用培养液中所含的必需氨基酸中，通过使被代谢为属于TCA循环的构成分子的α-酮戊二酸的氨基酸的含量，也能够使细胞增殖效率提高。
[0057]作为被代谢为α-酮戊二酸的氨基酸，优选使用精氨酸、以及组氨酸的至少任意一种，更优选使用它们的全部。
[0058]在本实施方式的动物细胞用培养液中所含的必需氨基酸中，通过使被代谢为属于TCA循环的构成分子的丙酮酸的氨基酸的含量增加，也能够使细胞增殖效率提高。
[0059]作为被代谢为丙酮酸的氨基酸，优选使用半胱氨酸、苏氨酸、以及色氨酸的至少任意一种，更优选使用它们的全部。
[0060]此处，对于通过在本实施方式的动物细胞用培养液中在上述的浓度范围含有被代谢为琥珀酰辅酶A的氨基酸可以使细胞增殖效率特别提高的理由并不确定，然而可以认为反应很难推进到TCA循环中的琥珀酰辅酶A是原因之一。
[0061]S卩，由于在紧前面有2个作为TCA循环的调节酶的异柠檬酸脱氢酶(将异柠檬酸变换为α-酮戊二酸)、氧代戊二酸脱氢酶(将α-酮戊二酸变换为琥珀酰辅酶A)的调节代谢的酶，因此反应很难推进到琥珀酰辅酶Α。根据该动物细胞用培养液，可以认为，由于大量地供给被代谢为琥珀酰辅酶A的氨基酸，因此TCA循环中的容易停滞的部分的反应容易推进，从而使细胞增殖效率特别提高。
[0062]另外，可以认为，被代谢为琥珀酰辅酶A的氨基酸被作为经过TCA循环合成的物质的碳源供给也是原因之一。特别是可以认为，这些氨基酸在被代谢为琥珀酰辅酶A后，被用于氨基乙酰丙酸合成。氨基乙酰丙酸经过卟啉合成被变换为亚铁血红素，被用于电子传递系统中所必需的细胞色素c等的合成。由于电子传递系统是消耗在TCA循环中产生的NADH、生产ATP的代谢路径，因此通过强化细胞色素的合成，可以更加迅速地生产能量。此外可以认为，由于过多的NADH会阻碍TCA循环，因此通过利用电子传递系统强化来消耗NADH，整个TCA循环就会没有停滞地流动。
[0063]从这样的观点考虑，通过在本实施方式的动物细胞用培养液中，含有能够向TCA循环供给琥珀酰辅酶A的其他的各种营养素，也会使细胞增殖效率提高。
[0064]作为这样的营养素，例如可以举出上述的供给α-酮戊二酸的氨基酸，除了精氨酸、以及组氨酸以外，还可以举出谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸等。
[0065]另外，作为这样的营养素，还可以举出奇数碳脂肪酸和含有它的脂质(甘油三酯、磷脂)、酯。奇数碳脂肪酸是指碳链为奇数个的脂肪酸，可以举出丙酸、壬酸等。
[0066]使用本实施方式的动物细胞用培养液培养的动物细胞没有特别限定，然而例如可以举出人工多能性干细胞(iPS细胞)、胚性干细胞(ES细胞)、间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞、上皮细胞、肌肉细胞、心肌细胞、成骨细胞、胰岛辟田胞等。根据本实施方式的动物细胞用培养液，特别是能够合适地使来自于人的淋巴细胞等淋巴细胞、产生单克隆抗体等的杂交瘤等增殖。
[0067]使用本实施方式的动物细胞用培养液进行的细胞培养能够适用于流加培养、分批培养、以及连续培养的任意一种。
[0068]本实施方式的培养容器的特征在于，在气体透过性容器中填充有本实施方式的动物细胞用培养液。
[0069]特别是通过将本实施方式的动物细胞用培养液填充于高气体透过性培养容器中进行细胞培养，能够明显地提高细胞培养效率。
[°07°]作为这样的高气体透过性培养容器的氧透过度，优选设为6000ml/m2.day.atm以上，更优选设为7500ml/m2.day.atm以上，进一步优选设为9000ml/m2.day.atm以上。
[0071]如上说明所示，根据本实施方式的动物细胞用培养液及培养容器，可以利用给定的浓度的必需氨基酸使TCA循环活化而增加细胞的氧需要，可以充分地发挥气体透过性培养容器的性能，其结果是，能够获得与其气体透过性相称的高的细胞增殖效率。特别是，在将本实施方式的动物细胞用培养液填充于高气体透过性培养容器中使用的情况下，可以更大地发挥该效果，能够实现优异的细胞增殖效率。
[0072]另外，通过使TCA循环活化，可以抑制代谢排泄物(乳酸)的产生，还能够抑制糖(葡萄糖)的消耗。
[0073]此外，可以抑制代谢排泄物的产生和糖的消耗，其结果是，还能够减少培养中所必需的培养液的量。
[0074][实施例]
[0075]以下，对于为了确认本发明的实施方式的动物细胞用培养液及培养容器的效果而进行的实验，参照图4?图12进行说明。
[0076][实验I]
[0077]分别在以下的条件下进行了使用了填充有本实施方式的动物细胞用培养液的高气体透过性培养容器的细胞培养(实施例1)、使用了填充有本实施方式的动物细胞用培养液的通常的气体透过性培养容器的细胞培养(实施例2)、使用了填充有以往的动物细胞用培养液的高气体透过性培养容器的细胞培养(比较例I )、和使用了填充有以往的动物细胞用培养液的通常的气体透过性培养容器的细胞培养(比较例2)。
[0078](I)动物细胞用培养液
[0079]首先，作为以往的动物细胞用培养液，使用了ALyS培养基(ALyS505N_7，株式会社细胞科学研究所制)。将其氨基酸组成表示于图4的“ALyS”一栏中。ALyS培养基中的必需氨基酸的浓度为6.05mmol/L，被代谢为琥珀酰辅酶A的氨基酸的浓度为1.8mmol/L。
[0080]然后，作为本实施方式的动物细胞用培养液，使用了在ALyS培养基中以达到给定浓度的方式添加了必需氨基酸12种的培养液。将其氨基酸组成表示于图4的“+必需氨基酸”一栏中(以下，有时将本实施方式的动物细胞用培养液称作+必需氨基酸)。+必需氨基酸中的必需氨基酸的浓度为9.51mmol/L，被代谢为琥珀酰辅酶A的氨基酸的浓度为2.7mmol/L。[0081 ] (2)培养容器
[0082]作为高气体透过性培养容器，使用了图1中记载的高气体培养容器A(氧透过度9300ml/m2.day.atm)。高气体培养容器A是LLDPE(直链状低密度聚乙烯)制且尺寸为200mmX 200mm。
[0083]另外，作为通常的气体透过性培养容器，使用了同图中记载的培养容器B(氧透过度5200ml/m2.day.atm)。培养容器B是EVA(乙稀一乙酸乙稀酯共聚树脂)制且尺寸为200mmX 200mm。
[0084](3)实验方法
[0085]首先，在细胞的增殖培养之前，进行了细胞的活化培养。具体而言，在聚苯乙烯制盘子中将抗CD3抗体固相化，作为培养液使用了向ALyS培养基中添加了血清的培养液(ALyS505N-7+血清 10%)。将人末梢血单核细胞(hPBMC，Cell Applicat1ns.Inc制)296 X14ceIls与所述培养液一起播种在所述盘子中。此后，在37°C、5%C02浓度下，在培养箱中培养了妖。
[0086]然后，进行了被活化的细胞的增殖培养。具体而言，对各实施例及比较例的每一个，分别向前述的培养容器中注入经过活化的细胞和动物细胞用培养液500ml，在37 °C、5 %CO2浓度下，在培养箱中培养了 11天。
[0087]此后，在从包括活化的培养开始起72.5小时后、145.5小时后、238.5小时后、以及336.5小时后，计数出细胞数。细胞数的计数使用血球计数板进行。
[0088]另外，在培养开始时和培养期间结束时(336.5小时后)，测定出葡萄糖浓度及乳酸浓度。葡萄糖浓度的测定是使用i STAT CG8+ (扶桑药品工业株式会社制)进行，乳酸浓度的测定是使用iSTAT CG4+(扶桑药品工业株式会社制)进行。此后，算出每个单位细胞增殖(18ceIls)的葡萄糖消耗量(mg)及乳酸产生量(mg)，由此算出葡萄糖消耗率及乳酸产生率。
[0089](4)实验结果
[0090]如图5所示，在使用本实施方式的动物细胞用培养液(+必需氨基酸)的情况下，可知在高气体透过性培养容器(高气体培养容器A)中培养出的细胞数(实施例1)与在通常的气体透过性培养容器(培养容器B)中培养出的细胞数(实施例2)相比大幅度增加。
[0091]S卩，可知在使用了以往的动物细胞用培养液(ALyS)的情况下，在高气体透过性培养容器中培养出的细胞数(比较例I)、与在通常的气体透过性培养容器中培养出的细胞数(比较例2)基本上没有变化，然而通过使用本实施方式的动物细胞用培养液，可以充分地发挥高气体透过性培养容器的性能，可以进一步提高细胞的增殖效率。
[0092]图6是比较了各实施例及比较例的培养期间结束时的培养细胞数的条形图。在使用了本实施方式的动物细胞用培养液的情况下，在高气体透过性培养容器中培养出的细胞数(实施例1:141,600 X 14)与在通常的气体透过性培养容器中培养出的细胞数(实施例2:111 ,800 X 14)相比，多了将近30%。
[0093]另外，该在通常的气体透过性培养容器中培养出的细胞数(实施例2)与使用了以往的动物细胞用培养液时的在通常的气体透过性培养容器中培养出的细胞数(比较例2:91,300 X 14)相比，多了20% 以上。
[0094]即可知，通过使用本实施方式的动物细胞用培养液，可以提高借助通常的气体透过性培养容器的细胞增殖效率，可以进一步提高借助高气体透过性培养容器的细胞增殖效率。
[0095]另外，使用了本实施方式的动物细胞用培养液时的在高气体透过性培养容器中培养出的细胞数(实施例1)与使用了以往的动物细胞用培养液时的在高气体透过性培养容器中培养出的细胞数(比较例1:86,300 X 14)相比，多了60%以上。
[0096]因而可知，根据本实施方式的动物细胞用培养液，可以充分地发挥高气体透过性培养容器的性能，可以使细胞增殖效率明显增加。
[0097]此处，细胞的增殖受培养容器的气体透过度和细胞的呼吸活性(氧利用能力)的低的一方控制。
[0098]可以认为，在使用了以往的动物细胞用培养液的情况下，细胞的呼吸活性在高气体透过性培养容器及通常的气体透过性培养容器双方的气体透过度以下，因此在比较例I和比较例2中基本上没有产生差别。
[0099]另一方面可以认为，在使用了本实施方式的动物细胞用培养液的情况下，细胞的呼吸活性得到提高而超过气体透过度，其结果是，在实施例1和实施例2中细胞增殖效率提尚O
[0100]另外可以认为，对于通常的气体透过性培养容器，在使用了以往的动物细胞用培养液的情况下，低呼吸活性是细胞增殖效率的限制要因，然而通过使用本实施方式的动物细胞用培养液，细胞的呼吸活性得到提高而使培养容器的气体透过度变为细胞增殖效率的限制要因，其差别量作为从比较例2到实施例2的细胞增殖效率的提高体现出来。
[0101]另外，图7是比较了各实施例及比较例的培养期间结束时的每单位的细胞增殖量的葡萄糖消耗量(Glc消耗量(mg)/细胞增殖量(108cellS)，葡萄糖消耗率)的条形图。
[0102]在使用了本实施方式的动物细胞用培养液(+必需氨基酸)的情况下，由高气体透过性培养容器中的细胞培养造成的葡萄糖消耗率(实施例1)与由通常的气体透过性培养容器中的细胞培养造成的葡萄糖消耗率(实施例2)相比，小了将近20%。另外，实施例1的葡萄糖消耗率与使用了以往的动物细胞用培养液(ALyS)时的由高气体透过性培养容器中的细胞培养造成的葡萄糖消耗率(比较例I)相比，小了20%以上。
[0103]即可知，通过使用本实施方式的动物细胞用培养液，葡萄糖的消耗得到抑制，因此细胞的呼吸中的氧化磷酸化得到活化，细胞培养中的氧需要升高。
[0104]另外，图8是比较了各实施例及比较例的培养期间结束时的每单位的细胞增殖量的乳酸生产量(Lac产生量(mg)/细胞增殖量(18ceIls),乳酸产生率)的条形图。
[0105]在使用了本实施方式的动物细胞用培养液(+必需氨基酸)的情况下，由高气体透过性培养容器中的细胞培养造成的乳酸产生率(实施例1)与由通常的气体透过性培养容器中的细胞培养造成的乳酸产生率(实施例2)相比，小了将近20%。另外，实施例1的乳酸产生率与使用了以往的动物细胞用培养液(ALy S)时的由高气体透过性培养容器中的细胞培养造成的乳酸产生率(比较例I)相比，小了30%以上。
[0106]即可知，通过使用本实施方式的动物细胞用培养液，乳酸的产生得到抑制，因此细胞的呼吸中的氧化磷酸化得到活化，细胞培养中的氧需要升高。
[0107][实验2]
[0108]在以下的条件下进行了如下的实验，S卩，确认在本实施方式的动物细胞用培养液中所含的必需氨基酸中，增加了被代谢为TCA循环的构成分子的给定的氨基酸的含量时的细胞增殖效率。
[0109](I)动物细胞用培养液
[0110]作为以往的动物细胞用培养液，使用了与实验I相同的ALyS培养基(比较例3)。
[0111]作为本实施方式的动物细胞用培养液，使用了向ALyS培养基中与实验I相同地添加了必需氨基酸12种的培养液(+必需氨基酸，实施例3)、向ALyS培养基中添加了被代谢为琥珀酰辅酶A的必需氨基酸(异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸)的培养液(以下有时称作+琥珀酰辅酶A，实施例4)、向ALyS培养基中添加了被代谢为α-酮戊二酸的必需氨基酸(精氨酸、组氨酸)的培养液(以下有时称作+α_酮戊二酸，实施例5)、向ALyS培养基中添加了被代谢为丙酮酸的必需氨基酸(半胱氨酸、苏氨酸、色氨酸)的培养液(以下有时称作+丙酮酸，实施例6)。
[0112]将本实施方式的动物细胞用培养液(+琥珀酰辅酶Α)的氨基酸组成表示于图9的“+琥I白酰辅酶Α”的一栏中。
[0113]+琥珀酰辅酶A是将与+必需氨基酸中的添加量相同量的异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸添加到ALy S培养基中而制成。
[0114]另外，对于+α-酮戊二酸和+丙酮酸，也分别将所添加的氨基酸以与+必需氨基酸中的添加量相同量添加到ALy S培养基中而制成。
[0115](2)培养容器
[0116]作为高气体透过性培养容器，使用了图1中记载的高气体培养容器A(氧透过度9300ml/m2.day.atm)。
[0117](3)实验方法
[0118]与实验I相同地将人末梢血单核细胞(hPBMC，Cell Applicat1ns.Inc制)活化后，进行了增殖培养。但是，由于是与实验I不同的批次的细胞，因此细胞的呼吸活性(氧利用能力)与实验I不同。
[0119]此后，计数出培养期间结束时的细胞数，算出相对于培养期间开始时的细胞数而言的增殖率。
[0120](4)实验结果
[0121]如图10所示，比较例3的增殖率为346.5倍。另外，+必需氨基酸的增殖率为383.6倍(实施例3)，+琥珀酰辅酶A的增殖率为410.8倍(实施例4)，+α-酮戊二酸的增殖率为375.1倍(实施例5)，+丙酮酸的增殖率为364.5倍(实施例6)。
[0122]S卩，对于使用了本实施方式的动物细胞用培养液时的细胞增殖率的相对于比较例3而言的上升率，就+必需氨基酸而言为1.7 % (实施例3)，就+琥珀酰辅酶A而言为18.6 %(实施例4)，就+α-酮戊二酸而言为8.3% (实施例5)，就+丙酮酸而言为5.2% (实施例6)。
[0123]由该结果可知，相对于以往的动物细胞用培养液，在仅添加了必需氨基酸中的上述给定的氨基酸的情况下，也可以提高细胞增殖效率。
[0124]特别是，由添加了异亮氨酸、缬氨酸、以及蛋氨酸的+琥珀酰辅酶A造成的细胞增殖效率的上升率与+必需氨基酸相比大了70%以上。
[0125]因而可知，根据本实施方式的动物细胞用培养液(+琥珀酰辅酶Α)，可以明显地提高细胞增殖效率。
[0126][实验3]
[0127]在以下的条件下进行了用于确认由本实施方式的动物细胞用培养液(+琥珀酰辅酶Α)带来的细胞增殖效率的提高效果的实验。
[0128](I)动物细胞用培养液
[0129]作为以往的动物细胞用培养液，使用了与实验I相同的ALyS培养基(比较例4?6)。
[0130]作为本实施方式的动物细胞用培养液，使用了向ALyS培养基中与实验I相同地添加了必需氨基酸12种的培养液(+必需氨基酸，实施例7?9)、向ALyS培养基中与实验I相同地添加了作为被代谢为琥珀酰辅酶A的必需氨基酸的异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸的培养液(+琥珀酰辅酶A，实施例10?12)、向ALyS培养基中添加了实验I的2倍量的作为被代谢为琥珀酰辅酶A的必需氨基酸的异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸的培养液(以下有时称作+琥珀酰辅酶AΧ2，实施例13?15)。
[0131](2)培养容器
[0132]将实验3中所用的培养容器表示于图11中。
[0133]高气体透过性培养容器(高气体培养容器Α)是与图1中记载的容器相同的容器(氧透过度9300ml/m2.day.atm)，通常的气体透过性培养容器(培养容器B)也是与图1中记载的容器相同的容器(氧透过度5200ml/m2.day.atm)。
[0134]此外，作为高气体透过性培养容器(高气体培养容器C)，使用了氧透过度7230ml/m2.day.atm的容器。高气体培养容器C为LLDPE(直链状低密度聚乙烯)制，尺寸为200mmX200mmo
[0135](3)实验方法
[0136]与实验I相同地将人末梢血单核细胞(hPBMC，Cell Applicat1ns.Inc制)活化后，进行了增殖培养。但是，由于是与实验I不同批次的细胞，因此细胞的呼吸活性(氧利用能力)与实验I不同。另外，培养期间设为14天(336小时)。
[0137]此后，计数出培养期间结束时的细胞数，算出相对于培养期间开始时的细胞数的增殖率。
[0138](4)实验结果
[0139]如图12所示，在使用了以往的动物细胞用培养液的情况下，在高气体透过性培养容器(高气体培养容器A)、通常的气体透过性培养容器(培养容器B)、以及高气体透过性培养容器(高气体培养容器C)的每个容器中，细胞增殖率分别为880.6倍(比较例4)、790.7倍(比较例5)、853.3倍(比较例6) ο
[0140]另外，在使用了本实施方式的动物细胞用培养液(+必需氨基酸)的情况下，在高气体培养容器A、培养容器B、以及高气体培养容器C的每个容器中，细胞增殖率分别为910.7倍(实施例7)、806.4倍(实施例8)、893.7倍(实施例9)。
[0141]因而，对于使用了本实施方式的动物细胞用培养液(+必需氨基酸)时的细胞增殖率的相对于使用了以往的动物细胞用培养液时的上升率，在高气体培养容器A、培养容器B、以及高气体培养容器C的每个容器中，分别为3.4% (实施例7)、2.0%(实施例8)、4.7% (实施例9)。
[0142]另外，在使用了本实施方式的动物细胞用培养液(+琥珀酰辅酶A)的情况下，在高气体培养容器A、培养容器B、以及高气体培养容器C的每个容器中，细胞增殖率分别为917.3倍(实施例10)、773.7倍(实施例11)、899.2倍(实施例12)。
[0143 ]因而，对于使用了本实施方式的动物细胞用培养液(+琥珀酰辅酶A)时的细胞增殖率的相对于使用了以往的动物细胞用培养液时的上升率，在高气体培养容器A、培养容器B、以及高气体培养容器C的每个容器中，分别为4.2 % (实施例10 )、一 2.2 % (实施例11)、5.4 %(实施例12)。
[0144]另外，在使用了本实施方式的动物细胞用培养液(+琥珀酰辅酶AX 2)的情况下，在高气体培养容器A、培养容器B、以及高气体培养容器C的每个容器中，细胞增殖率分别为957.7倍(实施例13)、788.5倍(实施例14)、857.7倍(实施例15)。
[0145]因而，对于使用了本实施方式的动物细胞用培养液(+琥珀酰辅酶AX 2)时的细胞增殖率的相对于使用了以往的动物细胞用培养液时的上升率，在高气体培养容器A、培养容器B、以及高气体培养容器C的每个容器中，分别为8.7% (实施例13)、一0.3% (实施例14)、
0.5%(实施例15)。
[0146]此处，如前所述，细胞的增殖受培养容器的气体透过度和细胞的呼吸活性(氧利用能力)的低的一方控制，强烈地受到细胞的呼吸活性的个体差别的影响，因而可以认为，在实验3中所使用的细胞使用了以往的动物细胞用培养液的情况下，呼吸活性超过培养容器B的气体透过度。
[0147]因此可以认为，在借助培养容器B的细胞培养(实施例8、11、14)中，培养容器B的气体透过度成为细胞增殖效率的限制要因，即使使用本实施方式的动物细胞用培养液也不能进一步提高细胞的呼吸活性。
[0148]与之不同，可以认为，就高气体培养容器A和高气体培养容器C而言，与细胞的呼吸活性相比，在气体透过度方面有余力，可以进一步提高细胞的呼吸活性，其结果是，可以提高细胞增殖效率。
[0149]即可以认为，在借助高气体培养容器A的细胞培养(实施例7、10、13)、以及借助高气体培养容器C的细胞培养(实施例9、12、15)时，由于气体透过度超过细胞的呼吸活性，因此其差量作为细胞增殖效率的提高体现出来。
[0150][实验4]
[0151]继而在以下的条件下进行了用于确认由本实施方式的动物细胞用培养液(+琥珀酰辅酶A)带来的细胞增殖效率的提高效果的实验。
[0152](I)动物细胞用培养液
[0153]作为以往的动物细胞用培养液，使用了图13中所示的ALyS培养基(被代谢为琥珀酰辅酶A的必需氨基酸浓度1.8mmoI/L，比较例7)。该ALyS培养基与实验I中所用的培养基相同。
[0154]另外，作为本实施方式的动物细胞用培养液，如图14所示，使用了向ALyS培养基中与实验I相同地添加了作为被代谢为琥珀酰辅酶A的必需氨基酸的异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸的培养液(+琥珀酰辅酶A X I，被代谢为琥珀酰辅酶A的必需氨基酸浓度2.7mmol/L，实施例16)、向ALyS培养基中添加了实验16的追加量的2倍量的作为被代谢为琥珀酰辅酶A的必需氨基酸的异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸的培养液(以下称作+琥珀酰辅酶A X 2，被代谢为琥珀酰辅酶A的必需氨基酸浓度3.6mmol/L，实施例17)、向ALyS培养基中添加了实验16的追加量的4倍量的作为被代谢为琥珀酰辅酶A的必需氨基酸的异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸的培养液(以下称作+琥珀酰辅酶A X 4，被代谢为琥珀酰辅酶A的必需氨基酸浓度5.4mmol/L，实施例18)。
[0155](2)培养容器
[0156]对于培养容器，作为高气体透过性培养容器，使用了图1中记载的高气体培养容器A(氧透过度9300ml/m2.day.atm)。
[0157](3)实验方法
[0158]与实验I相同地将人末梢血单核细胞(hPBMC，Takara_b1株式会社制)活化后，进行了增殖培养。但是，由于是与实验I不同批次的细胞，因此细胞的呼吸活性(氧利用能力)与实验I不同。另外，培养期间设为12天(将活化培养设为3天，将扩增培养设为9天，合计284小时)。
[0159]此后，计数出培养期间结束时的细胞数，算出相对于培养期间开始时的细胞数而言的增殖率。
[0160](4)实验结果
[0161 ]如图15所示，比较例7的增殖率为626.7倍。另外，+琥珀酰辅酶A X I的增殖率为658.1倍(实施例16)，+琥珀酰辅酶AX2的增殖率为647.1倍(实施例17)，+琥珀酰辅酶AX4的增殖率为634.8倍(实施例18)。
[0162]S卩，对于使用了本实施方式的动物细胞用培养液时的细胞增殖率的相对于比较例7的上升率，就+琥珀酰辅酶A X I而言是5.0 % (实施例16)，就+琥珀酰辅酶A X 2而言是3.3 %(实施例17)，就+琥珀酰辅酶A X 4而言是1.3 % (实施例18)。
[0163]由该结果再次确认，根据本实施方式的动物细胞用培养液(+琥珀酰辅酶A)，可以提高细胞增殖效率。
[0164]本发明并不限定于以上的实施方式或实施例，当然可以在本发明的范围内中实施各种变更。
[0165]例如，可以使本实施方式的动物细胞用培养液中的被代谢为琥珀酰辅酶A的氨基酸的配合比例与实施例不同，或者添加被代谢为琥珀酰辅酶A的其他成分等而适当地实施变更。
[0166]产业上的可利用性
[0167]本发明在医药品的生产、或基因治疗、再生医疗、免疫细胞疗法等领域中，可以适用于使用封闭系统的培养容器大量地生产细胞的情况。
【主权项】
1.一种动物细胞用培养液，用于提高在动物细胞的呼吸中进行的TCA循环的代谢活性，其特征在于， 以2.3mmo I / L?6.0mmo I / L的浓度含有属于构成T C A循环的要素的被代谢为琥?自酰辅酶A的氨基酸作为有效成分。2.根据权利要求1所述的动物细胞用培养液，其特征在于， 所述被代谢为琥珀酰辅酶A的氨基酸为异亮氨酸、缬氨酸、以及蛋氨酸。3.根据权利要求1或2所述的动物细胞用培养液，其特征在于， 所述动物细胞为来自于人的淋巴细胞。4.一种培养容器，其特征在于， 在气体透过性容器中填充有权利要求1?3中任一项所述的动物细胞用培养液。5.根据权利要求4所述的培养容器，其特征在于， 所述气体透过性容器的氧透过度为6000ml/m2.day.atm以上。
【文档编号】C12M1/00GK106062174SQ201580011609
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2015年4月6日 公开号201580011609.1, CN 106062174 A, CN 106062174A, CN 201580011609, CN-A-106062174, CN106062174 A, CN106062174A, CN201580011609, CN201580011609.1, PCT/2015/1920, PCT/JP/15/001920, PCT/JP/15/01920, PCT/JP/2015/001920, PCT/JP/2015/01920, PCT/JP15/001920, PCT/JP15/01920, PCT/JP15001920, PCT/JP1501920, PCT/JP2015/001920, PCT/JP2015/01920, PCT/JP2015001920, PCT/JP201501920
【发明人】太田恭平, 田中乡史
【申请人】东洋制罐集团控股株式会社