鸡生长性状相关的分子标记及其鉴别方法和应用

鸡生长性状相关的分子标记及其鉴别方法和应用
【专利摘要】本发明公开一种鸡生长性状相关的分子标记及其鉴别方法和应用，涉及鸡标记辅助选择技术领域。该分子标记为如SEQ ID NO：1所示序列中的第994位碱基处C/T碱基突变。该分子标记是以鸡BMP7基因的DNA序列为模板，选择SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物进行扩增。通过对本发明C/T突变位点的检测，能知道目标鸡群相关生长性状的基因型，从而能有目的对鸡群进行选择，提高其后代鸡群体重、胫长、胫围的一致性。在育种过程中选择TT基因型的个体，可提高鸡体重、胫长、胫围等生长指标。另外，本发明所使用的鉴别方法准确性高、成本低、效率高。
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及鸡标记辅助选择技术领域，具体地说，是涉及一种鸡生长性状相关的 分子标记及其鉴别方法和应用。 鸡生长性状相关的分子标记及其鉴别方法和应用
【背景技术】
[0002] 在过去60多年，肉鸡的生长速度与产肉量有很大的提高，但伴随着生长性状的改 良也带来了一些问题，如肥胖、腹水、腿病等。腿部疾病会导致肉鸡采食量减少，生长抑制， 免疫力及胴体品质下降，生产性能较低将直接提高育种成本。增强骨强度，保持骨比例，作 为预防鸡腿部问题的一种方法，已成为当前肉鸡生产的重要目标。研究已报道，肉鸡腿部问 题受到饲养方式、遗传等方面的影响。BMP家族因具有独特的异位骨诱导活性而被发现并被 命名为骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Proteir^BMPhBMP-?做为骨形态发生蛋白 家族中的一员，主要在骨、肾组织中表达，特别在骨发育和骨折愈合过程中高表达。BMP-7具 有广泛的生物学功能。因 BMP7具有异位成骨的作用，所以它在骨骼发育过程中具有一定的 调节作用，主要表现在BMP7在体内可通过膜内成骨和软骨内化骨两种方式诱导成骨，其中 软骨内化骨为其主要成骨方式。其次，BMP7在肾脏发育中起着重要的调节作用。最后，BMP7 还与动物繁殖机能有关，参与动物卵泡发生、黄体形成以及类固醇激素合成等生殖生理调 节过程，可降低大鼠初级卵泡数目，增加成熟卵泡数目，还可刺激FSH分泌，是体内维持FSH 表达的重要生理因子。但目前从遗传的角度来说，还没有建立有关BMP7基因作为鸡生长性 状分子标记的检测方法，同时该基因作为鸡生长性状分子标记辅助选择也未见应用。

【发明内容】

[0003] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种鸡生长性状相关的 分子标记。该分子标记位于鸡BMP7基因的3'UTR上。具体来说，该分子标记位于SEQ ID NO: 1 所示序列中的第994位碱基处的C/T碱基突变。
[0004] 本发明的另一目的在于提供上述鸡生长性状相关的分子标记的鉴别方法。
[0005] 本发明的再一目的在于提供上述鸡生长性状相关的分子标记的应用。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0007] 本发明以鸡BMP7基因的DNA序列（参考序列GeneBank登录号为NC_006107.3)为模 板，寻找该基因编码区以及3'和5'UTR(非编码区）的突变位点以及相应的多态性检测方法， 通过性状关联分析的应用，为鸡的标记辅助选择提供有用的分子标记。
[0008] 以鸡BMP7基因的DNA序列为模板，设计引物扩增该基因部分序列，所用的引物为：
[0009] 正向引物BMP7-F: 5' -TCCTCTGATTGCTTTACTGACTTG-3'，
[0010] 反向引物ΒΜΡ?υ' -GGGAAGGAGGTATCATTGGAGA-3'。
[0011] 所扩增得到的序列包括部分第6内含子以及部分第7外显子，如序列表SEQID Ν0:1 所述，该序列全长为1352bp。
[0012]本发明通过对上述所获得的DNA片段进行分析，获得的片段如图1所示。发现一种 可作为鸡标记辅助选择应用的分子标记，该标记与鸡的部分生长性状有关，在该序列的第 994位碱基处存在一个C/T突变，导致EcoRI -RFLP多态性。
[0013] 一种鸡生长性状相关的分子标记，所述的分子标记为如SEQ ID NO: 1所示序列中 的第994位碱基处C/T碱基突变。
[0014] 一种鸡生长性状相关的分子标记的鉴别方法，以鸡BMP7基因的DNA序列为模板，选 择如下引物进行扩增：
[0015] 正向引物81037+:5/-丁0：1'0^^11^(：1'7^0^^(：11^-3 /，
[0016] 反向引物ΒΜΡ?υ' -GGGAAGGAGGTATCATTGGAGA-3'。
[0017]将PCR扩增所得到的产物利用EcoRI内切酶进行酶切反应，琼脂糖凝胶电泳检测酶 切产物，如果只有一条1352bp的条带，则DNA双链在该突变位点处均为T碱基，判断为TT基因 型;若有2条分别为989bp和363bp的条带，则说明DNA双链在该突变位点处均为C碱基，判断 为CC基因型;若有3条分别为1352bp、989bp和363bp的条带，则说明DNA双链在该突变位点处 一条链为T碱基，另一条链为C碱基，判断为TC基因型。
[0018] -种鸡生长性状相关的分子标记在鸡分子标记辅助选择中的应用，特别是在鸡生 长性状选择育种中的应用。
[0019] 通过本发明所提供的技术方案，还可以制备成该分子标记的鉴别试剂盒。
[0020] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0021] 通过对本发明C/T突变位点的检测，能知道目标鸡群相关生长性状的基因型，从而 能有目的对鸡群进行选择，提高其后代鸡群体重、胫长、胫围的一致性。在育种过程中选择 TT基因型的个体，可提高鸡体重、胫长、胫围等生长指标。另外，本发明所使用的鉴别方法准 确性高、成本低、效率高。
【附图说明】
[0022]图1是实施例1中鸡BMP7基因上的部分DNA序列，用来寻找分子标记的片段的电泳 图。
[0023] 图2是实施例1中鸡BMP7基因3'UTR上的EcoRI-RFLP的三种基因型（TT，TC和CC)的 电泳图谱(琼脂糖胶浓度为1.5 %)。
【具体实施方式】
[0024]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0025] 实施例1:鸡生长性状分子检测方法的建立
[0026] ( -）引物：
[0027] 以鸡BMP7基因的DNA序列（参考序列GeneBank登录号为NC_006107.3)为模板，设计 一对引物BMP7-F/BMP7-R克隆得到如序列SEQ ID NO: 1所示的DNA序列(包括部分第6内含子 和部分第7外显子），该序列全长为1352bp。所用到的引物序列分别如SEQ ID N0:2和SEQ ID NO: 3所示，具体如下：
[0028] BMP7-F:5' -TCCTCTGATTGCTTTACTGACTTG-3'，
[0029] BMP7-R:5'-GGGAAGGAGGTATCATTGGAGA-3'。
[0030](二)PCR 扩增条件：
[0031] 总体积为25yL的PCR反应体系中加入DNA模板lyL，2 X PCR反应混合物12.5yL，IOmM 引物前后各IyL，Taq DNA聚合酶0.625U，双蒸水8.25yL，PCR反应条件为:94°C预变性3min; 94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，共35个循环;最后72°C延伸10min，4°C保存。 [0032](三）寻找分子标记：
[0033]选取2只快长型岭南黄鸡A系（A03)和2只惠阳胡须鸡(H)的血液DNA做模板，进行 PCR扩增，PCR产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示。图1是鸡BMP7基因上的部分DNA 序列，用来寻找分子标记的片段的电泳图，片段大小为1352bp(琼脂糖胶浓度为1.5%)，其 中，M泳道为DNA分子量标准(DL2000)，A03-1、A03-2代表快长型岭南黄鸡A系BMP7基因 PCR扩 增片段，H-I、H-2代表惠阳胡须鸡BMP7基因 PCR扩增片段。将PCR产物回收、克隆、测序、 Cluster W比对。与惠阳胡须鸡的序列比对发现快长型岭南黄鸡A系在994处发生了碱基突 变，由C突变为T，该突变位点在BMP7基因组序列(GeneBank登录号为NC_006107.3)上的位置 是41741处。实验具体操作步骤如下：
[0034] UPCR产物的纯化:在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含有目的片段的凝胶， 放入1.5mL Ependorf f管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自Promega公司）纯化PCR产物， 按照该试剂盒说明书操作。
[0035] 2、连接反应:将纯化的PCR产物与pMD19-T Vector(购自TaKaRa公司）连接，连接反 应总体积是IOyL，其中包括2 X快速连接缓冲液，2.5yL;载体(50ng)，0.5yL;回收DNA，7~8μ L。稍微弹打混合均匀，于16 °C连接Ih以上或者4 °C连接过夜。
[0036] 3、感受态细胞的制备:从37 °C培养箱中培养了 16~20h的新鲜平板上挑取一个DH5 α单菌落接种于2mL LB中，于37°C摇床振荡培养3h，转接ImL菌液于含有300mL LB的锥形瓶 中，继续在37 °C摇床振荡培养约4h，待0D600达到0.3~0.4时将锥形瓶从摇床取出置冰浴冷 却10~15min，然后将菌液转入离心管中于4°C、4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒 置以弃净培养液，用IOmL冰预冷的0. lmol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min，重复4°C、4，OOOg 离心10min-次，用4mL冰预冷的0. lmol/L的CaCl2重悬沉淀，置4°C保存备用。
[0037] 4、转化:在灭菌的1.5mL离心管中加入IOOyL感受态细胞，于冰上加入连接产物5μ L，用移液枪吹打均匀，冰浴30min;将离心管置于42°C的循环水浴中（勿震动），热激90s后， 迅速冰浴2min;再在离心管中加入400yL LB培养液，在37°C摇床（200rpm)温浴复苏45~ 60min;离心，去除部分上清液，取IOOyL复苏后的菌液布于含Amp的平板上，涂匀;待液体充 分吸收后，倒置平皿，于37 °C培养14~16小时，观察有无菌落长出。
[0038] 5、阳性克隆子的鉴定及测序：从平板上挑取转化好的菌斑接入含400yL LB的 1.5mL离心管中并于37°C摇床振摇培养约8h左右。以此菌液为模板，选用原引物或测序的通 用引物M13(生工生物工程(上海)股份有限公司）进行PCR扩增(退火温度58~60°C)。电泳检 测，挑取阳性克隆子的菌液送去测序，序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。 [0039]在本实施方例中，PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的 PCR产物（图1 )，图1是实施例1中鸡BMP7基因上的部分DNA序列，用来寻找分子标记的片段的 电泳图，片段大小为1352bp(琼脂糖胶浓度为1 . 5% )，其中，M泳道为DNA分子量标准 (DL2000)。将PCR产物回收、纯化后克隆，测序，序列比对。结果显示所得到的DNA序列长度为 1352bp，包括部分第6内含子以及部分第7外显子序列（如序列表SEQ ID NO: 1所示）；测序结 果表明在该DNA序列的994处存在C/T碱基突变。
[0040](四）PCR-RFLP检测方法建立：
[00411 该片段994处的C/T碱基突变，恰好可以被内切酶EcoRI识别，将上述PCR产物6yL， 10 X缓冲液IyL，限制性内切酶EcoRI 0.4yL(4U)，加双蒸水补至IOyL，将样品混匀后离心， 37°C培养箱放置6h，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，成像系统观察酶切结果，记录基因型。该 基因突变位点由两个等位基因控制，其中T是没有形成酶切位点的等位基因，C是形成酶切 位点的等位基因。这两个等位基因可组成三种基因型，其中TT型为未发生酶切的纯合型（电 泳检测时只有1352bp-条DNA带），CC型为发生酶切的纯合型（电泳检测时出现989bp和 363bp两条DNA带），TC为杂合型（电泳检测时出现1352bp、989bp和363bp三条DNA带），详见图 2。图2是本发明中鸡BMP7基因3'UTR上的EcoRI-RFLP的三种基因型（TT，TC和CC)电泳图谱 (琼脂糖胶浓度为1.5% )，M泳道为DNA分子量标准(DL2000)。
[0042] 实施例2:PCR-EcoRI-RFLP多态性在各鸡种中分布情况的检测及应用 [0043] (一)PCR-EcoRI-RFLP多态性在各鸡种中分布情况的检测
[0044]本例中收集了8个品种的鸡血液DNA，样本均来自广东省农业科学院动物科学研究 所原种鸡场。按照实施例1所述的方法对以上鸡种进行了 PCR-EcoRI-RFLP检测，突变位点在 不同鸡种中的等位基因频率如表1所示，结果显示在丝羽乌骨鸡、快长型岭南黄鸡A系以及 隐性白洛克鸡种中均为T等位基因占优势，而在红色原鸡、惠阳胡须鸡以及杏花鸡种中则是 C等位基因占优势。霞烟鸡和北京油鸡两个鸡种中，T和C等位基因的比例相差不多。表1显示 8个鸡种中BMP7基因上的C/T突变位点的基因型和等位基因频率。
[0045]表1突变位点在不同鸡种中的等位基因频率
[0047] (二)鸡BMP7基因上PCR-EcoRI-RFLP分子标记在群体中的应用
[0048] 用于统计分析的试验材料包括快长型岭南黄鸡A系与惠阳胡须鸡杂交F2代总共 824个个体，所分析的性状主要为生长性状，包括8、13周的活体体重、胫围、胫长；11~12周 的料重比；13周屠宰后测定的腿骨重以及胫爪重。
[0049]
【申请人】采用SAS系统的JMP软件中（SAS Institute Inc.，Cary，NC)GLM程序进行性 状与基因型间的关联分析，并进行显著性检验，所采用模型为：
[0050] Yijkim=y+Si+Hj+Sk+Dki+Gm+eijkim
[0051] ￥^1^为性状表型值4为平均值，6"为基因型效应4、出^1为固定效应，分别为 性别、批次、父亲及父亲组内母亲效应;e ljklm为残差效应。
[0052] 基因型检测结果表明：在所检测的824只快长型岭南黄鸡A系X惠阳胡须鸡F2代个 体中，C/T突变位点TT基因型个体100个，TC基因型个体416个，CC基因型个体308个。不同基 因型与鸡群生长性状的统计结果总结于表2,表2是该C/T突变位点基因型与鸡生长性状的 统计分析表。
[0053]表2C/T突变位点基因型与鸡生长性状的统计分析表
[0056] 注:η:数量;818，13:8、13周的活体体重，单位$;308，13:8、13周的胫围，单位 :〇11; 31^8，13:8、13周的胫长，单位:〇1^〇?11-12:11~12周的料重比 ；1^:腿骨重;]\0^:胫爪重； 1 表型值是将μ+eijklm通过Johnson Su进行正态分布转化的;a'b表示Ρ〈0.05,达到显著水平。 [0057] 由表2可以看出，ΒΜΡ7基因上PCR-EcoRI-RFLP多态性与鸡的8以及13周的活体体 重、胫围、胫长，11~12周的料重比以及腿骨重，胫爪重呈极显著相关，TT基因型个体的8、13 周的活体体重、胫围以及腿骨重显著高于TC、CC基因型个体;TT基因型个体的8周以及13周 的胫长，胫爪重，显著高于CC基因型个体;但TT基因型个体的11~12周的料重比却显著低于 TC、CC基因型个体。
[0058] 本发明所述的分子标记可应用在鸡体重、胫长、胫围等性状的选择育种中。在育种 过程中选择TT基因型的个体在一定程度上能够提高鸡活体体重、胫长、胫围等指标，同时可 降低其料重比。此外，应用本发明所述的分子标记可以对鸡群体进行分子检测，选留基因型 一致的个体，进而提高群体在体重以及胫长、胫围性状的均一性，有利于制定整个群体的同 进同出程序，节约饲养成本。
[0059] 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。
[0060] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种鸡生长性状相关的分子标记，其特征在于:所述的分子标记为如SEQ ID NO: 1所 示序列中的第994位碱基处C/T碱基突变。2. 权利要求1所述的鸡生长性状相关的分子标记的鉴别方法，其特征在于:包括如下步 骤： 以鸡BMP7基因的DNA序列为模板，选择如下引物进行扩增： 正向引物BMPT-Fj' -TCCTCTGATTGCTTTACTGACTTG-3'， 反向引物BMP7-R: 5' -GGGAAGGAGGTATCATTGGAGA-3'; 将PCR扩增所得到的产物利用EcoRI内切酶进行酶切反应，检测酶切产物，如果只有一 条带，则DNA双链在该突变位点处均为T碱基，判断为TT基因型；若有2条带，则说明DNA双链 在该突变位点处均为C碱基，判断为CC基因型;若有3条带，则说明DNA双链在该突变位点处 一条链为T碱基，另一条链为C碱基，判断为TC基因型。3. -种鉴别试剂盒，其特征在于:包括权利要求1所述的鸡生长性状相关的分子标记。4. 权利要求1所述的鸡生长性状相关的分子标记在鸡分子标记辅助选择中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述的鸡生长性状相关的分子标记在鸡生 长性状选择育种中的应用。6. 权利要求3所述的鉴别试剂盒在鸡分子标记辅助选择中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述的鉴别试剂盒在鸡生长性状选择育种 中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK106086229SQ201610737626
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月26日
【发明人】王艳, 郭福有, 刘天飞, 瞿浩, 罗成龙, 舒鼎铭, 王劼
【申请人】广东省农业科学院动物科学研究所