器主体为圆柱体型、椭圆柱体型、正方体型或长方体型(本例选圆柱体型)。圆柱体型培养器直径为5-30 cm，全高高度为5-40 cm ;正方体和长方体型培养器的平面面积为20_900cm2，全高高度为 5_40cm。
[0029]顶盖的筛板封面上的微孔滤膜为0.22微米微孔滤膜，筛板封面上的筛孔孔径为l-2mm，筛孔呈行或列形排列，或呈向心圆环形排列。
[0030]顶盖上的瓶盖为带孔加微孔滤膜的瓶盖，或者为无孔、无膜实面瓶盖。
[0031]中间隔层板中的微孔滤膜的膜孔径为0.45-1.0微米；所述的压膜框为聚四氟橡胶制成的胶圈，既能压紧微孔滤膜和带孔筛板，又能紧密的将上下两室分割为相对独立的两室。带孔筛板上的筛孔呈圆环形排列(如图3中的A所示)，或者在中部的方形区域内呈行或列形平行排列(如图3中的B所示)。
[0032]体外人造皮肤的制备研宄:
[0033]首先将直径10厘米，全高度12厘米(包括上层和下层)的体外动态、三维、立体细胞组织培养器(以下简称:培养器)组装好，预先放置中间隔层板，隔层板内微孔滤膜孔径为0.45微米。上、下两层用密封圈连接、固定、密封。封闭下层两室微孔滤器连接管口。进行培养器整体灭菌(注:塑料、高分子材质可用辐射或化学试剂方法灭菌；如工业化生产产品可整批灭菌，使用时既已是无菌培养器)。
[0034]将处理好的培养器在无菌条件下，打开密封圈和上层，在中间隔层板上放置预先制备的胶原海绵膜后，再将密封圈锁紧，使上下两层连为一体。同时在下层的上、下两室微孔滤器连接管口上，连接好微孔滤器(滤膜孔径0.22微米)。
[0035]细胞组织培养；
[0036]1、首先自11下室-1注入含RPMI1640基础培养基+ 5%胎牛+ 5%马血清的完全培养基(1640完全培养基)。培养基液面与中间隔层板接触在一起，(为最底层肌细胞生长培养基)可保证人造皮肤最下层的肌细胞正常立体生长。
[0037]2、接种细胞；无菌条件下打开上层顶部瓶口瓶盖，自瓶口接种用1640完全培养基制备的含I X 15个/ ml平滑肌细胞悬液8ml，盖紧瓶盖。将培养器放入37°C、5% CO2培养箱培养。
[0038]3、换液:培养第5天自12上室-2过滤加入新1640完全培养基10ml，同时从10上室-1排出旧培养基约8ml，继续培养5天。
[0039]4、无菌条件下打开瓶盖，用光纤内窥镜观察平滑肌细胞生长状态。(可在胶原膜上长满一单层细胞)
[0040]5、接种第二层细胞；自瓶口无菌条件下接种用高糖DMEM完全培养基(DMEM基础培养基+10%胎牛血清)制备的含I X 15个/ ml成纤维细胞悬液5ml，同时从10上室-1排出旧1640完全培养基约5ml，盖紧瓶盖。
[0041]6、换液培养；置培养箱继续培养3天，自上室-2过滤加入新DMEM完全培养基10ml，同时从10上室-1排出旧培养基约10ml。继续培养3天。
[0042]7、再换液；自12上室-2过滤加入新DMEM完全培养基10ml，同时从10上室-1排出旧培养基约10ml。继续培养3天。同时自13下室-2过滤加入新DMEM完全培养基15ml，同时从11下室-1排出旧培养基约15ml。继续培养3天。
[0043]8、接种第三层细胞；自瓶口无菌条件下接种用高糖DMEM完全培养基+ I %表皮生长因子(表皮细胞生长培养基)制备的含I X 15个/ ml表皮细胞悬液5ml。同时从10上室-1排出旧培养基约5 ml ο
[0044]9、换液及循环培养；继续培养4天，自12上室-2过滤加入新表皮细胞生长培养基20ml，从上室-1排出旧培养基约10ml。同时将10上室-1和12上室-2两滤器外口用导管，形成循环。放置输液泵上，每24小时循环一次，每次I小时。循环方向自10上室-1——12上室-2循环。
[0045]循环培养；以循环培养方式连续培养3-5天，在无菌条件下自瓶口用光纤内窥镜观察组织细胞生长状态，同时也可用取样针取一小块活细胞组织进行冷冻切片，观察监测细胞组织生长发育情况。切片结果如显示三层细胞生长良好，并已形成完整的皮肤组织。打开密封圈和上层，取出人造皮肤组织，进行移植试验研宄。
【主权项】
1.一种体外动态、三维、立体细胞组织培养器，其特征在于所述的培养器包括可拆分的上层和下层两部分； 上层部分包括:顶盖，顶盖的顶面为带孔加微孔滤膜的筛板封面，在顶盖的筛板封面上设有一个瓶口装置，瓶口装置开口处安装有瓶盖； 培养器下层部分包括:培养室，培养室内壁中部设置有中间隔板支撑台，在中间隔板支撑台上加装可拆卸的中间隔层板，中间隔层板由压模框、微孔滤膜和带孔筛板组成；中间隔层板将下层部分分割成既相对独立，又能够通过微孔滤膜进行液体物质交流和沟通的上室和下室两个培养室；在下层以中间隔层板隔分的上室和下室的侧壁相对或非对称位置上，各设置有一个贯穿培养器侧壁的连接管，连接管内端在培养室内，连接管外端用于和微孔滤器、输液管以及输液泵相连，培养器下层底部为实体密闭封底； 在培养器的上层部分和下层部分二者之间以密封连接口连接为一整体。
2.根据权利要求1所述的体外动态、三维、立体细胞组织培养器，其特征在于所述的培养器主体为圆柱体型、椭圆柱体型、正方体型或长方体型。
3.根据权利要求2所述的体外动态、三维、立体细胞组织培养器，其特征在于所述的圆柱体型培养器直径为5-30 cm，全高高度为5-40 cm ;正方体和长方体型培养器的平面面积为20_900cm2，全高高度为 5_40cm。
4.根据权利要求1所述的体外动态、三维、立体细胞组织培养器，其特征在于所述顶盖的筛板封面上的微孔滤膜为0.22微米微孔滤膜，筛板封面上的筛孔孔径为l_2mm，筛孔呈行或列形排列，或呈环形排列。
5.根据权利要求1所述的体外动态、三维、立体细胞组织培养器，其特征在于所述顶盖上的瓶盖为带孔加微孔滤膜的瓶盖，或者为无孔、无膜实面瓶盖。
6.根据权利要求1所述的体外动态、三维、立体细胞组织培养器，其特征在于所述培养器上层部分外壁的下端密封接口和下层部分外壁上端密封接口二者之间，采用锁扣式密封连接方式；或者采用外扣螺旋卡圈式密封连接方式。
7.根据权利要求1所述的体外动态、三维、立体细胞组织培养器，其特征在于所述中间隔层板中的微孔滤膜的膜孔径为0.45-1.0微米；压膜框为聚四氟橡胶制成的胶圈，既能压紧微孔滤膜和带孔筛板，又能紧密的将上下两室分割为相对独立的两室。
8.根据权利要求7所述的体外动态、三维、立体细胞组织培养器，其特征在于所述带孔筛板上的筛孔呈圆环形排列，或者在中部的方形区域内呈行或列形平行排列。
9.根据权利要求1所述的体外动态、三维、立体细胞组织培养器，其特征在于所述下层部分的上室和下室的侧壁上的连接管口的外端设置有用于和微孔滤器、输液管以及输液泵连接锁紧的连接管套锁扣，以便连接和固定锁紧，同时能够对微孔滤器、输液管、输液泵进行组装和拆卸更换。
【专利摘要】用于生物、医学体外细胞组织工程研究和临床应用的体外动态、三维、立体细胞组织培养器。由上、下两部分组成，上、下两部分以密封口连接。上层顶部封盖为带孔封面加微孔滤膜结构。封盖中间有一瓶口加瓶盖结构。该瓶口在无菌条件下，也可用光纤内窥镜对培养物进行显微观察，或采集培养物活体标本，进行检测培养物的生长状态。在下层中间部位有一个由压膜框、微孔滤膜和带孔筛板构成的中间隔层板，将下层分割成相对独立的上下两室。中间隔层板上可放置预先制备的人造生物载体材料。在上下两室侧壁相对或非对称位置各有一个贯穿侧壁的连接管。连接管外端连接微孔滤器，可输入和排出无菌液体。同时可使培养液有序流动，使培养物保持在一动态环境下。
【IPC分类】C12M3-06
【公开号】CN204455135
【申请号】CN201520071509
【发明人】陈曦, 冯世庆, 牛远杰, 林平生, 周先虎, 荣宁, 陈家童
【申请人】陈曦, 冯世庆, 牛远杰
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年2月2日