专利名称：水溶性荧光菁染料的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种菁染料，特别涉及一种用于荧光探针的水溶性菁染料。
背景技术：
在后基因组时代，等待科学家们的是采用现代检测分析手段破译深藏在生物体中巨大遗传语言的生物学意义，由此对检测的精确度提出了更高的要求。由于传统同位素生物标示技术的放射性污染，现代生物分析的荧光标示技术的应用得到了迅速发展。尤其是近十几年来，激光、微处理机和电子学等一些新的科学技术的引入和飞速发展，极大地推动了荧光分析法的广泛应用，并且加速了各式各样新型荧光分析仪器的问世，使荧光分析法不断朝着高效、准确、痕量、微观和自动化的方向发展。荧光标示技术与激光技术，计算机处理技术等新技术的最新结合，为复杂的生物体系的分析研究提供了更广阔的应用空间。荧光标记法对所使用的荧光染料有一些特殊的要求，如荧光发射波长尽可能靠近红外区域以减少散射及消除背景荧光，荧光发射强度要尽可能的高，标记后荧光淬灭尽可能的减少。因此，寻找合适的荧光染料，合适的引入标记位置，方便的引入标记方法，成为一个有意义的研究课题，正吸引着越来越多的化学家和生物学家的重视。荧光标示技术的飞速发展，尤其近年来以荧光染料为标示剂的生物芯片的出现，使荧光染料在DNA自动测序、免疫分析、临床诊断、新药设计和开发中有了更加广阔的应用前景。
荧光染料的荧光性能、稳定性及水溶性是影响其在生物分析领域中应用的重要因素。Waggoner等研究了系列荧光染料Cy3TM，Cy5TM和Cy7TM(Bioconjugate Chemistry，1993，4105-111；Bioconjugate Chemistry，1996，7356-362；US Patent 5,627,027；US Patent 5,486,616)，该类染料的结构特点是在吲哚环的N原子上基至少有一个羧戊基[(CH2)5COOH]；吲哚环的5位上有磺酸根(SO3-)；且两个取代吲哚以共轭双键相连。Cy3TM，Cy5TM和Cy7TM虽然较好地解决了水溶性及荧光性的问题，但由于其分子中存在着共轭双键，导致其光稳定性较差，影响分析的可靠性。
发明内容
本发明目的在于，对Waggoner A.S.开发的系列荧光染料Cy3TM，Cy5TM和Cy7TM进行改进，即将方酸桥环引入线性共轭甲川链中，以此来提高荧光染料的光稳定性。实践证明效果良好。
本发明所说的水溶性荧光菁染料，其结构如式(1)所示 式(1)中X为S，CH2(亚甲基)或C(CH3)2；R1，R2分别选自C1～C6的烷基或(CH2)kSO3H中一种，其中k＝1～6；R3为H或C1～C6的烷基；R4为H或CH2COOH；n为1、2、或3。
在本发明中，优选的X为S或C(CH3)2；优选的R1，R2分别选自C2～C4的烷基或(CH2)kSO3H中一种，其中k＝2～4；优选的R3为H或C2～C4的烷基；优选的n为1。
本发明所述的水溶性荧光菁染料是由式(2)所示化合物与式(3)所示化合物通过方酸[其结构如式(4)所示]缩合制得。
式(2)及式(3)中R1，R2，R3，R4及X的含义与前文所述相同。具体方法(以方程形式表示)如下(1)部分中间体的合成方法
(2)部分目标化合物的合成方法
上述合成路线中所涉及的原料及试剂均为市售品。此外，对本领域普通技术人员而言，经上述合成方法的教导即可制得本发明所述其它化合物。
本发明成功地将方酸桥环引入线性共轭甲川链中，提高了所得的水溶性荧光菁染料的光稳定性。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步的说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围实施例一(2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-基)乙酸(5)的合成
i)在配有机械搅拌装置的250ml三口烧瓶中加入对氨基苯乙酸(7.55g，0.05mol)，20ml浓盐酸，25ml冰水，0℃下逐滴缓慢加入亚硝酸钠(3.45g，0.05mol)的18ml冰水溶液，保持温度0℃反应0.5小时，快速过滤除去少量沉淀。0℃下在滤液中逐滴加入二水合氯化亚锡(33.84g，0.15mol)的35ml盐酸溶液，搅拌0.5h，停止反应，冷冻过夜。次日，将反应液过滤，滤饼依次用饱和氯化钠溶液、石油醚和乙醚的混合液(2∶1)洗涤，得到粉红色固体6.5g，收率64％，产品未经提纯，直接用于下一步反应。
ii)取该粉红色固体(6.06g，0.03mol)加入到100ml三口烧瓶中，再依次加入无水醋酸钾(5.88g，0.06mol)、3-甲基-2-丁酮(4.5ml，0.042mol)、30ml乙酸，室温搅拌0.5h，再加热回流1h，冷却至室温，过滤除去不溶物，滤液旋转蒸发得到红黑色油状物。将该油状物倒入研钵中，加入20ml水研磨，析出红色固体，乙酸乙酯重结晶得到砖红色固体4.0g，产率62％，Mp.160℃，(lit.Mp.155-165℃)。GC-MSm/z217(M+)。
实施例二1-乙基-(2，3，3)-三甲基吲哚碘盐(6)的合成 在配有回流冷凝管、干燥管的25ml三口烧瓶中，氩气保护下加入2，3，3-三甲基吲哚(1.6g，0.01mol)，碘乙烷(8ml，0.1mol)，加热回流24h，冷却后加入50ml丙酮，有固体析出，过滤得到土黄色固体1.9g，粗产率60％。乙醇重结晶得到棕黄色固体，Mp.229℃(lit.Mp.226-228℃)。1HNMR(D2O)δ7.76-7.60(m，4H，4-H，5-H，6-H，7-H)，δ4.50(q，2H，J＝7.6Hz，8-H)，δ1.55(s，6H，11-H，12-H)，δ1.53(t，3H，J＝7.6Hz，9-H)。
实施例三1-(δ-磺酸丁基)-5-羧甲基-2，3，3-三甲基吲哚内铵盐(7)的合成
在配有回流冷凝管、干燥管的25ml三口烧瓶中，氩气保护下加入5-羧甲基-2，3，3-三甲基吲哚(0.65g，0.003mol)、1，4-丁磺酸内酯(1.23g，0.09mol)、2ml邻二氯苯加热至110℃，保持此温度反应5h，反应结束后冷却至60℃，加入10ml丙酮回流一小时，冷却后过滤得到褐色粉末状固体0.9g，粗产率85％，甲醇和异丙醇(1∶1.5)重结晶得紫色晶体。Mp.264-267℃(lit.Mp.287-290℃)。1HNMR(D2O)δ7.75(d，1H，J＝8.3Hz，7-H)，δ7.65(s，1H，4-H)，δ7.51(d，1H，J＝8.3Hz，6-H)，δ4.50(t，2H，J＝7.6Hz，11-H)，δ3.84(s，2H，15-H)，δ2.96(t，2H，J＝7.6Hz，8-H)，δ2.14-2.07(m，2H，10-H)，δ1.90-1.85(m，2H，9-H)，δ1.55(s，6H，13-H，14-H)。
实施例四1-(δ-磺酸丁基)-2，3，3-三甲基吲哚内铵盐(8)的合成 在配有回流冷凝管、干燥管的50ml三口烧瓶中，氩气保护下加入2，3，3-三甲基吲哚(7.95g，0.05mol)，1，4-丁磺酸内酯(20.4g，0.15mol)，10ml邻二氯苯加热至110℃，在此温度下反应8h，冷却至60℃时，加入100ml丙酮回流1h，冷却后过滤得到紫色块状固体14.5g，粗产率98％，甲醇和丙酮(1∶2)重结晶得到淡紫色晶体。Mp.240℃。1HNMR(D2O)δ7.80-7.60(m，4H，4-H，5-H，6-H，7-H)，δ4.5(t，2H，J＝7.5Hz，11-H)，δ2.95(t，2H，J＝7.6Hz，8-H)，δ2.14-2.07(m，2H，10-H)，δ1.90-1.85(m，2H，9-H)，δ1.55(s，6H，13-H，14-H)。
实施例五1-(δ-磺酸丁基)-2-甲基苯并噻唑内铵盐(9)的合成
在配有回流冷凝管、干燥管的50ml三口烧瓶中，氩气保护下加入2-甲基苯并噻唑(2.98g，0.02mol)，1，4-丁磺酸内酯(8.17g，0.06mol)，5ml邻二氯苯加热至110℃，保持此温度反应10h，反应结束后冷却至60℃，加入50ml丙酮回流一小时，冷却后过滤得到白色片状固体2.64g，粗产率47％，甲醇和丙酮(1∶2)重结晶得到无色晶体。Mp.230℃(lit.Mp.232-233℃)。1HNMR(D2O)δ8.18-7.75(m，4H，4-H，5-H，6-H，7-H)，δ4.75(t，2H，J＝7.8Hz，11-H)，δ2.97(t，2H，J＝7.6Hz，8-H)，δ2.15-2.10(m，2H，10-H)，δ1.95-1.89(m，2H，9-H)。
实施例六负电性易离去原子或基团的杂环季铵盐的合成1)3，4-二乙氧基环丁三烯-1，2-二酮(10)的合成 在配有分水器、回流冷凝管的25ml三口烧瓶中依次加入方酸(0.23g，0.002mol)、6ml乙醇、2ml苯，加热回流10h，冷却至室温，旋转蒸发除去乙醇和苯，加入乙酸乙酯振荡，静置过滤，收集滤液，旋转蒸发除掉乙酸乙酯，得到黄色油状液体。GC-MSm/z170(M+)。
2)[2-(2-乙氧基-3，4-二氧-环丁-1-烯基-甲烯基-3，3-二甲基-1-(δ-磺酸丁基)-2，3-二氢-1H-吲哚-5-基)乙酸(11)的合成 在配有冷凝管的50ml三口烧瓶中加入化合物10(1.7g，0.01mol)、15ml乙醇、2ml三乙胺，加热至70-80℃，加入化合物7(5.3g，0.015mol)，维持温度70-80℃5min，冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，加入无水乙醚振荡，静置，收集橙色固体，柱层析分离[展开剂乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸(V/V/V＝300/150/1)，Rf0.25]，得到橙色针状晶体。1HNMR(D2O)δ7.36(s，1H，4-H)，δ7.25(d，1H，J＝8.0Hz，6-H)，δ7.16(d，1H，J＝8.0Hz，7-H)，δ4.83(q，2H，J＝7.2Hz，16-H)，δ4.01(t，2H，J＝7.1Hz，11-H)，δ3.67(s，2H，15-H)，δ2.89(t，2H，J＝7.5Hz，8-H)，δ1.89-1.78(m，4H，9-H，10-H)，δ1.55(s，6H，13-H，14-H)，δ1.48(t，3H，J＝7.1Hz 17-H)。ESI-MSm/z476[M-H]。
实施例七5-羧甲基-2-{3-[5-羧甲基-3，3-二甲基-1-(δ-磺酸丁基)-1，3-二氢-吲哚-2-基-烯甲基]-2-羟基-4-氧-环丁-2-烯基-烯甲基}-3，3-二甲基-1-(δ-磺酸丁基)-3H-吲哚内铵盐(染料1)的合成 在配有干燥管和回流冷凝管的50ml三口烧瓶中，氩气保护下依次加入化合物7(0.63g，0.0018mol)、方酸(0.11g，0.001mol)、5ml吡啶、4ml甲苯，加热至回流6h，反应结束过滤反应液，取滤液旋转蒸干，加入异丙醇振荡，得到蓝绿色固体，柱层析[展开剂乙酸乙酯∶甲醇∶水(V/V/V＝4/3/1)，Rf0.4]，得到具有蓝色金属光泽的固体。IR，v(KBr，cm-1)3400，1470，1100。1HNMR(D2O)δ7.36-7.21(m，6H，4-H，6-H，7-H，4’-H，6，-H，7’-H)，δ4.10-4.02(m，4H，11-H，11’-H)，δ3.50(s，4H，15-H，15’-H)，δ2.94(t，4H，J＝7.5Hz，8-H，8’-H)，δ1.91-1.90(m，8H，9-H，10-H，9’-H，10’-H)，δ1.59(s，12H，13-H，14-H，13’-H，14’-H)。ESI-MSm/z391.1[(M-2H)/2]，402.1[(M-3H+Na)/2]。
实施例八5-丁氧酰基甲基-2-{3-[3，3-二甲基-1-(δ-磺酸丁基)-1，3-二氢-吲哚-2-基烯甲基]-2-羟基-4-氧-环丁-2-烯基烯甲基}3，3-二甲基-1-(δ-磺酸丁基)-3H-吲哚内铵盐(染料2)的合成 在配有回流冷凝管的50ml单口烧瓶中，加入化合物11(0.24g，0.0005mol)、15ml乙醇，加热至回流，回流下加入0.2ml40％氢氧化钠溶液，回流5min，冷却至室温，加入2ml2N的盐酸，旋转蒸干，得到黄褐色固体。在该固体中依次加入10ml甲苯、10ml正丁醇、化合物8(0.15g，0.0005mol)，加热至回流18h，利用分水器除去反应中生成的水。反应结束后冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，加入无水乙醚振荡，得到蓝绿色固体，柱层析分离[展开剂乙酸乙酯∶甲醇∶水(V/V/V＝10/4/1)，Rf0.3]，得到蓝色具有金属光泽的固体。IR，v(KBr，cm-1)3400，2930，1600，1570，1500，1290，1200，1110，1050。1HNMR(CD3OD)δ7.35(d，1H，J＝7.4Hz，7-H)，δ7.28(s，1H，4-H)，δ7.26(d，1H，J＝7.4Hz，6-H)，δ7.19-7.09(m，4H，4’-H，5’-H，6’-H，7’-H)，δ5.87(s，1H，12-H)，δ5.85(s，1H，12’-H)，δ4.12-4.07(m，4H，11-H，11’-H)，δ4.00(t，2H，J＝6.5Hz 16-H)，δ3.34(s，2H，15-H)，δ2.88-2.87(m，4H，8-H，8’-H)，δ1.90-1.84(m，8H，9-H，10-H，9’-H，10’-H)，δ1.63(s，12H，13-H，14-H，13’-H，14’-H)，δ1.53-1.48(m，2H，17-H)，δ1.30-1.22(m，2H，18-H)，δ0.81(t，3H，J＝7.4Hz，19-H)。ESI-MSm/z390.1[(M-2H)/2]。
实施例九5-丁氧酰基甲基-2-{2-羟基-4-氧-3-[3-(δ-磺酸丁基)-3H-苯并噻唑-2-基烯甲基]-环丁-2-烯基烯甲基}-3，3-二甲基-1-(δ-磺酸丁基)-3H-吲哚内铵盐(染料3)的合成
在配有回流冷凝管的50ml单口烧瓶中，加入化合物11(0.24g，0.0005mol)、15ml乙醇，加热至回流，回流下加入0.2ml40％氢氧化钠溶液，回流5min，冷却至室温，加入2ml2N的盐酸，旋转蒸干，得到黄褐色固体。在该固体中依次加入10ml甲苯、10ml正丁醇、化合物9(0.14g，0.0005mol)，加热至回流36h，利用分水器除去反应中生成的水。反应结束后冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，加入无水乙醚振荡，得到蓝绿色固体，柱层析分离[展开剂乙酸乙酯∶甲醇∶水(V/V/V＝10/4/1)，Rf0.35]，得到蓝色具有金属光泽的固体。IR，v(KBr，cm-1)3400，2930，1600，1500，1450，1270，1200，1130，1050。1HNMR(CD3OD)δ8.00(d，1H，J＝8.1Hz，7-H)，δ7.77(d，1H，J＝8.1Hz，6-H)，δ7.55-7.52(m，1H，7’-H)，δ7.39-7.36(m，1H，4’-H)，δ7.34(s，1H，4-H)，δ7.20-7.16(m，2H，5’-H，6’-H)，δ6.02(s，1H，12’-H)，δ5.66(s，1H，12-H)，δ4.61(t，2H，J＝5.4Hz，11-H)，δ4.4(t，2H，J＝7.0Hz，11’-H)，δ4.05(t，2H，J＝6.5Hz，16-H)，δ3.67(s，2H，15-H)，δ3.52-3.48(m，4H，8-H，8’-H)，δ1.78-1.73(m，8H，9-H，10-H，9’-H，10’-H)，δ1.64(s，6H，13-H，14-H)，δ1.58-1.53(m，2H，17-H)，δ1.36-1.28(m，2H，18-H)，δ0.87(t，3H，J＝7.0Hz，19-H)。ESI-MSm/z385.1[(M-2H)/2]。
实施例十5-丁氧酰基甲基-2-[3-(1-乙基-3，3-二甲基-1，3-二氢-吲哚-2-基烯甲基)-2-羟基-4-氧-环丁-2-烯基烯甲基]-3，3-二甲基-1-(δ-磺酸丁基)-3H-吲哚内铵盐(染料4)的合成
在配有回流冷凝管的50ml单口烧瓶中，加入化合物11(0.24g，0.0005mol)、15ml乙醇，加热至回流，回流下加入0.2ml40％氢氧化钠溶液，回流5min，冷却至室温，加入2ml2N的盐酸，旋转蒸干，得到黄褐色固体。在该固体中依次加入10ml甲苯、10ml正丁醇、化合物6(0.16g，0.0005mol)，加热至回流16h，利用分水器除去反应中生成的水。反应结束后冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，加入无水乙醚振荡，得到蓝绿色固体，柱层析分离[展开剂乙酸乙酯∶甲醇∶水(V/V/V＝28/8/1)，Rf0.4]，得到蓝色具有金属光泽的固体。IR，v(KBr，cm-1)3400，2930，1730，1600，1500，1290，1210，1110，1070。1HNMR(CD3OD)δ7.65-7.55(m，3H，4-H，6-H，7-H)，δ7.49-7.34(m，4H，4’-H，6’-H，7’-H)，δ6.15(s，2H，12-H，10’-H)，δ4.41-4.35(m，4H，11-H，8’-H)，δ4.30(t，2H，J＝6.4Hz，16-H)，δ3.89(s，2H，15-H)，δ3.10(t，2H，J＝6.9Hz，8-H)，δ2.16(m，4H，9-H，10-H)，δ1.92(s，12H，13-H，14-H，11’-H，12’-H)，δ1.82-1.76(m，2H，17-H)，δ1.59(t，3H，J＝7.1Hz，9’-H)，δ1.57-1.50(m，2H，18-H)，δ1.09(t，3H，J＝6.4Hz，19-H)。ESI-MSm/z673.3[M-H]。
实施例十一选用甲醇与水作为溶剂，方酸菁染料化合物浓度为1×10-6mol/L在TU-1800PC紫外可见分光光度计上进行测试，结果见表1。
表1方酸菁染料在甲醇和水溶液中的λmax(nm)和ε×10-5(各染料在水和甲醇中的浓度均为1×10-6mol/L)
实施例十二选用甲醇与水作为溶剂，方酸菁染料化合物浓度为1×10-6mol/L，在Varian cary eclipse荧光分光光度计上测量了化合物的荧光激发光谱和荧光发射光谱，并选用Chlorophyll B的甲醇溶液(1×10-5mol/L)为参比计算了方酸菁染料的荧光量子产率。测量结果表2。
表2方酸菁染料在甲醇和水溶液中的λmax，λExmax，λEmmax，Δs(stock位移)(nm)，Φ(各染料在水和甲醇中的浓度均为1×10-6mol/L)
权利要求
1.一种水溶性荧光菁染料，其结构如式(1)所示 式(1)中X为S，CH2或C(CH3)2；R1，R2分别选自C1～C6的烷基或(CH2)kSO3H中一种，其中k＝1～6；R3为H或C1～C6的烷基；R4为H或CH2COOH；n为1、2、或3。
2.如权利要求1所述的染料，其特征在于，其中R1，R2分别选自C2～C4的烷基或(CH2)kSO3H中一种，其中k＝2～4。
3.如权利要求2所述的染料，其特征在于，其中R1，R2分别选自CH2CH3或(CH2)4SO3H中一种。
4.如权利要求1所述的染料，其特征在于，其中R3为H或C2～C4的烷基。
5.如权利要求4所述的染料，其特征在于，其中R3为正丁基。
6.如权利要求1所述的染料，其特征在于，其中n为1。
7.如权利要求1～6所述的任意一种染料，其特征在于所述的染料为染料1、染料2、染料3或染料4。
全文摘要
本发明涉及一种用于荧光探针的水溶性菁染料。所述的菁染料由式(2)所示化合物与式(3)所示化合物通过方酸缩合制得，其结构如式(1)所示。本发明成功地将方酸桥环引入线性共轭甲川链中，提高了所得的水溶性荧光菁染料的光稳定性。式(1)中X为S，CH
文档编号C09B23/00GK1939978SQ200510030079
公开日2007年4月4日 申请日期2005年9月28日 优先权日2005年9月28日
发明者钱旭红, 徐玉芳, 朱维平, 刘艳 申请人:华东理工大学