化学发光增强剂及化学发光免疫检测试剂盒的制作方法

本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种化学发光增强剂及化学发光免疫检测试剂盒。

背景技术：

化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。化学发光免疫分析是目前世界范围内最主流的免疫检测技术，具有灵敏度高、检测范围宽、反应时间短、全自动操作、重现性好、无污染等优点，是继放免技术、酶免技术、荧光免疫技术之后发展起来的一种超高灵敏度的微量检测技术。化学发光的原理是当基态分子吸收化学反应中释放的能量跃迁到激发态，处于激发态的分子以光辐射的形式返回到基态时产生的光。化学发光免疫分析将化学发光与免疫分析方法相结合，综合了化学发光的高灵敏度和免疫分析的高选择性。

在化学发光免疫分析中，常用的发光物质包括鲁米诺、异鲁米诺、3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(缩写为AMPPD)、三联吡啶钌和吖啶类发光物质。其中，异鲁米诺、三联吡啶钌和吖啶类发光物质可作为示踪分子直接标记，属于闪光型化学发光物质。鲁米诺和AMPPD分别依靠过氧化物酶和碱性磷酸酶作为示踪分子标记，属于酶促发光型化学发光物质。吖啶类类发光物质的发光反应具有不需催化剂，只要碱性环境中就可以进行，并且发光反应迅速，背景发光低，信噪比高。发光反应干扰因素少，试剂稳定性好，化学发光体系简单，激发液成本低等优点，是理想的化学发光物质。

传统的吖啶类全自动化学发光系统主要使用过氧化氢与酸性溶液以及碱性溶液配合作为发光启动试剂，有些在发光启动试剂中加入增强剂聚乙二醇辛基 苯基醚(Triton X-100)和吐温-20(Tween 20)以增强发光，但是传统的增强剂加入后增强发光的效果并不明显。综上所述，传统的吖啶类发光物质的发光强度较弱。

技术实现要素：

基于此，有必要提供一种可以增强吖啶类发光物质的发光强度的化学发光增强剂及化学发光免疫检测试剂盒。

一种化学发光增强剂，用于增强吖啶类发光物质的发光强度，所述化学发光增强剂包括甜菜碱类化合物。

在一个实施方式中，所述甜菜碱类化合物的结构式为：

其中，R^-为阴离子基团，R₁为C₅～C₂₀的烷基酰胺基、C₅～C₂₀的烷基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₂为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₃为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基。

在一个实施方式中，所述甜菜碱类化合物的结构式为：

其中，R₁为C₅～C₂₀的烷基酰胺基、C₅～C₂₀的烷基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₂为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₃为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基。

在一个实施方式中，所述甜菜碱类化合物的结构式为：

其中，R₁为C₅～C₂₀的烷基酰胺基、C₅～C₂₀的烷基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₂为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₃为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基。

在一个实施方式中，所述甜菜碱类化合物的结构式为：

其中，R₁为C₅～C₂₀的烷基酰胺基、C₅～C₂₀的烷基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₂为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₃为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基。

在一个实施方式中，所述甜菜碱类化合物的结构式为：

其中，R₁为C₅～C₂₀的烷基酰胺基、C₅～C₂₀的烷基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₂为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₃为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基。

在一个实施方式中，所述甜菜碱类化合物的结构式为：

其中，R₁为C₅～C₂₀的烷基酰胺基、C₅～C₂₀的烷基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₂为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₃为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基。

一种化学发光免疫检测试剂盒，包括上述任一项所述的化学发光增强剂和 吖啶类发光物质。

在一个实施方式中，所述吖啶类发光物质为吖啶酯或吖啶盐。

在一个实施方式中，还包括化学发光预激发液和激发液，所述化学发光预激发液包括HNO₃和H₂O₂溶液，激发液包括NaOH溶液。

甜菜碱类化合物为具有季铵内盐结构或称作铵鎓结构的化合物，常用作渗透压调节剂、清洁剂或杀菌剂等。发明人意外发现甜菜碱类化合物具有增强吖啶类发光物质的发光强度的作用，可用于制备化学发光增强剂。实验表明，该甜菜碱类化合物可明显增强吖啶类发光物质的发光强度，并且增强的倍数高于传统的增强剂Triton X-100和Tween 20。

附图说明

图1为采用iFlash 3000全自动化学发光仪测定加入含有十四烷酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱的化学发光增强剂后吖啶酯的发光强度曲线图；

图2为采用采用iFlash 3000全自动化学发光仪测定在无增强剂和分别加入化学发光增强剂以及Architect Trigger Solution(Abbott)商品发光液条件下吖啶盐的发光强度曲线图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

一实施方式的化学发光增强剂，该化学发光增强剂包括甜菜碱类化合物，该化学发光增强剂可用于增强吖啶类发光物质的发光强度。当然，化学发光增强剂还可以包括溶解甜菜碱类化合物的溶剂或可接受的杂质等。

甜菜碱类化合物为具有季铵内盐结构或称作铵鎓结构的化合物。吖啶类发光物质是一类可用作化学发光标记物的化学物质，例如吖啶酯或吖啶盐等。

具体的，甜菜碱类化合物的结构式为：

其中，R^-为阴离子基团，R₁为C₅～C₂₀的烷基酰胺基、C₅～C₂₀的烷基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₂为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₃为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基。

R^-为阴离子基团，与季铵内盐结构配合形成甜菜碱类化合物。

在一个实施方式中，甜菜碱类化合物为化合物Ⅰ,化合物Ⅰ的结构式为：

其中，R₁为C₅～C₂₀的烷基酰胺基、C₅～C₂₀的烷基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₂为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₃为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基。即本实施方式中，-R^-为-COO^-。

另一实施方式中，甜菜碱类化合物为化合物Ⅱ,化合物Ⅱ的结构式为：

其中，R₁为C₅～C₂₀的烷基酰胺基、C₅～C₂₀的烷基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₂为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₃为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基。即本实施方式中，-R^-为

另一实施方式中，甜菜碱类化合物为化合物Ⅲ,化合物Ⅲ的结构式为：

其中，R₁为C₅～C₂₀的烷基酰胺基、C₅～C₂₀的烷基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₂为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₃为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基。即本实施方式中，-R^-为-CH₂-SO₃^-。

再一实施方式中，甜菜碱类化合物为化合物Ⅳ,化合物Ⅳ的结构式为：

其中，R₁为C₅～C₂₀的烷基酰胺基、C₅～C₂₀的烷基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₂为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₃为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基。即本实施方式中，-R^-为-CH₂-CH₂-SO₃^-。

再一实施方式中，甜菜碱类化合物为化合物Ⅴ,化合物Ⅴ的结构式为：

其中，R₁为C₅～C₂₀的烷基酰胺基、C₅～C₂₀的烷基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₂为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₃为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基。即本实施方式中，-R^-为-CH(OH)-CH₂-SO₃^-。

在本文中，为特别说明，各结构式中的C₅～C₂₀的烷基可以为直链烷基或支链烷基。C₂～C₁₀的烯基可以为直链烯基或支链烯基。C₂～C₁₀的炔基可以为直链炔基或支链炔基。C₁～C₁₀的烷基可以为直链烷基或支链烷基。C₁～C₁₀的烷氧基可以为直链烷基或支链烷基。

进一步的，R₁为C₅～C₂₀的烷基酰胺基、C₁₀～C₂₀的烷基，R₂为C₁～C₅的烷基、C₁～C₅的烷氧基、C₂～C₅的烯基或C₂～C₅的炔基。R₃为C₁～C₅的烷基、C₁～C₅的烷氧基、C₂～C₅的烯基或C₂～C₅的炔基。

具体的，烷基酰胺基是指烷基与酰胺基连接的基团，其结构式例如可以为C₅H₁₁-CONH-、C₁₁H₂₄-CONH-、C₁₃H₂₇-CONH-或C₂₀H₂₇-CONH-等。更进一步的，烷基酰胺基上的酰胺基还可以连接C₁～C₁₀的烷基，其结构式例如可以为C₁₃H₂₇-CONH-(CH₂)₃-或C₁₁H₂₄-CONH-(CH₂)₁₀-等。

具体的，R₁可以为C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉或C₂₀的烷基。R₁还可以为C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀的烯基。或者，R₁还可以为C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀的炔基。

具体的，R₂可以为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀的烷基。R₂可以为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀的烷氧基。R₂还可以为C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀的烯基。或者，R₂还可以为C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀的炔基。

具体的，R₃可以为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀的烷基。R₃可以为C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀的烷氧基。R₃还可以为C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀的烯基。或者，R₃还可以为C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀的炔基。

进一步的，R₁、R₂和R₃可以相同也可以不同。当R₁、R₂及R₃分别选自烯基或炔基时，烯基或炔基可以在相应的基团中的任意位置。

发明人意外发现甜菜碱类化合物具有增强吖啶类发光物质的发光强度的作用，可用于制备化学发光增强剂。甜菜碱类化合物具有两性表面活性剂的性质，结构简单、成分单一，批间差非常容易控制，有效减少了由于批次差异带来的化学发光增强效果的不同的影响。通过该化学发光增强剂，可有效增强吖啶类发光物质的发光强度，发光信号明显增强，而且重现性好，可广泛应用于临床诊断、科学研究、环境卫生检测等领域。进一步的，具有上述通式结构的化合物可以将吖啶类发光物质的发光强度增强至少两倍以上，增强的倍数高于传统 的增强剂Triton X-100和Tween 20。

一种化学发光免疫检测试剂盒，包括上述化学发光增强剂和吖啶类发光物质。

一般的，可将甜菜碱类化合物溶解在溶剂中制成化学发光增强剂。溶剂可以为水、酸性溶液或碱性溶液等。本实施方式中，将甜菜碱类化合物溶解在水中制成化学发光增强剂。

具体的，吖啶类发光物质可以为吖啶酯。例如NSP-DMAE-NHS吖啶酯、NSP-DMAE-HEG-NHS吖啶酯等。

一实施方式的吖啶类发光物质的化学发光反应流程式如下所示：

其中，式1所示结构表示的吖啶类化合物，式1～式6中的R可以为H、烷 基或烷基磺基等，Ar可以为含有苯基的基团。具体发光过程为：式1所示的吖啶类化合物在酸性条件下通过过氧化氢加成吖啶环的9位碳原子，得到式2所示的化合物，然后在碱性条件下生成过氧负离子，得到式3所示的化合物。之后通过分子内进攻羰基，离去基团离去，生成不稳定中间体1，2-二氧杂环丁烷酮(式6所示的化合物)，然后1,2-二氧杂环丁烷酮开环生成吖啶酮，同时释放光子。

一般的，在化学发光免疫检测试剂盒中，化学发光增强剂和吖啶类发光物质是分开放置的，使用时再混合。

本实施方式中，化学发光免疫检测试剂盒还包括化学发光预激发液和激发液，化学发光预激发液包括HNO₃和H₂O₂溶液，激发液为NaOH溶液。

具体的，HNO₃溶液的浓度为0.05mol/L～0.3mol/L，H₂O₂溶液的体积百分含量为0.1％～1％。NaOH溶液的浓度为0.05mol/L～0.5mol/L。

本实施方式中，HNO₃溶液的浓度为0.1mol/L，H₂O₂溶液的体积百分含量为0.5％。NaOH溶液的浓度为0.25mol/L。

化学发光预激发液和基础激发液作为发光的启动试剂，与化学发光增强剂配合，进一步提高啶类发光物质的发光强度。

具体的，可将化学发光增强剂加入基础激发液中制得化学激发液，从而提高啶类发光物质的发光强度。

上述化学发光免疫检测试剂盒，包括化学发光增强剂和吖啶类发光物质。将甜菜碱类化合物作为化学发光增强剂，可有效增强吖啶类发光物质的发光强度，增强的倍数高于传统的增强剂Triton X-100和Tween 20，而且重现性好。并且甜菜碱类化合物具有两性表面活性剂的性质，结构简单、成分单一，批间差非常容易控制，有效减少了由于批次差异带来的化学发光增强效果的不同的影响，提高化学发光免疫检测试剂盒检测灵敏度，该试剂盒可广泛应用于临床诊断、科学研究、环境卫生检测等领域。

以下为实施例部分。

以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常 规条件，所用实验材料甜菜碱类化合物购于河南省道纯化工技术有限公司。Tween20(sigma公司，货号V900548)和Triton X-100(sigma公司，货号V900502)。吖啶酯(NSP-DMAE-NHS)和吖啶盐(NSP-SA-NHS)采购于上海迈拓崴化工。检测化学发光的仪器为iFlash 3000全自动化学发光仪。

实施例1～实施例13

甜菜碱类化合物对吖啶类发光物质的发光强度的影响

1)配置预激发液

用超纯水配置含有HNO₃和H₂O₂的预激发液，其中HNO₃在预激发液中的终浓度为0.1mol/L，H₂O₂溶液在预激发液中的体积百分含量为0.5％。

2)配置基础激发液

用超纯水配置含有NaOH的基础激发液，NaOH在基础激发液中的终浓度为0.25mol/L。

3)配置化学激发液

向基础激发液中分别加入化学发光增强剂，化学发光增强剂分别包括甜菜碱类化合物Z1～Z13，得到化学激发液。化学发光增强剂的中各甜菜碱类化合物Z1～Z13的原浓度均为10g/L，化学发光增强剂加入量为2μL～30μL。本实施例中分别加入10μL的分别含有Z1～Z13的化学发光增强剂到基础激发液中得到化学激发液。化学发光增强剂包括的甜菜碱类化合物Z1～Z13的结构式如下：

其中，R^-为阴离子基团，具体有以下Y1～Y5四类，Y1～Y5具体结构如下：

R₁为C₅～C₂₀的烷基酰胺基、C₅～C₂₀的烷基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₂为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基，R₃为C₁～C₁₀的烷基、C₁～C₁₀的烷氧基、C₂～C₁₀的烯基或C₂～C₁₀的炔基。甜菜碱类化合物Z1～Z13对应的具体的结构如表1所示。

表1：甜菜碱类化合物Z1～Z13的名称和结构式

4)化学发光信号的测定

以10μL、浓度为1pg/mL的吖啶溶液为样品，本实施例中吖啶溶液为NSP-DMAE-HEG-NHS吖啶酯，其结构式如下：

向样品中加入100μL预激发液，再分别加入100μL各化学激发液。化学激发液中分别含有基础激发液中以及甜菜碱类化合物Z1～Z13。在化学发光检测仪上测量化学发光信号，并计算各发光液信号值与基础发光液信号值的增强倍数。实施例5对应的发光曲线如图1所示。实施例1～13的发光强度结果如表2所示。

表2：实验对照组以及实施例1～13的发光强度

其中，实验对照组除了不加化学发光增强剂，其余与实施例1～13相同。从表2可以看出，加入含有甜菜碱类化合物Z1～Z13的化学发光增强剂可以有效的增强吖啶酯的发光强度。增强倍数在4倍以上。

对比例1～对比例2

为进一步验证甜菜碱类化合物对吖啶酯的发光强度的影响。采用Tween 20和Triton X-100作为对比例。对比例中配置预激发液和配置基础激发液的步骤与实施例1～13相同。不同的是配置化学激发液时，采用分别将10μL的原浓度为10g/L的Tween 20和Triton X-100加入基础激发液中得到对比例的化学激发液。采用化学发光检测仪上测量对比例的化学发光信号，并计算各发光液信号值与基础发光液信号值的增强倍数，结果如表3所示。

表3：实验对照组以及对比例1和2的发光强度

对比表2和表3的结果可知，使用甜菜碱类化合物能起到增强吖啶类化合物化学发光作用，且增强效果优于Tween 20和Triton X-100。并且本实施例1～13的化学发光也发光信号稳定，发光效率高。

实施例14

为进一步比较甜菜碱类化合物对吖啶类化合物化学发光增强作用，选用Architect Trigger Solution(Abbott公司，货号：6C55-60)商品发光液作为对照。本实施例的样品液为10μL浓度为1pg/mL的吖啶盐(NSP-SA-NHS)溶液。预激发液和基础激发液与实施例1～13相同。将10μL的含有Z5的化学发光增强剂加到基础激发液中得到化学激发液。向样品中加入100μL预激发液，再分别加入100μL的含有增强剂Z5对应的化学激发液或100μL的Architect Trigger Solution(Abbott)商品发光液。分别测定在无增强剂、有含有Z5的化学发光增强剂以及Architect Trigger Solution(Abbott)商品发光液条件下吖啶盐的发光强度。结果如图2所示，与商品发光液Architect Trigger Solution(Abbott)发光信号进行对比。在本发明增强剂作用下，吖啶的发光信号大大增强，增强发光液性能接近Architect Trigger Solution(Abbott)。

从实施例1～14以及对比1的结果可知，甜菜碱类化合物对吖啶类化合物有很好的增强化学发光的效果，可提高诊断试剂盒的检测灵敏度。

本文中的所有数据、图像、仪器、试剂和步骤应理解为说明性而非限制性的。虽然已结合上述具体实施方案描述了本发明，许多修改和其它变化对于本领域技术人员是显而易见的。所有这种修改和其它变化也落入本发明的精神和范围内。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。