本发明涉及细胞探针技术领域，更具体的说是基于红色荧光碳纳米材料的细胞探针的合成与应用，本发明还涉及采用所述的细胞探针进行细胞成像的新方法。
背景技术：
荧光碳纳米材料具有可调的发射光谱，被认为是一种具有广泛应用前景的纳米晶体材料，现在已经合成出了具有较高光子产率的可见发射光谱荧光碳纳米材料，现已被应用于生物探针。荧光碳纳米材料作为一种新型的荧光材料，在光学和生物分析应用上显示出优异的性能。相比有机染料，荧光碳纳米材料的光化学稳定性更好，在生物体内不发生光降解从而避免了干扰作用。相比传统的量子点，荧光碳纳米材料没有潜在的生物毒性和光闪烁问题。荧光碳纳米材料具有良好的水溶性和良好的生物相容性，到目前为止，荧光碳纳米材料已经在生物标记、医药传输、生物成像和检测领域被广泛研究与应用。与短波长的光激发下获得的图像相比，在近红外激发波长下获得的图像表现出最好的信号与背景分离。总的来说，荧光碳纳米材料具有四个明显的优势:(1)激发光谱谱宽，从紫外区域一直延伸到可见光区域;(2)其荧光性质非常稳定，在经过数小时的激发光照射后，其荧光强度仍然保持不变;(3)细胞渗透能力好;(4)生物兼容性好，毒性较低。通过体内光学成像优选较长的波长，特别是近红外区域，所以碳纳米材料作为光学纳米探针用于生物成像有巨大的应用潜力。
目前，荧光碳纳米材料已经成功地应用于生物成像、药物运输、环境检测、光催化、能量转换、光电子以及传感领域。目前，荧光碳纳米材料的制备方法包括激光消融法、模板法、电化学法、水热法、和浓酸氧化有机物碳化法等等。在以上方法中，水热法因其具有较好的可控性、易于操作以及温和的反应条件而受到青睐，是一种制备荧光纳米材料的重要方法。通过调节反应温度、反应时间、原料比例以及其他相关参数，可以制备大小、成分以及表面结构可控的荧光纳米颗粒，从而使得我们能够改变其光学性质。
水溶性的荧光碳纳米材料可以更好地与生物材料结合，是现在水溶液和细胞质中直接检测，大大缩短了前期处理工作，并且可以增大荧光负载效率，使细胞成像更加清晰。近红外激发下的荧光材料较温和，对细胞的伤害小，基本可以在细胞正常的生长情况下进行成像观察。由此看来用荧光碳纳米材料代替传统的生物染料会对活细胞的成像更具有准确性和实效性，并且应用范围广，可以对几乎所有的细胞都适用。
基于以上技术，我们需要找一种廉价简单的操作方法，合成一种高效率低成本的细胞探针，所合成的探针应改操作简单、可批量生产、可用于活细胞成像的实时监测，从而实现对细胞病变的检测。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供了一种基于红色荧光碳纳米材料的细胞探针的合成与应用。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：基于红色荧光碳纳米材料的细胞探针的合成与应用，其包括以下步骤：
（1）将实验所需要的有机试剂进行蒸馏纯化；
（2）合成亲水性的红色荧光碳纳米材料；
（3）将合成的亲水性的红色荧光碳纳米材料上分别连接上聚乙二醇、精氨酸、组氨酸、葡萄糖进行功能化；
（4）将功能化的红色荧光碳纳米材料修饰上叶酸和维生素H，细胞探针合成完毕；
（5）将培养好的不同细胞分别与细胞探针混合培养，利用细胞成像仪观察细胞成像情况。
基于红色荧光碳纳米材料的细胞探针的合成与应用，其特征是，所述合成与应用包括如下步骤：
（1）将1 g抗坏血酸溶解到盛有12 mL油酰胺的三口瓶中，将溶液加热到200℃，冷凝回流4 h，然后停止反应冷却至室温，用丙酮和三氯甲烷分别洗涤有机相，得到产品1，即疏水性的红色荧光碳纳米材料；
（2）通过声波降解法将20 mg聚顺丁烯二酸酐溶解到1 mL三氯甲烷中，加入纯化的产品1，声波处理直至得到澄清的溶液，然后蒸发除去三氯甲烷，将得到的固体分散到pH为9.5的盐酸盐缓冲溶液中，磁力搅拌5 h，得到产品2，即亲水性的红色荧光碳纳米材料；
（3）分别将1 mg聚乙二醇、精氨酸、组氨酸、葡萄糖加入到产品2中，加热到40℃，冷凝回流12 h，分别得到聚乙二醇、精氨酸、组氨酸、葡萄糖功能化的亲水性红色荧光碳纳米材料；
（4）取1 mg叶酸和1 mg N-羟基丁二酰亚胺溶解到2 mL N,N’-二甲基甲酰胺中，搅拌反应2 h，得到溶液3叶酸/N-羟基丁二酰亚胺；
（5）取1 mg维生素H、1 mg N-羟基丁二酰亚胺和0.5 mg N,N’-二环己基碳二亚胺溶解到2 mL N,N’-二甲基甲酰胺中，搅拌反应2 h，得到溶液4维生素H/N-羟基丁二酰亚胺；
（6）分别取1 mL步骤（3）得到的聚乙二醇、精氨酸、组氨酸、葡萄糖功能化的疏水性红色荧光碳纳米材料，分别加入30 μL步骤（4）所得的溶液3和30 μL步骤（5）所得的溶液4的混合溶液，室温下反应5 h，离心分离得到的悬浮液，将固体分散到pH为9.0的盐酸盐缓冲溶液中，保存在4℃的冰箱中，四种细胞探针合成完毕;
（7）将培养好的不同细胞分别与四种细胞探针混合培养，30 min后，利用细胞成像仪观察细胞成像情况。
本发明的有益效果：
（1）利用红色荧光碳纳米材料以及叶酸和维生素H合成的细胞探针，具有稳定性好、生物相容性好、毒性小、适用范围广的优点；
（2）本发明所合成的细胞探针操作简单、可批量生产、可用于几乎所有细胞的细胞成像；
（3）本发明利用细胞成像仪的方法进行测定操作快速简单，反应及结果均由仪器自动完成和记录，避免了主观因素的影响，并保证有很好的重复性，便于现场检测。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细描述。
【图1】细胞探针合成过程。
具体实施方式
基于红色荧光碳纳米材料的细胞探针的合成与应用，其包括以下步骤：
（1）将实验所需要的有机试剂进行蒸馏纯化；
（2）合成亲水性的红色荧光碳纳米材料；
（3）将合成的亲水性的红色荧光碳纳米材料上分别连接上聚乙二醇、精氨酸、组氨酸、葡萄糖进行功能化；
（4）将功能化的红色荧光碳纳米材料修饰上叶酸和维生素H，细胞探针合成完毕;
（5）将培养好的不同细胞分别与细胞探针混合培养，利用细胞成像仪观察细胞成像情况。
基于红色荧光碳纳米材料的细胞探针的合成与应用，其特征是，所述合成与应用包括如下步骤：
（1）将1 g抗坏血酸溶解到盛有12 mL油酰胺的三口瓶中，将溶液加热到200℃，冷凝回流4 h，然后停止反应冷却至室温，用丙酮和三氯甲烷分别洗涤有机相，得到产品1，即疏水性的红色荧光碳纳米材料；
（2）通过声波降解法将20 mg聚顺丁烯二酸酐溶解到1 mL三氯甲烷中，加入纯化的产品1，声波处理直至得到澄清的溶液，然后蒸发除去三氯甲烷，将得到的固体分散到pH为9.5的盐酸盐缓冲溶液中，磁力搅拌5 h，得到产品2，即亲水性的红色荧光碳纳米材料；
（3）分别将1 mg聚乙二醇、精氨酸、组氨酸、葡萄糖加入到产品2中，加热到40℃，冷凝回流12 h，分别得到聚乙二醇、精氨酸、组氨酸、葡萄糖功能化的亲水性红色荧光碳纳米材料；
（4）取1 mg叶酸和1 mg N-羟基丁二酰亚胺溶解到2 mL N,N’-二甲基甲酰胺中，搅拌反应2 h，得到溶液3叶酸/N-羟基丁二酰亚胺；
（5）取1 mg维生素H、1 mg N-羟基丁二酰亚胺和0.5 mg N,N’-二环己基碳二亚胺溶解到2 mL N,N’-二甲基甲酰胺中，搅拌反应2 h，得到溶液4维生素H/N-羟基丁二酰亚胺；
（6）分别取1 mL步骤（3）得到的聚乙二醇、精氨酸、组氨酸、葡萄糖功能化的疏水性红色荧光碳纳米材料，分别加入30 μL步骤（4）所得的溶液3和30 μL步骤（5）所得的溶液4的混合溶液，室温下反应5 h，离心分离得到的悬浮液，将固体分散到pH为9.0的盐酸盐缓冲溶液中，保存在4℃的冰箱中，四种细胞探针合成完毕；
（7）将培养好的不同细胞分别与四种细胞探针混合培养，30 min后，利用细胞成像仪观察细胞成像情况。
实施例1 （Hela细胞）
（1）将实验所需要的有机试剂进行蒸馏纯化；
（2）将1 g抗坏血酸溶解到盛有12 mL油酰胺的三口瓶中，将溶液加热到200℃，冷凝回流4 h，然后停止反应冷却至室温，用丙酮和三氯甲烷分别洗涤有机相，得到产品1，即疏水性的红色荧光碳纳米材料；
（3）通过声波降解法将20 mg聚顺丁烯二酸酐溶解到1 mL三氯甲烷中，加入纯化的产品1，声波处理直至得到澄清的溶液，然后蒸发除去三氯甲烷，将得到的固体分散到pH为9.5的盐酸盐缓冲溶液中，磁力搅拌5 h，得到产品2，即亲水性的红色荧光碳纳米材料；
（4）分别将1 mg聚乙二醇、精氨酸、组氨酸、葡萄糖加入到产品2中，加热到40℃，冷凝回流12 h，分别得到聚乙二醇、精氨酸、组氨酸、葡萄糖功能化的亲水性红色荧光碳纳米材料；
（5）取1 mg叶酸和1 mg N-羟基丁二酰亚胺溶解到2 mL N,N’-二甲基甲酰胺中，搅拌反应2 h，得到溶液3叶酸/N-羟基丁二酰亚胺；
（6）取1 mg维生素H、1 mg N-羟基丁二酰亚胺和0.5 mg N,N’-二环己基碳二亚胺溶解到2 mL N,N’-二甲基甲酰胺中，搅拌反应2 h，得到溶液4维生素H/N-羟基丁二酰亚胺；
（7）分别取1 mL步骤（3）得到的聚乙二醇、精氨酸、组氨酸、葡萄糖功能化的疏水性红色荧光碳纳米材料，分别加入30 μL步骤（4）所得的溶液3和30 μL步骤（5）所得的溶液4的混合溶液，室温下反应5 h，离心分离得到的悬浮液，将固体分散到pH为9.0的盐酸盐缓冲溶液中，保存在4℃的冰箱中，四种细胞探针合成完毕；
（8）将培养好的Hela细胞分别与四种细胞探针混合培养，30 min后，利用细胞成像仪进行观察细胞成像情况。
实施例2 （MCF-7细胞）
合成步骤同实施例1，不同的是（8）将培养好的MCF-7细胞分别与四种细胞探针混合培养，30 min后，利用细胞成像仪进行观察细胞成像情况。
实施例3 （K-562细胞）
合成步骤同实施例1，不同的是（8）将培养好的K-562细胞分别与四种细胞探针混合培养，30 min后，利用细胞成像仪进行观察细胞成像情况。
实施例4 （HepG2细胞）
合成步骤同实施例1，不同的是（8）将培养好的HepG2细胞分别与四种细胞探针混合培养，30 min后，利用细胞成像仪进行观察细胞成像情况。