一株可降解石油烃的滕黄单胞菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株可降解石油烃的滕黄单胞菌及其应用。海连滕黄单胞菌（Luteimonas dalianensis）OB44-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年1月18日，保藏编号CGMCC N0.7165。本发明的海连滕黄单胞菌OB44-3是滕黄单胞菌属的新菌种，分离自石油污染的海洋环境，能够有效降解石油烃并利用石油作为生长的唯一碳源。在人工海水培养基中，7天内对石油烃（初始浓度为1000mg/L）的平均降解率为69.08%；同时该菌株的生长依赖于盐的存在，属于海洋细菌，对控制海洋环境中石油烃污染有独特的优势。本发明的海连滕黄单胞菌OB44-3可用于石油烃的降解。
CGMCC No7165
20130118
【专利说明】一株可降解石油烃的滕黄单胞菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株可降解石油烃的滕黄单胞菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 石油是重要的能源物质，在开采、运输、加工等过程中均可能产生对环境的污染， 石油中含有的烃类物质统称为石油烃，主要包括烷烃、环烷烃、芳香烃等，有些成分可致癌、 致突变、致畸形，并通过食物链在动植物及人体内富集，被列为重点污染物。由于石油烃属 于生物难降解性物质，因此，石油污染已成为一个严重的环境问题，引起许多国家高度重 视。
[0003] 存在于海洋环境中的天然微生物种群对石油烃的降解作用是石油烃和其他烃类 污染物从海洋环境中消除的基本途径之一。微生物利用生物自我调节机制以及对污染物的 综合净化功能处理海洋中的石油烃类污染物，使它们在生物的新陈代谢过程中得到较为彻 底的转化和降解，最终生成CO 2和水，不会产生二次污染，是目前公认的处理海洋石油污染 最环保的方法。
[0004] 近年来，国内外有关微生物降解石油烃的研究逐渐增多。据统计已经发现能够降 解石油的微生物超过了 200多种，在海洋环境石油烃降解占主导地位的微生物主要包括： 无色杆菌属（Achromobacter )、不动杆菌属（Acinetobacter )、产喊杆菌属（Alcaligenes)、 芽抱杆菌属（Bacillus)、黄杆菌属（Flavobacterium)、棒杆菌属（Coryneforms)、微杆 菌属（Microbacterium)、放线菌属（Actinomycetes)、诺卡氏菌属（Nocardia)、假单胞 菌属（Pseudomonas)、食烧菌属（Alcanirorax)、解环菌属（Cycloclasticus)、海杆菌 属（Marinobacter)、海细菌属（Marinobacterium)、油螺旋菌属（Oleispira)、海旋菌属 (Thalassospira)和微球菌属（Mirococcus)等。海洋中能降解石油经的真菌有金色担子菌 属（Aureobasidium)、红酵母菌（Rhodotorula)等，还有很多霉菌也可降解石油经，如青霉 素（Penicillium)、曲霉属（Apergillus)等。目前对降解微生物资源的研究已成为一个新 的重要方向，越来越多的石油降解微生物被发现，国际上已建成了专门的降解微生物菌群 资源库。分离筛选对石油烃具有降解能力的菌株，是研究微生物降解石油机理及对石油烃 污染环境进行生物修复的基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株可降解石油烃的滕黄单胞菌。
[0006] 本发明所提供的滕黄单胞菌是从大连湾潮间带原油污染的海水样品中筛选到的。 根据其形态特征、培养特性、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析等证实属于滕黄单胞 菌属（Luteimonas)新种，命名为海连滕黄单胞菌（Luteimonas dalianensis)0B44_3。海连 滕黄单胞菌（Luteimonas dalianensis)0B44_3已于2013年1月18日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCN0. 7165。
[0007] 海连滕黄单胞菌（Luteimonas dalianensis)0B44-3CGMCC NO. 7165为革兰氏阴性 菌，细胞呈杆状，无鞭毛，没有运动性，大小为（1.02?1.24) μ mX (0.32?0.47) μ m。在 LB培养基上培养3天，该菌株的菌落呈小圆形、光滑、隆起、淡金黄色、半透明、边缘整齐等 特征。
[0008] 海连滕黄单胞菌（Luteimonas dalianensis) 0B44-3CGMCC NO. 7165 属于好氧菌， 可生长的pH范围为6. 0?8. 0,最适生长pH值为7. 2 ;可生长温度范围为15?37°C，最适 生长温度为30°C ;该菌株属于海洋微生物，生长需要NaCl的存在，能在2?9%(w/v)盐度 范围内生长，最适生长盐度为4%。
[0009] 海连滕黄单胞菌（Luteimonas dalianensis)0B44_3CGMCC NO. 7165接触酶和氧化 酶阳性，β -半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶和色氨酸脱 氨酶阴性；该菌株的柠檬酸盐利用阳性，七叶灵水解、吲哚产生、V.P.反应、明胶液化和硝 酸盐还原阴性。该菌株能利用糖原、L-阿拉伯糖、D-果糖、D-阿洛酮糖、丙酮酸甲酯、甲酸、 b_羟基丁酸、a-氧代丁酸、a-氧代戊酸、L-丙氨酰胺、D-丙氨酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘 氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-丝氨酸和肌苷作为唯一碳源和能源。
[0010] 海连滕黄单胞菌（Luteimonas dalianensis) 0B44-3CGMCC NO. 7165 细胞中 的脂肪酸主要包括异式十五碳饱和脂肪酸（27. 99%)、c〇9c异式一十七碳单不饱和脂 肪酸（14. 86%)、反异式十五碳饱和脂肪酸（12. 41%)、异式十六碳饱和脂肪酸（10. 01%)、 异式十七碳饱和脂肪酸（8. 30%)、异式^ 碳饱和脂肪酸（5. 99%)、十六碳饱和脂肪酸 (4. 36%)、3_羟基异式十三碳饱和脂肪酸（3. 05%)、3_羟基异式i^一碳饱和脂肪酸（2. 77%)、 ω 7c-十六碳单不饱和脂肪酸/ ω 6c-十六碳单不饱和脂肪酸（2. 01%)、3_羟基十六碳饱和 脂肪酸（1. 08%)、反异式十一碳饱和脂肪酸（1. 06%)和异式十四碳饱和脂肪酸（1. 01%)。
[0011] 海连滕黄单胞菌（Luteimonas dalianensis)0B44_3CGMCC NO. 7165 的 G+C 摩尔百 分含量为64. 65% ;该菌株的16S rRNA基因序列如序列表中序列1所示，与已发表的滕黄单 胞菌属的模式菌 Luteimonas marina KCTC12327T、L. Iutimaris KAccHgsgl^PILuteimonas aestuarii KCTC22048T 的 16S rRNA 基因序列的同源性为 96. 0%。
[0012] 海连滕黄单胞菌（Luteimonas dalianensis) 0B44-3CGMCC NO. 7165 与上述模式 菌株Luteimonas aestuarii KCTC22048T DNA杂交的同源性比较低，为14%;同时，该菌株 的生理生化特性、细胞壁脂肪酸组成也与上述模式菌株有明显差异，说明海连滕黄单胞菌 (Luteimonas dalianensis) 0B44-3 CGMCC NO. 7165 是滕黄单胞菌属的一个新菌种。
[0013] 本发明的另一个目的是提供一种降解石油烃的方法。
[0014] 本发明所提供的降解石油烃的方法，是用所述海连滕黄单胞菌（Luteimonas dalianensis) 0B44-3CGMCC NO. 7165对待测样品进行处理，使石油烃得到降解。
[0015] 上述方法中，其特征在于所述的应用为：以2216E为基础培养基，对海连腾黄单胞 菌0B44-3菌种进行扩大培养，以培养获得的菌液为石油降解菌剂，加入到以原油为唯一碳 源和能源的人工海水培养基中，使海水培养基中的原油得到降解。
[0016] 以海连滕黄单胞菌（Luteimonas dalianensis)0B44_3CGMCC NO. 7165为活性成分 制备的生物制剂也属于本发明的保护范围。
[0017] 本发明的海连滕黄单胞菌（Luteimonas dalianensis) 0B44-3CGMCCN0· 7165 是 滕黄单胞菌属的新菌种，分离自石油污染的海洋环境，能够有效降解石油烃并利用石油烃 作为生长的唯一碳源。在人工海水培养基中，7天内对石油烃(初始浓度为lOOOmg/L)的 平均降解率为69. 08% ;同时该菌株的生长依赖于盐的存在，属于海洋细菌类，对控制海洋 环境中石油经污染有独特的优势。本发明的海连滕黄单胞菌（Luteimonas dalianensis) 0B44-3CGMCC NO. 7165可用于石油烃的降解。
[0018] 下面结合说明书附图和【具体实施方式】对本发明作进一步说明，并非对本发明的限 制。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图 1 为海连滕黄单胞菌（Luteimonas dalianensis) 0B44-3CGMCCN0. 7165 在扫描 电子显微镜下的形态照片
[0020] 图 2 为海连滕黄单胞菌（Luteimonas dalianensis) 0B44-3CGMCCN0· 7165 在透射 电子显微镜下的形态照片
[0021] 图 3 为海连滕黄单胞菌（Luteimonas dalianensis) 0B44-3CGMCCN0. 7165 的 16S rRNA基因序列系统发育树分析图
[0022] 图 4 为海连滕黄单胞菌（Luteimonas dalianensis) 0B44-3CGMCCN0· 7165 对石油 烃的降解曲线图
【具体实施方式】
[0023] 下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材 料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0024] 实施例 1 海连滕黄单胞菌（Luteimonas dalianensis) 0B44-3CGMCCN0· 7165 的分 离及鉴定
[0025] 一、降解石油烃菌株的分离
[0026] 分离培养基：（1)人工海水培养基（ASM) =MgSO4 · 7Η207· Og/L，KC10. 7g/L， ΚΗ2Ρ042· 0g/L，Na2HP043. 0g/L，NH4NO3L 0g/L，NaC130g/L，Crude oillg/L，ΡΗ7· 2 ;微量元素 溶液 10mL。微量元素组成为：CaCl2 20mg/L，FeCl350mg/L，CuSO4O. 5mg/L，MnCl2. 4H200.5mg/ L，ZnSO4. 7H2010mg/L。（2)固体平板分离培养基（ASMl):上述人工海水培养基加18g/L琼 脂；（3)固体平板纯化培养基：2216E (Difco)。
[0027] 将石油溶于石油醚中，配制成浓度为100mg/mL的石油溶液。
[0028] 将采自大连湾石油污染海域海水样品5mL，加入到灭菌的含IOOmL人工海水培养 基ASM的500mL摇瓶中，以石油（浓度0. 5?lg/L)为唯一碳源进行富集培养，置于28°C， 200r/min摇床中培养，做为第一次富集培养液，7天后，取5mL的第一次富集培养液转接入 新鲜的人工海水培养基中，再进行富集培养，做为第二次富集培养液，7天后，取第二次富集 培养液5mL，转接入新鲜的人工海水培养基中，转接3次。将最终的富集培养液进行ΚΓ 1、 10_2、10_3梯度稀释，涂布固体平板分离培养基ASMl上；以不加原油的人工海水培养基为 空白对照平板，28°C培养7?10天，挑取单菌落于2216E纯化平板，划线分离单菌，得到纯 化的单菌落。挑取纯化后的单菌落接种在装有5mL液体培养基的2216E试管中，将试管置 于200r/min振荡培养箱中，28°C振荡培养72h左右，取200 μ L菌液加入含I. 8mL20%甘油 水溶液的冻存管中，_70°C放置保存备用。
[0029] 结果表明，空白对照平板上没有任何菌落生长，说明没有外加石油作为碳源的平 板上，海水样本中的微生物无法生长；相应的，在加有石油的平板上有菌株能够生长，说明 这些单菌落对应的菌株能够降解石油烃并以石油烃为唯一碳源生长。挑取能够降解石油烃 的单菌落0B44-3作进一步研究。
[0030] 二、菌株的形态特征
[0031] 将上述步骤一分离得到的菌株0B44-3接种到2216E培养基中，当细胞生长至对数 生长后期，菌落大小稳定后，进行单菌落平均状态的描述。主要包括菌落的大小、颜色、透明 度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规 贝IJ、放射状等)。
[0032] 将处于对数生长期的细胞，采用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察细胞形 态，结果如图1和图2所示；同时进行革兰氏染色，于40X 100倍的光学显微镜下观察菌体 细胞的形态。
[0033] 结果表明，上述步骤一筛选到的菌株菌落直径为1. 5?2mm，呈小圆形、光滑、隆 起、黄色、有光泽、半透明、边缘整齐；在电子显微镜下观察，菌体细胞呈杆状、无鞭毛，没有 运动性，大小为（1. 02 ?1. 24) μ mX (0· 32 ?0· 47) μ m。
[0034] 二、菌株的生长特性
[0035] 上述步骤一筛选到的菌株属于革兰氏阴性、好氧细菌。该菌株最适生长pH值是 7. 2,可生长pH范围是6. 0?8. 0 ;最适生长温度为30°C，可生长的温度范围为15?37°C。 该菌株属于海洋细菌，生长依赖于盐的存在，能在2. 0?9. 0 (w/v)盐度范围内生长繁殖， 最适生长盐度4%。
[0036] 四、菌株的生化特征
[0037] 1、碳源利用
[0038] 利用Biolog微生物自动鉴定系统测试菌株对95种碳源的利用情况。先将待测菌 株的纯培养菌落制成细胞悬液，然后接种于GN2鉴定板上培养，再用Biolog Microstation 软件读取数据，确定碳源利用情况。
[0039] 2、其它生化特征
[0040] 该菌株的接触酶、氧化酶、β -半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨 酸脱羧酶、脲酶和色氨酸脱氨酶活性利用ΑΡΙ20Ε生化试剂盒检测；菌株的柠檬酸盐利用、 七叶灵水解、吲哚产生、V. Ρ.反应、明胶液化和硝酸盐还原反应利用ΑΡΙ20ΝΕ生化试剂盒检 测。
[0041] 以上实验结果表明，上述步骤一筛选到的菌株能利用95种碳源中的L-阿拉伯糖、 D-果糖、D-阿洛酮糖、糖原、丙酮酸甲酯、甲酸、b-羟基丁酸、a-氧代丁酸、a-氧代戊酸、 L-丙氨酰胺、D-丙氨酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-丝氨酸和 肌苷作为唯一碳源和能源。该菌株的接触酶和氧化酶阳性，β_半乳糖苷酶、精氨酸双水解 酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶和色氨酸脱氨酶阴性；该菌株的柠檬酸盐利用阳性， 七叶灵水解、吲哚产生、V.P.反应、明胶液化和硝酸盐还原阴性。
[0042] 五、与滕黄单胞菌属模式菌株生理生化特征比较
[0043] 将上述步骤一筛选到的菌株生理生化特征与滕黄单胞菌属模式菌株 (L.aestuarii KCTC22048T、L. marina KCTC12327T、L. Iutimaris KACC14929T)的生理生化 特征相比较，结果见表1所示。
[0044] 表1筛选到的菌株与滕黄单胞菌属模式菌株的生理生化特征比较
[0045]
【权利要求】
1?海连滕黄单胞菌（Luteimonas dalianensis)0B44-3,保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年1月18日，保藏登记号为CGMCC NO. 7165。
2. 如权利要求1所述的海连滕黄单胞菌0B44-3,其特征在于所述海连滕黄单胞菌 0B44-3菌落特征和生理生化特性为：杆状，大小为0. 3?0. 4 ii mX 1. 0?1. 2 ii m，革兰氏染 色为阴性，在LB固体培养基30°C培养2?3天后，菌落呈淡金黄色，小圆形，边缘整齐，表面 光滑，易挑起；接触酶和氧化酶阳性，V.P.反应阴性，淀粉水解阴性，柠檬酸盐利用阳性，硝 酸盐还原阴性，七叶灵水解阴性，明胶液化阴性。
3. 如权利要求1所述的海连滕黄单胞菌0B44-3,其特征在于所述海连滕黄单胞菌 0B44-3 的 16S rRNA 序列为： TGGCGGCAGGCCTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCGCGGGGAGCTTGCTCCCTGGCGGCGAGTGGCGGACG GGTGAGGAATGCATCGGAATCTGCCCATTTGTGGGGGATAACCTCGGGAAACCGGGACTAATACCGCATACGACCTT CGGGTGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCAGATGGATGAGCCGATGCCGGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAAG GCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCC TACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGGGTGAAGAAGGCC TTCGGGTTGTAAAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAAACTTTCCGGTTAATACCCGGAGAGAATGACGGTACCCAAAGAA TAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATTACTGGGCGTAA AGGGTGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTGGATACTGGCGGG CTAGAGTGCGGTAGAGGGTAGTGGAATTCCCGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATCGGGAGGAACATCCGTGGCG AAGGCGACTGCCTGGACCAGCACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGT CCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCAACTAGGCACTCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCC GCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTT AATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGG AACTCGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA CCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACCGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGG ATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTACTACAATGGGGAGGACAGAGGGCTGCGAACC CGCGAGGGCAAGCCAATCCCAGAAACCTCCTCCCAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAAT CGCTAGTAATCGCAGAT CAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGG GAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGGGGACGGTACCACGGTGATTC 〇
4. 如权利要求1?3所述的海连腾黄单胞菌0B44-3在降解海洋环境石油烃污染中的 应用。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的应用为：以2216E为种子培养基，对 海连腾黄单胞菌0B44-3菌种进行培养，将菌种接种到种子培养基2216E中培养获得菌悬 液，菌悬液以〇. 5?2 X 106个细胞/mL培养基的接种量接种到种子培养基中，30°C、转速为 200r/min培养48h，得菌液，以培养获得的菌液为石油降解菌剂，加入到含原油0. 5?lg/L 的海水样品或以原油为唯一碳源的人工海水培养基(ASM)中，使海水培养基中的原油得到 降解。
6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于所述人工海水培养基（ASM)各组分终浓度为： MgS04 ? 7H207. Og/L, KC10. 7g/L, KH2P042. Og/L, Na2HP043. Og/L, NH4N031. Og/L, NaC130g/L, Crude oillg/L，PH7. 2 ;微量元素溶液 10mL。微量元素组成为：CaCl220mg/L，FeCl350mg/L， CuS040. 5mg/L, MnCl2. 4H200. 5mg/L, ZnS04. 7H2010mg/L〇
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用按如下步骤进行： (1) 将5?10g原油溶于5?10mL石油醚中，过滤除菌，加入到含lOOmL人工海水培养 基(ASM) 500mL摇瓶中，使原油在培养基中的终浓度为0. 5?lg/L。 (2) 将海连腾黄单胞菌0B44-3种子接种到2216E培养基，30°C、转速为200r/min培养 24h，得菌液，将获得的菌液按接种量为5%体积比，加入到上述人工海水培养基(ASM)中，在 30°C、转速为200r/min的好氧避光条件下培养7天。同时，以不加石油的人工海水培养基 作为对照，以不接种海连腾黄单胞菌0B44-3的人工海水作为空白对照，用于扣除石油挥发 的影响。
【文档编号】C02F3/34GK104371941SQ201310357439
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月15日 优先权日:2013年8月15日
【发明者】薛松, 信艳娟, 曹旭鹏, 吴佩春 申请人:中国科学院大连化学物理研究所