专利名称：选择结合性物质固定化纤维和含有该纤维束的纤维排列体以及选择结合反应方法、用于 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及将与被测物质选择性结合的物质(本说明书中称为“选择结合性物质”)固定的纤维和含有该纤维束的纤维排列体，以及选择结合性物质、与其选择性结合的对应选择结合性物质的结合反应方法，用于其的装置及基材。
背景技术：
从各种生物遗传信息解析的研究开始，以人体基因为主，涉及多个基因及其碱基序列、基因序列编码的蛋白质以及由这些蛋白质二维地制备的糖链的信息正在快速地明晰。对于序列明确的基因、蛋白质、糖链等高分子的功能，可以用各种方法进行研究。主要对于核酸，利用Northern杂交或者Southern杂交等各种核酸/核酸间的互补性，可以研究各种基因与其生物功能表达的关系。对于蛋白质，可以利用免疫杂交代表的蛋白质/蛋白质间的反应研究蛋白质的功能和表达。
近年来，作为一次解析多个基因表达的方法，开发了被称为DNA微阵列法(DNA芯片法)的新型分析法以及方法论，引人注目。这些方法均是以核酸/核酸间杂交反应为基础的核酸检测、定量方法，在这方面原理上与以往的方法相同，也可用于以蛋白质/蛋白质间或糖链/糖链间或者糖链/蛋白质间的结合反应为基础的蛋白质或糖链的检测、定量。这些技术的最大特征在于，使用在称为微阵列或芯片的平面基板片上高密度地排列固定多个DNA片断、蛋白质或糖链而得到的物质。作为微阵列法的具体使用方法，例如，用荧光色素等标记研究对象细胞的表达基因等，使得到的试样在平面基板片上杂交，使互补的核酸(DNA或RNA)之间结合，用荧光色素等标记该部位后，用高分辨度解析装置高速读取的方法，或者检测以电化学反应为基础的电流值等的应答的方法。这样，可以迅速推测出试样中所含的基因种类。
作为用于将核酸固定在基板上的技术，除了与上述Northern印迹法相同，在尼龙片材等上高密度地进行固定的方法以外，为了进一步提高密度，开发出了在玻璃等基板上包覆聚-L-赖氨酸、氨基硅烷(アミノシラン)等进行固定的方法等。
但是，已经指出在对玻璃等固体表面进行化学或物理修饰得到的基板上点样固定核酸的方法，点密度和每点可以固定的核酸量少，再现困难。而且，由于昂贵的制造装置和多步的制造步骤，因而每个芯片大幅降低成本是很困难的。另外，核酸的区别不得不依赖于其在基板上点样的位置，在基板上的配置和区别方面存在缺乏简便性的问题。
关于使用蛋白质或糖链的微阵列，也存在这些与使用核酸的微阵列相同的问题。
作为不使用平面基板的方法，已知利用微小珠粒的方法，在区别固定了各种核酸、蛋白质或糖链的多种微小珠粒的技术方面，还不完全，难以制作使指定化合物以指定的排列标准、再现性良好地排列而成的物质。
另一方面，也尝试在中空纤维中固定核酸(欧洲公开专利1162262)。该技术通过在一根中空纤维中固定某种核酸，形成1个核酸1个纤维的对应关系，从而进行各种核酸的区别。但是，该技术最终束缚中空纤维，根据其位置关系识别各核酸，在这点上，不能克服在基板上点样核酸的技术中存在的问题。
另外，核酸/核酸间杂交中使用的核酸溶液昂贵，因而希望尽可能地减少核酸的量进行杂交反应，因此，考虑降低核酸溶液的核酸浓度，在与低浓度的核酸溶液进行杂交时，作为用于提高效率的方法，进行了下述尝试，即在上述微阵列的基板上设置具有导电体层的标本核酸固定部位，在该标本核酸固定部位外加正电位，形成电场，将上述核酸溶液中的检体核酸集中在上述标本核酸固定部位附近，局部提高标本核酸固定部位附近的核酸浓度，从而提高杂交效率(特开平8-154656号公报)。
对于使用蛋白质或糖链的微阵列，也期待与这些使用核酸的微阵列相同的效果。
但是，采用这些公知方法不能达到提高测定灵敏度和缩短杂交时间的效果，因此需要一种更有效的杂交方法。
发明公开在这种状况下，在认为将来更加重要的高分子体解析中，强烈要求确立一种新型体系的方法论，能够以给定的浓度固定高分子体，能够以可测定的形式，高密度、再现性良好地进行排列，而且可以不依赖于位置排列识别各高分子体，能够适用于廉价的大量制造，这也是本发明所要解决的课题。
具体地说，本发明所要解决的课题在于，提供一种方法，该方法与在尼龙片材或玻璃基板等二维载体上微量点样或微量分注的高分子体排列体制造法相比，可以不依赖于位置关系区别识别各试样，可以组合任意的排列体，另外可以根据使用方法自由变化密度，且能够简便地检测出简单结合的试样与其他试样的反应。
而且，在认为将来更加重要的高分子体解析中，强烈要求确立一种选择结合反应的方法，可以有效利用少量贵重的核酸、蛋白、糖链、抗体、抗原等高分子体试样，这也是本发明所要解决的课题。
具体地说，在以往使用的平面基板片上，在高密度地排列固定了多个DNA片断、蛋白质或糖链等选择结合性物质的微阵列中；或者将多孔性中空纤维内部固定了上述选择结合性物质的该多孔性中空纤维集束固定，沿与排列体的纤维轴交叉的方向切成薄片，作为将上述选择结合性物质体固定在纤维内部的二维高密度纤维排列体的微阵列中；或者在纤维表面高密度地排列固定上述选择结合性物质，将该纤维作为三维结构体排列而成的维阵列等中，杂交反应依赖于选择结合性物质的自然扩散，使用含有少量选择结合性物质的溶液，高效率地引起杂交反应，有效利用贵重的选择结合性物质比较困难，即使是为解决这种效率低下而发明的通过电吸引使选择结合性物质的杂交反应效率化的方法中，效率化也不充分。
因此，本发明的目的在于消除上述说明的以前的缺点，提供一种有效利用少量选择结合性物质进行选择结合反应的结合反应方法以及用于该方法的装置和基材。
本发明人为了解决如上所述的课题，进行了悉心研究，结果发现改变在同一个二维载体上进行选择结合性物质排列步骤和固定步骤的以往方法的想法，可以制作这样一种纤维束，即在作为一维结构体的能够通过支撑体、磁、条形码、颜色、形状等进行区别的纤维上(1根纤维上)独立地进行高分子体的固定步骤，能够区别结合了各试样的纤维，而不依赖于作为三维结构体的位置。
而且，还发现通过将光透过性基材或电传导性基材用于该纤维，可以制作一种纤维或该纤维排列体，其能够检测出直接与该纤维固定的选择结合性物质反应的物质，从而完成了本发明。
也就是说，本发明提供一种纤维排列体，其含有固定了选择结合性物质的纤维或该纤维的束。
而且，本发明人为了解决如上所述的课题，进行了悉心研究，结果发现在杂交反应期间，通过使对应选择结合性物质在微阵列基板或者纤维上固定的上述选择结合性物质附近移动，提高上述选择结合性物质与上述对应选择结合性物质的碰撞概率，可以提高杂交反应的效率，从而完成了本发明。
也就是说，本发明提供一种选择结合性物质与对应选择结合性物质的结合反应方法，在基材上固定选择结合性物质，使含有与上述选择结合性物质选择性结合的对应选择结合性物质的被测试样液同上述固定化选择结合性物质接触，使上述选择结合性物质与上述对应选择结合性物质发生结合反应的步骤中，相对于固定上述选择结合性物质的面，使上述被测试样液和/或上述对应选择结合性物质相对移动。另外，本发明还提供一种选择结合反应装置，是在基材上固定选择结合性物质，使含有与上述选择结合性物质选择性结合的对应选择结合性物质的被测试样液同上述固定化选择结合性物质接触，使上述选择结合性物质与上述对应选择结合性物质发生结合反应的装置，具有设置上述基材的基台；在与固定了上述选择结合性物质的面的垂直轴交叉的方向上，且在上述选择结合性物质固定区域两端的外侧设置的导电电极；在该导电电极间外加交流电压的交流电压外加装置。而且，本发明还提供一种选择结合性物质固定化基材，是在基材上固定选择结合性物质，使含有与上述选择结合性物质选择性结合的对应选择结合性物质的被测试样液同上述固定化选择结合性物质接触，使上述选择结合性物质与上述对应选择结合性物质发生结合反应的上述基材，具有固定基材上的选择结合性物质的选择结合性物质固定用部位，以及在选择结合性物质固定用区域两端的外侧设置的导电电极。
根据本发明，提供固定了选择结合性物质的纤维以及固定了选择结合性物质的纤维排列体。根据本发明，可以提供有效、且再现性良好地固定了选择结合性物质的纤维，同时通过组合这些纤维形成纤维排列体，可以再现性良好、有效地得到选择结合性物质任意高密度且正确地排列的选择结合性物质固定化纤维排列体。而且，通过使用光纤，可以简便地检测出通过纤维效率良好地结合的试样。另外，通过标记各纤维，可以不依赖于排列体中的位置鉴定结合了被测物质的各纤维。
另外，通过本发明的选择结合反应方法、用于其中的装置和基材，提高了选择结合反应的效率，即使是被测试样中的对应选择结合性物质浓度低的场合，也可以在短时间内完成选择结合反应步骤。
图1是本发明的选择结合反应装置的断面示意图和平面示意图。
图2是表示本发明的选择结合反应方法中选择结合性物质的行为的原理图。
图3是以往的杂交装置的断面示意图。
图4是表示以往的杂交装置中选择结合性物质的行为的原理图。
图5是实施例5中使用的测定装置的光学系统部分的示意图。
发明的最佳实施方式在本说明书和权利要求书中，“选择结合性物质”是指能够与被测物质直接或间接选择性结合的物质，作为代表性的实例，可以例举核酸、蛋白质、糖类和其他抗原性化合物。核酸可以是DNA，也可以是RNA。具有特定碱基序列的单链核酸选择性地与具有和该碱基序列或其一部分互补的碱基序列的单链核酸杂交、结合，因此属于本发明所说的“选择结合性物质”。另外，作为蛋白质，可以例举抗体和Fab片断或F(ab’)2片断等抗体的抗原结合性片断，以及各种抗原。抗体或其抗原结合性片断与对应的抗原选择性结合，抗原与对应的抗体选择性结合，因此属于“选择结合性物质”。作为糖类，优选多糖类，可以例举各种抗原。另外，也可以固定蛋白质和糖类以外的具有抗原性的物质。作为“选择结合性物质”，特别优选的物质是核酸、抗体和抗原。本发明中使用的选择结合性物质可以是市售的物质，也可以是由活细胞等得到的物质。另外，“对应选择结合性物质”是指与上述选择结合性物质选择性结合的物质，例如，在选择结合性物质是单链核酸的场合，是具有与该单链核酸互补的碱基序列的单链核酸，在选择结合性物质是抗体或其抗原结合性片断的场合，是与其进行抗原抗体反应的抗原或半抗原。
本发明中，作为能够用于固定选择结合性物质的纤维，可以例举合成纤维、半合成纤维、再生纤维、无机纤维等化学纤维、天然纤维以及这些纤维的复合纤维等。
作为合成纤维的代表性实例，例如尼龙6、尼龙66、芳香族聚酰胺等聚酰胺类各种纤维，聚对苯二甲酸乙二酯、聚对苯二甲酸丁二酯、聚乳酸、聚乙醇酸等聚酯类各种纤维，聚丙烯腈等丙烯酸类各种纤维，聚乙烯或聚丙烯等聚烯烃类各种纤维，聚乙烯醇类各种纤维，聚偏二氯乙烯类各种纤维，聚氯乙烯类纤维，聚氨酯类各种纤维，酚类纤维，聚偏二氟乙烯或聚四氟乙烯等构成的氟类纤维，聚亚烷基对氧基苯甲酸酯类各种纤维等。另外，也可以使用衣料用纤维以外的纤维，例如以聚甲基丙烯酸甲酯或聚苯乙烯等透明非晶性高分子为主材料的光学纤维等。特别优选芯由聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯等材料构成，包层是由折射率比其低的材料构成的塑料光纤。可以是所谓芯皮型光纤，也可以是折射率分布型光纤。而且，也可以对塑料光纤进行包覆。作为包覆材料，没有特别的限定，可以使用聚乙烯、PVC、尿烷、氟树脂等热塑性树脂或各种橡胶管等。
作为半合成纤维的代表性实例，例如以二乙酸酯、三乙酸酯、壳多糖、壳聚糖等为原料的纤维素系衍生物类各种纤维、被称为普罗米克斯的蛋白质类各种纤维等。作为再生纤维的代表性实例，可以例举通过粘胶人造丝工艺、铜-氨法或有机溶剂法得到的纤维素类各种再生纤维(人造丝、铜氨纤维、波里诺西克等)等。
作为无机纤维的代表性实例，例如玻璃纤维、碳纤维、Au、Ag、Cu、Al等金属纤维等。特别优选光透过性的玻璃制光纤。与塑料制光纤的场合相同，可以是所谓的芯皮型光纤，也可以是折射率分布型光纤。另外，也可以对玻璃制光纤进行包覆。而且，也可以是玻璃和塑料的复合类光纤。
作为天然纤维的代表性实例，例如棉、亚麻、麻、黄麻等植物纤维，羊毛、绢等动物纤维，石棉等矿物纤维等。本发明中使用的纤维并没有特别规定其形态。另外，可以是单丝，也可以是复丝。而且，也可以是将短纤维纺织得到的纺丝。另外，使用复丝或纺丝的纤维的场合，也可以在固定选择结合性物质时，利用单纤维间的空隙等。
本发明中使用的纤维可以以未处理的状态直接使用，但根据需要，也可以是引入了反应性官能团的纤维，另外，也可以是进行了等离子体处理、γ射线、电子束等放射线处理的纤维。在这些纤维上固定选择结合性物质的场合，可以利用纤维和选择结合性物质之间的各种化学或物理性相互作用，即纤维具有的官能团和选择结合性物质之间的化学或物理性相互作用，通过公知方法实现。
固定相同的选择结合性物质的场合，可以一次集中处理若干根纤维。固定位置可以是纤维整体，但为了减少检体试样的量，优选是纤维的端部区域。端部区域可以是纤维的端面和/或端面附近的侧面。为了区别固定了不同选择结合性物质的纤维，可以通过在支撑体上固定纤维区别固定了不同试样的纤维。该支撑体可以各个独立，也可以各个结合。或者，也可以使用改变了形状的纤维。
也可以使纤维带有颜色，根据该颜色的波长区别不同试样的纤维。也可以采用通过检测向纤维外释放的光，或者使光在纤维中通过并将通过纤维的光导向光检测器进行区别的方法。
也可以使用记录了特殊文字记号的纤维进行区别。例如，在纤维上或纤维中记录条形码等，通过读取该条形码区别试样不同的纤维。
也可以使纤维含有金属、碳、导电性聚合物等导电性材料或磁性材料，或者使用溅射、蒸镀法、电镀、CVD等方法在纤维表面涂覆金属等材料，使之具有导电性。可以使用上述方法，在纤维的表面涂覆元素周期表3A族至5B族的第2周期至第4周期所含的材料或其混合物。这样，可以利用电或磁区别试样不同的纤维。
本发明中使用的纤维优选细的纤维。本发明优选的实施方式中，一根纤维的粗度最好为1mm以下。对于单丝，例如市售鱼线的场合，为50～900μm粗的丝。而且，根据最近的纺丝技术，可以制造1dtex(聚对苯二甲酸乙二酯的场合，直径约为8μm)的单丝，也可以制造更细的纤维(极细纤维或超极细纤维)(直径1～10μm)。使用光纤的场合，也优选光纤为3～1000μm。更希望为50～1000μm，特别是从操作性等观点出发，希望为50～500μm的塑料制光纤、玻璃制光纤、玻璃和树脂的复合光纤。另外，也优选使用将2～50μm那样细的光纤集成束得到的所谓导象管。在一个一个这样的导象管上固定不同的选择结合性物质，再将导象管汇集，从而可以进行测定。而且，用光检测结合状态的场合，通过使用该导象管，可以使聚束的光在光纤内部不发散，有效地将检测光送到试样处。导象管所含的光纤数优选为2～50000根。如果多于50000根，则导象管的外径过粗，有时在操作上产生困难。
上述纤维中，使用光纤时，作为在后面详细说明的被测物质上附加的标记，通过使用荧光标记等发光或生成色素的标记，通过穿过光纤在另一端侧发出的光可以测定被测物质的结合，此时，由于可以检测出哪一个纤维发光，因此优选，对于装置的自动化，也是有利的。另外，使用导电性纤维的场合，作为电信号可以在纤维的另一端侧测定被测物质的结合，此时，也可以检测出被测物质与哪一个纤维结合，因此优选，对于装置的自动化也是有利的。而且，如果使用导电性纤维，通过外加电场、电流等方法，也可以促进结合。特别是，在促进核酸的杂交时，优选实质上使固定核酸的纤维为阳极。另外，对于阴极的设置，只要不与纤维直接接触即可，没有特别的限定。外加的电场的种类特别优选直流，但作为实质上纤维为阳极的条件，也可以为交流。也就是说，即使外加交流电场的场合，可以是对纤维外加正电压和负电压的时间使正电压的变大，或者交流的正电压和负电压的绝对值使正电压的变大，或者通过它们的组合使纤维实质上成为阳极。外加电压的大小没有特别的限定，优选0.1V以上5000V以下。外加电压如果小于0.1V，则有时不能充分得到外加电压的效果，如果大于5000V，则操作变得困难。外加电压时，对于是否流过电流，没有特别的限定。如果设置阴极使之不与反应溶液接触，则不流过电流，但如果设置阴极使之与反应溶液接触，则电流通过溶液流过。流过电流时，其大小优选1～2000mA。
另一方面，如上所述，本发明还提供一种选择结合性物质与对应选择结合性物质的结合反应方法，在基材上固定选择结合性物质，使含有与上述选择结合性物质选择性结合的对应选择结合性物质的被测试样液同上述固定化选择结合性物质接触，使上述选择结合性物质与上述对应选择结合性物质发生结合反应的步骤中，相对于固定了上述选择结合性物质的面，使上述被测试样液和/或上述对应选择结合性物质相对移动。其中，“相对移动”是指从横向观察固定了上述选择结合性物质的面时，对应选择结合性物质相对于该固定面相对移动。
另外，在该结合反应方法中，也优选使用上述选择结合性物质固定化纤维或纤维排列体，但不是必须的，也可以适用于以往的使用微阵列或微板等的方法。
作为使对应选择性结合物质在微阵列基板或纤维等上固定的选择结合性物质附近移动，提高选择结合性物质与对应选择结合物质的碰撞概率的方法，可以考虑下述方法，形成电场，使带电荷的选择结合性物质移动的方法；形成用于使被测试样液在选择结合性物质固定化基材上流动的流路，使用微泵使被测试样液移动的方法；使被测试样液具有磁性流体那样的功能，通过来自外部的物理力使被测试样液摇动的方法；或者使选择结合性物质固定化基材摇动的方法等。
其中，优选结构最简单且具有提高碰撞概率效果的外加电场法，特别优选外加交流电场法。一般地，核酸在水溶液中带负电。另外，蛋白质和多糖类等高分子在水溶液中多数情况下也带电。因此，通过对反应液外加电场，可以使对应选择结合性物质移动。特别是，通过外加交流电场，可以使对应选择结合性物质往复运动，可以有效地提高与选择结合性物质的碰撞概率。
因此，作为上述本发明的结合反应方法的优选方式，本发明还提供一种选择结合性物质与对应选择结合性物质的结合反应方法，在基材上固定选择结合性物质，使含有与上述选择结合性物质选择性结合的对应选择结合性物质的被测试样液同上述固定化选择结合性物质接触，使上述选择结合性物质与上述对应选择结合性物质发生结合反应的步骤中，在与固定了选择结合性物质的面的垂直轴交叉的方向上，且在上述选择结合性物质固定化区域两端的外侧设置的导电电极之间外加交流电压，同时进行上述结合反应。
其中，固定了选择结合性物质的面的垂直轴例如是在后述图1(a)中用虚线A表示的轴，是指相对于固定了选择结合性物质的面垂直的方向。另外，与该垂直轴交叉的方向例如如后述图2用左右箭头表示的方向所示，是从侧面观察固定了选择结合性物质的面时，与上述垂直轴交叉的方向。另外，该“与垂直轴交叉的方向”如图2所示，优选与垂直轴正交的方向，但不是必须正交，从侧面观察选择结合性物质固定化面时，以最短距离连接对峙的电极间的线和与垂直轴正交的方向所成的角度优选为45度以下，更优选为30度以下的场合，也可以得到优良的效果。
外加电压的大小没有特别的限定，但如果过小，外加电场得到的效果变小，另一方面，如果过大，则恐怕损伤选择结合性物质和/或对应选择结合性物质，因此，导电电极间隔每1cm，优选为约5V至50V，特别优选约10V至25V。另外，交流的频率没有特别的限定，优选约1Hz至100Hz，特别优选约5Hz至20Hz。
上述选择结合性物质固定化部位可以只有1个(例如微板的1个孔等)，选择结合性物质固定化部位存在多个，存在将其排列而成的选择结合性物质排列区域(例如后述图1(a)中参考编号8所示的区域)时，可以同时并列进行多种测定，因此优选，此时，上述导电电极优选设置在该选择结合性物质排列区域两端的外侧。
上述本发明的通过外加电场法进行的结合反应方法可以使用下述装置进行，即具有设置上述基材的基台；在与固定了上述选择结合性物质的面的垂直轴交叉的方向上，且在上述选择结合性物质固定化区域两端的外侧设置的导电电极；在该导电电极间外加交流电压的交流电压外加手段的选择结合反应装置，或者具有固定基材上选择结合性物质的选择结合性物质固定用部位以及在选择结合性物质固定用区域两端的外侧设置的导电电极的选择结合性物质固定化基材。另外，在“选择结合性物质固定用部位”固定选择结合性物质，该固定也可以在使用前由终端用户进行，或者基材的制造者也可以制造、销售预先固定了用于特定试验的选择结合性物质的产品。
另外，在本发明的选择结合反应方法和选择结合反应装置中，作为能够用于上述导电电极的材料，可以例举铂、金、银、铬、钛、镍、铝、铜、钯等金属单质，或者这些金属的氧化物、氮化物或它们的合金、碳或碳化合物、或者导电性聚合物等，可以含有选自其中的至少一种。
作为金属单质或这些金属的氧化物、氮化物或它们的合金的特性，由于在使用这些材料设置的导电电极之间外加交流电压，从而通过含有上述对应选择结合性物质的被测试样液，在上述导电电极间流过电流，因此希望是与被测试样液反应，难以在被测试样液中溶出金属离子的材料。
作为碳化合物的代表性实例，例如石墨、フラ-レン等。
作为导电性聚合物的代表例，例如聚乙炔、聚吡咯、ポリチオフィン、聚苯胺等，也可以例举将这些导电性聚合物与上述金属、碳化合物等混和，改善了导电特性的复合导电性塑料等。
由于后述的理由，希望预先在选择结合性物质固定化基材上形成导电电极，但也可以是在结合反应装置侧具有导电电极，在结合反应准备阶段在选择结合性物质固定化基材上安装导电电极的形态。
作为使用这些材料在基材上设置电极的手段，使用金属作为电极材料的场合，可以在基材上设置具有导电电极形状的开口的掩膜，通过溅射法、蒸镀法形成导电电极，或者使用电镀法形成厚膜的导电电极，再用粘结剂在基材上粘结金属箔或金属薄板形成导电电极。使用碳化合物的场合，可以在基材上设置具有导电电极形状的开口的掩膜，使用溅射法形成电极。使用导电性聚合物的场合，可以使用丝网印刷等印刷法，涂覆糊状导电性聚合物，通过利用紫外线进行光固化的方法，使糊固化，形成导电电极。
另外，在选择结合反应装置侧具有导电电极的场合，在选择结合反应装置的基台上部具有使用上述金属材料、碳化合物、导电性聚合物制造的薄板状电极板，在基台状担载选择结合性物质固定化基材后，在选择结合性物质固定化基材上安装该电极板，从而可以形成导电电极。
下面使用
本发明的一个实施方式。本发明的选择结合反应装置的一个实施方式的侧视图如图1(a)所示，平面图如图1(b)所示。另外，本发明并不只限于这一实例。在图1、图2中，具有选择结合性物质排列基材1，导电电极2、3，盖板5和交流电压外加手段6。在设置于选择结合性物质排列基材1上的选择结合性物质固定用部位4上固定选择结合性物质10，形成选择结合性物质10阵列状排列的选择结合性物质排列区域8。在载置于基台9上的选择结合性物质排列基材1上，在选择结合性物质排列区域8的两侧设置导电电极2、3，在该导电电极2、3上架设盖板5。通过上述导电电极2、3，在选择结合性物质排列基材1和盖板5夹持的空间填满含有上述对应选择结合性物质11的被测试样溶液7。
在上述选择结合性物质排列区域8上选择结合性物质10排列的形态，希望排列在二维平面的格点上，但偏离二维平面格点的位置、直线状、或者选择结合性物质固定用部位4的位置在与选择结合性物质排列基材1表面垂直的方向上分别具有位差，从而也可以是三维的排列形态。
充满被测试样溶液7后，使用交流电压外加手段6，在导电电极2、3之间外加电压。由此，在导电电极2、3之间产生电场，在被测试样溶液7中自然扩散的对应选择结合性物质11具有负电荷，因而根据导电电极2、3之间产生的电场的方向，在横切上述选择结合性物质排列区域8的方向上反复移动。具体地说，导电电极2为正电位、导电电极3为负电位的场合，上述对应选择结合性物质11靠近导电电极2，导电电极2为负电位、导电电极3为正电位的场合，上述对应选择结合性物质11靠近导电电极3。这样，在对应选择结合性物质11横切上述选择结合性物质排列区域8进行移动的过程中，选择结合性物质固定用部位4上固定的选择结合性物质10与对应选择结合性物质11接触，相互具有互补序列的场合，发生杂交。
另外，外加在导电电极上的电压越高，具有负电荷的选择结合性物质7和对应选择结合性物质11由导电电极受到的电吸引力或电排斥力增强，对应选择结合性物质11移动引起的与选择结合性物质7的接触的效果升高，这是不言而喻的，但如果长时间外加高电压，则选择结合性物质7和对应选择结合性物质11受到损伤，因此在本实施方式中，导电电极间隔每1cm，设定为5V至50V之间，为了得到稳定的杂交结果，更优选导电电极间隔每1cm，为10V至25V。
如上所述，在本发明的通过交流电场实现选择结合反应的效率化的方法中，选择结合性物质10与对应选择结合性物质11发生结合反应的期间，经常相对移动，反复进行碰撞、接触，因而结合反应的效率提高。
其中，作为选择结合性物质固定用部位，通常使用基板上设置的平面上的位置或者基板上的一部分区域、基板上设置的凹部或凸部，也可以在贯穿选择结合性物质排列基材1的孔中插入棒状的树脂、玻璃、金属、纤维等，使用该树脂、玻璃、金属、纤维的前端作为选择结合性物质固定用部位。特别是，如果使用上述本发明的纤维或纤维束的端面作为选择结合性物质固定用部位，如上所述，可以得到能够在纤维的另一端部侧进行检测等优点，因而优选。
另外，为了减少贵重的被测试样溶液7的量，希望上述导电电极2、3尽可能地薄，更希望为5μm至200μm。为了形成这样非常薄且很少出现厚度不均的电极，希望预先在选择结合性物质排列基材上形成上述导电电极，也可以是在结合反应装置侧具有导电电极，在结合反应准备阶段，在选择结合性物质排列基材1上安装导电电极的方式。
另外，在以往的方法中，杂交反应依赖于选择结合性物质的自然扩散，因而上述选择结合性物质10与对应选择结合性物质11的接触概率低，因此杂交反应的效率低。而且，为了消除该无效率性，如图3、图4所示，即使在针对利用电吸引使选择结合性物质的杂交反应效率化的方法中，效率化也不充分。
对于以往利用电吸引使杂交效率化的方法，使用图3、图4进行说明。在设置于选择结合性物质排列基材12上的选择结合性物质固定用部位15上，固定选择结合性物质10。在选择结合性物质排列基材12上排列了选择结合性物质10的区域的外侧，设置支撑材料13，在支撑材料13上架设盖板14。通过上述支撑材料13，在选择结合性物质排列基材12和盖板14夹持的空间充满含有对应选择结合性物质11的被测试样溶液18。充满被测试样溶液18后，使用电压外加手段17，在电极16上外加负电位，在具有有导电性的层的选择结合性物质固定部位15上外加正电位，从而在电极16和选择结合性物质固定部位15之间产生电场，在被测试样溶液18中自然扩散的对应选择结合性物质11具有负电荷，因而被吸引至上述选择结合性物质固定部位15。由此，选择结合性物质固定部位15周围的对应选择结合性物质11的浓度增高，或者对应选择结合性物质1吸附在选择结合性物质固定部位15上的过程中，选择结合性物质10与对应选择结合性物质11接触，发生杂交。
但是，在图3所示的方法中，对应选择结合性物质11通过电力被吸附在选择结合性物质固定部位15上，而且，与对应选择结合性物质11同样具有负电荷的选择结合性物质10也被吸附在选择结合性物质固定部位15的表面，在选择结合性物质10和对应选择结合性物质11之间，相对的移动减少，因此，与本发明相比，选择结合性物质10与对应选择结合性物质11的动态接触概率低。
本发明中，作为用作选择结合性物质或对应选择结合性物质的DNA或RNA，可以是由活细胞制备的，也可以是化学合成的。由活细胞制备DNA或RNA可以通过公知的方法，例如对于DNA的提取，可以通过Blin等的方法(Blin等人，Nucleic Acids Res.32303(1976))等，另外，对于RNA的提取，通过Favaloro等的方法(Favaloro等人，Methods Enzymol.65718(1980))等进行。作为固定的核酸，还可以使用链状或环状的质粒DNA或染色体DNA、用限制酶或化学地将它们切断得到的DNA片断、在试管内用酶等合成的DNA、或者化学合成的低聚核苷酸等。
在1根纤维或各选择结合性物质固定用部位上，通常固定1种选择结合性物质，但例如欲使具有变异的多种基因结合在同一固定用部位区域的场合等，也可以在1根纤维或1个固定用部位上固定多种选择结合性物质。
另外，在多个纤维或多个选择结合性物质固定用部位上固定的选择结合性物质，可以是分别不同种类的选择结合性物质，也可以是相同的选择结合性物质。另外，在多个纤维或多个选择结合性物质固定用部位中，可以在一部分纤维或选择结合性物质固定用部位上固定1种选择结合性物质，在另外部分的多个纤维或选择结合性物质固定用部位上固定另外一种选择结合性物质。选择结合性物质的种类、顺序不受纤维排列体中纤维位置的限定。在多个纤维或选择结合性物质固定用部位上固定相同的选择结合性物质，对进一步提高测定灵敏度也是有效的。
选择结合性物质在支撑体纤维上或者在选择结合性物质固定用部位上的固定，可以通过公知方法进行。在纤维或选择结合性物质固定用部位上固定未修饰的选择结合性物质的场合，可以使选择结合性物质与纤维或选择结合性物质固定用部位发生作用后，通过烘焙或照射紫外线进行固定。在后述的实施例中，采用该方法，将DNA固定在聚甲基丙烯酸甲酯光纤纤维或聚甲基丙烯酸甲酯基材上。另外，将用氨基修饰的选择结合性物质固定在纤维上的场合，可以使用戊二醛或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)等交联剂，使之与纤维的官能团结合。使含有选择结合性物质的试样与纤维发生作用时的温度优选5℃～95℃，更优选15℃～65℃。处理时间通常为5分钟～24小时，优选1小时以上。
本发明中，可以将选择结合性物质直接固定在纤维或选择结合性物质固定用部位上，另外，也可以固定对选择结合性物质进行了化学修饰得到的衍生物或根据需要使之改性的核酸。核酸的化学修饰，已知氨基化、生物素化、地高辛配基化等[Current Protocols InMolecular Biology，Ed，；Frederick M.Ausubel等人(1990)、脱同位素试验方案(1)DIG杂交(秀润社)]，本发明中，可以采用这些修饰法。作为一个实例，对在核酸中引入氨基进行说明。具有氨基的脂肪族烃链与单链核酸的结合位置没有特别的限定，不仅可以是核酸的5’末端或3’末端，也可以是核酸链的中间部位(例如磷酸二酯结合部位或碱基部位)。该单链核酸衍生物可以按照特公平3-74239号公报、美国专利4667025号、美国专利4789737号等记载的方法进行制备。除该方法以外，例如可以使用市售的氨基引入用试剂[如アミノリンクII(商品名)，PEバイオシステムズジヤパン社；AminoModifiers(商品名)，クロンテツク社]等，或者按照在DNA 5’末端的磷酸上引入具有氨基的脂肪族烃链的公知方法(Nucleic Acids Res.，11(18)，6513-(1983))进行制备。
采用上述方法得到的选择结合性物质固定化纤维或选择结合性物质固定化基材固定了选择结合性物质后，可以进行适当的处理。例如，通过进行热处理、碱处理、表面活性剂处理等，也可以使固定的选择结合性物质改性。或者，使用由细胞、菌体等生物体材料得到的选择结合性物质时，也可以除去不需要的细胞成分等。而且，可以使用处理后的纤维或选择结合性物质固定化基材作为选择结合性物质的检测材料。另外，这些处理可以分别进行，也可以同时进行。另外，也可以在将含有选择结合性物质的试样固定在纤维或选择结合性物质固定化基材上之前适当进行。
固定了选择结合性物质的本发明的纤维或固定了选择结合性物质的本发明的选择结合性物质固定化基材，通过将固定的选择结合性物质作为探针，使之与被测物质相互作用，从而可以检测出检体中的特定的被测物质。对于2种被测试样，进行下述所示的标记化(使之具有区别)，也可以比较其差异。
与选择结合性物质选择性结合的、被测试样中的对应选择结合性物质的检测，可以使用能够特异性地识别结合的公知方法。例如，在检体中的对应选择结合性物质上结合荧光物质、发光物质、放射性同位素等标记体，选择结合反应和洗涤后，可以检测该标记体。关于这些标记体的种类和标记体的引入方法，没有任何限定，可以使用以往公知的各种方法。特别是，纤维具有光透过性，使在纤维端标记的检体反应，在另一端用检测器进行检测时，优选使用荧光物质或发光物质作为标记体。用于免疫测定或核酸杂交的测定的荧光物质或发光物质在本领域是公知的，市售有各种物质，因此可以使用这些市售的荧光物质或发光物质。
另外，纤维或选择结合性物质固定用部位上固定的选择结合性物质与被测试样中的对应选择结合性物质进行结合反应后，或者在结合反应的同时，使与对应选择结合性物质选择性结合的、被标记的游离测定用物质反应，洗涤后，测定通过对应选择结合性物质与选择结合性物质结合在纤维上的该测定用物质的标记，从而也可以进行。例如，作为选择结合性物质，将具有特定碱基序列的核酸固定在纤维上，对应选择结合性物质是含有与该核酸互补的区域的核酸时，可以将作为对应选择结合性物质的该核酸中的同与上述选择结合性物质互补区域以外的区域互补的核酸标记，用作测定用物质。另外，作为选择结合性物质，将抗原固定在纤维上，对应选择性结合物质是与该抗原进行抗原抗体反应的抗体时，可以将与该抗体进行抗原抗体反应的第2抗体标记，将得到的物质用作测定用物质。这些场合也优选在纤维的一端区域固定选择结合性物质，使用荧光物质或发光物质作为标记，由另一端侧测定反应结果。
另外，纤维或选择结合性物质固定用部位具有电传导性时，优选使用检测基于电化学反应的电流值等应答的方法。此时，使在作为电极的纤维上固定的试样和检体在促进、抑制试样和检体反应的材料下进行反应，而且，该材料的全部或一部分被包含在结合的试样与检体中，通过测定流过反应后的电极，即纤维或选择结合性物质固定用部位的电流值，可以检测出试样和检体有无结合、结合的程度。
作为在使用本发明的纤维或纤维排列体的测定方法，或者使用适用于本发明的结合反应装置的选择结合性物质固定化基材的测定方法中使用的被测物质，可以例举应需测定的核酸，例如病原菌或病毒等的基因、遗传疾病的原因基因等及其一部分、具有抗原性的各种生物体成分、对病原菌或病毒等的抗体等，但不受这些的限定。另外，作为含有这些被测物质的检体，可以例举血液、血清、血浆、尿、粪便、骨髓、唾液、各种组织液等体液，或者各种饮食品及其稀释物等，但不受这些的限定。另外，作为被测物质的核酸，可以将采用常规方法由血液或细胞提取的核酸标记，也可以是将该核酸作为模板，通过PCR等核酸扩增法扩增得到的物质。后一种情况，可以大幅提高测定灵敏度。将核酸扩增产物作为被测物质时，通过在用荧光物质等标记的三磷酸核苷酸存在下进行扩增，可以标记扩增核酸。另外，被测物质是抗原或抗体的场合，可以通过常规方法直接标记作为被测物质的抗原或抗体，或者使作为被测物质的抗原或抗体与选择结合性物质结合后，洗涤固定了纤维或选择结合性物质的选择结合性物质固定部位，使该抗原或抗体与进行抗原抗体反应的标记后的抗体或抗原反应，也可以测定纤维或者选择结合性物质固定部位上结合的标识。
使固定化物质与被测物质相互作用的步骤可以与以往完全相同地进行。反应温度和时间根据杂交的核酸的链长、与免疫反应相关的抗原和/或抗体的种类等适当选择，核酸杂交的场合，通常在50℃～70℃进行1分钟～数小时，免疫反应的场合，通常在室温～40℃下进行1分钟～数小时。
通过上述方法，可以测定与固定的选择结合性物质选择性结合的核酸或抗体、抗原等被测物质。也就是说，作为选择结合性物质固定了核酸的场合，可以测定具有与该核酸或其一部分互补的序列的核酸。另外，作为选择结合性物质固定了抗体或抗原的场合，可以测定与该抗体或抗原进行免疫反应的抗原或抗体。另外，本说明书所说的“测定”包括检测和定量两者。
通过使用本发明，可以有效地、迅速且简便地研究各种生物中的基因、蛋白质或糖链的表达。例如，将由正常人肝脏和感染肝炎病毒的肝脏提取的核酸标记后，在发明的纤维或选择结合性物质固定化基材上固定了各种已知人体基因的纤维排列体或选择结合性物质固定部位分别进行杂交。通过比较与正常肝脏核酸和肝炎肝脏核酸的排列体的结合程度，可以研究肝炎肝脏的基因表达的变化。
同样，在结合了作为蛋白质的各种单克隆抗体的纤维排列体上，结合标记后的正常脑提取蛋白质和阿耳茨海默脑提取蛋白质，将结合后的蛋白质与正常蛋白质进行比较，从而可以研究阿耳茨海默脑中蛋白质的异常表达。
实施例通过下面的实施例更详细地说明本发明。当然，本发明并不受下述实施例的限定。
实施例1为了确认在本实施例中使用的纤维或玻璃基材上确实进行了核酸的固定和杂交，对生物试样不进行交叉反应，使用对热稳定且杂交时不因施加的热而分解的地高辛配基作为标记体，进行试验。
将聚甲基丙烯酸甲酯光纤纤维(直径250μm，长度100mm)的一端浸渍在肌动蛋白基因的核酸液(宝酒造株式会社制)(该核酸浓度10μg/ml)中，在空气中干燥后，进行紫外线处理(使用ストラタジ-ン社制UVクロスリンカ-)，得到固定了核酸的纤维。合成与使用的核酸序列的部分互补的低聚核苷酸，用地高辛配基(DIGDigoxigenin，ロシユ·ダイアグノスティツクス株式会社)标记。
另外，在氨基引入载玻片基材上将肌动蛋白基因的核酸液(宝酒造株式会社制)(该核酸浓度10μg/ml)点样，使各固定部位的大小达到直径200μm，在空气中干燥后，进行紫外线处理(使用ストラタジ-ン社制UVクロスリンカ-)，得到固定了核酸的基材。合成与使用的核酸序列的部分互补的低聚核苷酸，用地高辛配基(DIGDigoxigenin，ロシユ·ダイアグノスティツクス株式会社)标记。
将末端氨基化的低聚核苷酸分别溶解在100mM硼酸缓冲液(pH8.5)中，使终浓度为2mM。加入等量的二地高辛配基-3-O-甲基羰基-α-氨基己酸-N-羟基-琥珀酰亚胺酯(26mg/ml二甲基甲酰胺溶液)，室温下静置一夜。将糖原(ロシユ·ダイアグノスティツクス株式会社)作为载体，进行乙醇沉淀，风干沉淀后，溶解在100μmol的10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA中。将这样得到的DIG标记低聚核苷酸用作试样核酸模型。
将制作的核酸固定化纤维装入杂交用袋中，采用常规方法(按照ロシユ·ダイアグノスティツクス株式会社，产品手册实施)进行杂交。
另外，在杂交装置的基台上载置制作的核酸固定基材，采用常规方法(基于ロシユ·ダイアグノスティツクス株式会社，产品手册进行)进行杂交。
杂交结束后，洗涤核酸固定化纤维和核酸固定化基材，然后添加抗DIG酶标记抗体溶液，进行抗原抗体反应。反应后，洗涤核酸固定化纤维和核酸固定化基材，除去未结合的抗体。添加DIG检测试剂，使之平衡化。去掉水分，进行光信号的检测，根据核酸的固定化，可以检测出信号。
由此，采用没有外加交流电场的以往方法，本发明的杂交装置在结构或功能上没有问题，确认确实可以用作杂交装置。
实施例2光纤和选择结合性物质固定基材的前处理将直径200μm的玻璃制光纤(ホヤシヨツト(株)制)用玻璃制光纤专用刀切断，使两侧的端面为镜面状态。
用纯水、乙醇、NaOH的混和溶液洗涤加工的上述光纤和载玻片(76mm×26mm×1mm)(松浪硝子工业(株)制)后，用纯水洗涤。再将洗涤过的面浸渍在纯水、聚-L-赖氨酸(リシン)的混和溶液(组成10％聚-L-赖氨酸)中，在载玻片的表面引入氨基。
以2种核酸溶液(宝酒造(株)制，“γControl Template & PrimerSet-A”；产品编号TX803(约1000bp的γDNA片断)，以及宝酒造(株)制，“Human TFR(1kb)Template & Primer Set”产品编号TX806(约1000bp的人运铁蛋白受体DNA片断))为原料，采用PCR法使各种的核酸扩增。PCR法中使用的引物使用分别与产品一起包装的引物。将其纯化，得到纯化了的核酸溶液。在载玻片引入了氨基的面上将纯化过的2种核酸溶液点样，在空气中干燥后，进行UV交联(120mJ)，得到在核酸固定部位固定了2种核酸的核酸固定基材。接着，为了封闭未与核酸反应的载玻片表面剩余的氨基，在混和了硼酸、纯水、pH调节用NaOH、琥珀酸酐、1-甲基-2-吡咯烷酮的溶液(将琥珀酸酐3g溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮187ml中，在使用之前，加入1M硼酸钠(pH8.0)17ml溶液得到)中浸渍固定了核酸的面，振荡。然后进行洗涤。
RNA的处理准备RNA溶液(宝酒造(株)制，“γpolyA+RNA-A”；产品编号TX802)。其具有和上述核酸之一(TX803)互补的碱基序列。将其与逆转录酶“Super script II”(GIBCO BRL社制；产品编号18064-071)、2.5mM dATP、2.5mM dCTP、2.5mM dGTP、1.0mM dTTP、Cy5-dUTP(アマシヤム·フアルマシア制，产品编号PA55022)混和，在42℃下温育1小时，进行逆转录，得到整合了Cy5色素的cDNA溶液。
同样准备RNA溶液(宝酒造(株)制，“Human TFR RNA(1kb)”产品编号TX805)，除将Cy5-dUTP变为Cy3-dUTP(アマシヤム·フアルマシア制，产品编号PA53022)以外，在与上述相同的条件下进行逆转录，得到整合了Cy3色素的cDNA溶液。该整合了Cy3色素的cDNA具有与上述核酸之一(TX806)互补的碱基序列。
将上述2种掺入了色素的cDNA溶液混和、纯化，再溶解于缓冲液(3.4×SSC，0.1％SDS)中，得到杂交溶液。
杂交将在端面固定了1种核酸的2根光纤和上述整合了色素的cDNA溶液(杂交用溶液)装入乙烯制袋中，密闭，使杂交溶液不蒸发。将其在65℃的条件下放置16小时。再由乙烯制袋中取出光纤，进行洗涤。
荧光检测首先，使用光纤如下所述检测来自Cy5的荧光。作为荧光的激发光，使用激光(波长635nm)。将该会聚的光束照射到光纤的浸渍了DNA溶液的端面上，用会聚透镜会聚由另一端面发出的光。然后，设置二色镜(オメガオプティカル制，产品编号XF2035)，使之与光轴成45度的角度，除去剩余的激发光。在二色镜之后设置带通滤波器(オメガオプティカル制，产品编号XF3076)，进一步除去剩余的激发光。在该带通滤波器后设置光万用表(フオトマルチメタ)(滨松ホトニクス制，产品编号H5784-02)，观察来自Cy5色素的荧光。
其次，为了使用核酸固定化基材测定来自Cy5的荧光，如下设置光学系统。首先，作为荧光的激发光，使用激光(波长635nm)。先与光轴垂直地设置带通滤波器(オメガオプティカル制，产品编号X1069)，除去激发光以外剩余的光。再设置二色镜(オメガオプティカル制，产品编号XF2035)，使之与激光束的光轴成45度的角度，将该会聚的光束照射到浸渍了DNA溶液的载玻片面上。再在照射激发光侧的端面侧会聚由浸渍于DNA溶液中的端面返回的荧光，通过后述的二色镜(オメガオプティカル制，产品编号XF2035)，再通过带通滤波器(オメガオプティカル制，产品编号XF3076)，除去剩余的激发光。
来自Cy3的荧光，除使光纤、核酸固定化基材两者以及二色镜和带通滤波器为Cy3用的设备(分别为オメガオプティカル制，产品编号XF1074、XF2017、XF3083)，并使照射激光的波长为532nm以外，采用与上述相同的方法进行检测。
采用该方法，分别对于Cy5、Cy3，测定上述杂交后来自2种光纤和核酸固定部位的荧光。由浸渍于TX803核酸溶液而制作的光纤，仅观察到Cy5的荧光，没有检测出Cy3的荧光。由浸渍于TX806核酸溶液而制作的光纤和点样了TX806核酸溶液的核酸固定部位，仅可以观察到Cy3的荧光，没有检测到来自Cy5的荧光。
实施例3使实施例2的光纤成束，扫描激发光的光束，检测来自各光纤的荧光，除此以外，进行与实施例2相同的测定。结果，得到与实施例2相同的结果。
实施例4使照射激发光即激光的光纤的端面为未浸渍于DNA溶液中的端面，除此以外，进行与实施例2相同的测定。也就是说，使检测荧光时光纤的方向与实施例2相反，除此以外，与实施例2相同。结果，得到与实施例2相同的结果。
实施例5光纤、核酸的处理与实施例2同样进行。
为了测定来自Cy5的荧光，如下设置光学系统(参照图5)。首先，作为荧光的激发光，使用激光26(波长635nm)。先与光轴垂直地设置带通滤波器19(オメガオプティカル制，产品编号X1069)，除去激发光以外剩余的光。再设置二色镜20(オメガオプティカル制，产品编号XF2035)，使之与激光束的光轴成45度的角度，将该会聚的光束照射到与浸渍于DNA溶液中的端面相对的光纤端面上。再在照射激发光侧的端面侧会聚由浸渍于DNA溶液中的端面返回的荧光，通过如上所述的二色镜20(オメガオプティカル制，产品编号XF2035)，再通过带通滤波器21(オメガオプティカル制，产品编号XF3076)，除去剩余的激发光。另外，图5中，22表示会聚透镜，23表示光纤，24表示试样(DNA)，25表示光电倍增管。
来自Cy3的荧光，除使二色镜和带通滤波器为Cy3用的设备(分别为オメガオプティカル制，产品编号XF1074、XF2017、XF3083)，并使照射激光的波长为532nm以外，采用与上述相同的方法进行检测。
采用该方法，分别对于Cy5、Cy3，测定上述杂交后来自2种光纤的荧光。由浸渍于TX803核酸溶液而制作的光纤，仅观察到Cy5的荧光，没有检测出Cy3的荧光。由浸渍于TX806核酸溶液而制作的光纤，仅可以观察到Cy3的荧光，没有检测到来自Cy5的荧光。
实施例6将光纤制成多个细光纤捆扎得到的导象管(エドモンド·オプティツクス·ジヤパン制，产品编号CJ53843)。该导象管是将3012根粗细为25μm的石英制光纤捆扎制成的。
光纤、核酸的处理与实施例5同样进行。另外，检测光学系统与实施例5相同。此时，由浸渍于TX803核酸溶液而制作的光纤，仅观察到Cy5的荧光，没有检测出Cy3的荧光。由浸渍于TX806核酸溶液而制作的光纤，仅可以观察到Cy3的荧光，没有检测到来自Cy5的荧光。另外，如果实施例5的来自Cy5、Cy3的荧光的强度为1，则本实施例的试验中，荧光的强度为3，S/N更高。认为其理由是因为如果使用导象管，会聚的光在光纤内部不发散，能够有效地将激发光送到试样。
实施例7光纤的处理在实施例1使用的直径为200μm的玻璃制光纤(ホヤシヨツト制)上通过溅射涂覆Pt膜，得到具有导电性的光纤。再用玻璃制光纤专用刀切断，使两侧的端面为镜面状态。再将端面浸渍在纯水、聚-L-赖氨酸的混和溶液(组成10％聚-L-赖氨酸)中，在光纤的一个端面上引入氨基。
然后，核酸等的处理与实施例2同样进行，分别得到在端面上固定了1种核酸的2根光纤和杂交用溶液。
杂交将在端面上固定了1种核酸的2根光纤和整合了Cy5、Cy3色素的cDNA溶液(杂交用溶液)装入微管(1.5ml)中。再在微管的盖上开孔，在其中穿过光纤，将固定了DNA的光纤的端面浸渍在微管内的杂交溶液中。用纸带将微管盖上的孔密封，进行密闭，使溶液不蒸发。此时的杂交溶液为50μl。另外，溶液的组成为在纯水中溶解标记了荧光体的DNA。将其在65℃的条件下放置10分钟。此时，在微管的底面贴附铜箔，将光纤作为阳极，将微管底的铜箔作为阴极，外加100V的电压。再由微管取出光纤，洗涤。与实施例2同样测定光时，由浸渍于TX803核酸溶液而制作的光纤，仅观察到Cy5的荧光，没有检测出Cy3的荧光。由浸渍于TX806核酸溶液而制作的光纤，仅可以观察到Cy3的荧光，没有检测到来自Cy5的荧光。此时的荧光强度与实施例2相同。另一方面，使光纤的条件与实施例2相同(即未外加电压的状态)，使杂交时间为10分钟时，荧光的强度为实施例2的1/3。这样可知，如果光纤具有导电性，外加电场，则即使仅10分钟的杂交时间，也是充分的。
实施例8选择结合性物质固定基材的前处理为了在选择结合性物质排列基材上形成导电电极，在载玻片上靠近安装2个设有开口部的不锈钢制掩膜，使10mm×5mm的开口的10mm边间隔10mm的间隔平行对峙，通过溅射法在载玻片上设置相当于上述掩膜开口部形状的金电极。
将这样设置有金电极的载玻片(76mm×26mm×1mm)(松浪硝子工业(株)制)用纯水、乙醇、NaOH的混和溶液洗涤后，用纯水洗涤。再将洗涤过的面浸渍在纯水、聚-L-赖氨酸的混和溶液(组成10％聚-L-赖氨酸)中，在载玻片的表面引入氨基。
以2种核酸溶液(宝酒造(株)制，“γControl Template & PrimerSet-A”；产品编号TX803(约1000bp的γDNA片断)，以及宝酒造(株)制，“Human TFR(1kb)Template & Primer Set”产品编号TX806(约1000bp的人运铁蛋白受体DNA片断))为原料，采用PCR法使各种核酸扩增。PCR法中使用的引物使用分别与产品一起包装的引物。将其纯化，得到纯化了的核酸溶液。在载玻片的上述金电极之间的引入了氨基的面上点样纯化过的2种核酸溶液，在空气中干燥后，进行UV交联(120mmJ)，得到在核酸固定部位固定了2种核酸的核酸固定化基材。接着，为了封闭未与核酸反应的载玻片表面剩余的氨基，在混和了硼酸、纯水、pH调节用NaOH、琥珀酸酐、1-甲基-2-吡咯烷酮的溶液(将琥珀酸酐3g溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮187ml中，在使用之前，加入1M硼酸钠(pH8.0)17ml溶液得到)中浸渍固定了核酸的面，振荡。然后进行洗涤。
RNA的处理准备RNA溶液(宝酒造(株)制，“γpolyA+RNA-A”；产品编号TX802)。与实施例2的RNA处理同样进行，得到整合了Cy5色素的cDNA溶液以及杂交溶液。
杂交将在表面固定了2种核酸的核酸固定化基材固定在杂交装置的基台上，连接在核酸固定部位的两侧设置的金电极和杂交装置的交流电压外加手段。在固定了2种核酸的部位滴加2μl的上述杂交溶液，在核酸固定部位两侧的导电电极上架设盖板，密闭，使杂交溶液不蒸发。再在上述导电电极之间外加10V、10Hz的交流电压，在65℃的条件下静置10分钟后，取下盖板、导电电极，洗涤。
荧光检测为了测定来自Cy5和Cy3的荧光，光学系统与实施例2的光学系统相同，检测来自Cy5和Cy3的荧光。
采用该方法，对于Cy5、Cy3，分别测定上述来自杂交后的2种核酸固定部位的荧光。由点样了TX803核酸溶液的核酸固定部位，仅观察到Cy5的荧光，不能检测出Cy3的荧光。由点样了TX806核酸溶液的核酸固定部位，仅观察到Cy3的荧光，不能检测出来自Cy5的荧光。
另外可知，由此时外加交流电压的核酸固定化基材得到的荧光强度与未外加交流电压长时间杂交的以往的方法相比，即使与外加直流电压的场合相比，在低电压下，也可以得到相同的效果。
实施例9为了验证在选择结合性物质固定化基材上不形成导电电极，在选择结合反应装置上具有导电电极时的效果，用纯水、乙醇、NaOH的混和溶液洗涤载玻片(76mm×26mm×1mm)(松浪硝子工业(株)制)后，用纯水洗涤。再将洗涤过的面浸渍在纯水、聚-L-赖氨酸的混和溶液(组成10％聚-L-赖氨酸)中，在载玻片的表面引入氨基，与实施例8同样进行核酸的固定化、RNA的处理。
接着，为了使用核酸固定化基材确认外加交流电压的效果，进行下述试验。将在表面固定了2种核酸的核酸固定化基材固定在杂交装置的基台上，在固定了核酸的区域的两侧设置与杂交装置的交流电压外加手段连接的导电电极。在本实施例中，使用厚度0.15mm的金薄板作为导电电极。导电电极的间隔为1cm。在固定了2种核酸的部位滴加20μl的上述杂交溶液，在核酸固定部位两侧的导电电极上架设盖板，密闭，使杂交溶液不蒸发。再在上述导电电极之间外加10V、10Hz的交流电压，在65℃的条件下静置10分钟后，取下盖板、导电电极，洗涤。
为了与不外加交流电压的以往方法进行比较，作为与外加交流电压的试样对应的试样，准备在导电电极间未外加电压状态下于65℃的条件下放置16小时的试样。在65℃放置16小时后，取下盖板、导电电极，洗涤。
荧光检测与实施例8相同，检测来自Cy5和Cy3的荧光，由点样了TX803核酸溶液的核酸固定部位，仅观察到Cy5的荧光，不能检测出Cy3的荧光。由点样了TX806核酸溶液的核酸固定部位，仅观察到Cy3的荧光，不能检测出来自Cy5的荧光。
另外，可以得知由此时外加了交流电压的核酸固定化基材得到的荧光强度能够得到与在杂交装置侧具有导电电极的场合相同的结果。
权利要求
1.一种纤维或含有该纤维的束的纤维排列体，其固定了选择结合性物质。
2.权利要求1所述的纤维或含有该纤维的束的纤维排列体，上述选择结合性物质是核酸、蛋白质、糖类或抗原性化合物。
3.权利要求2所述的纤维或含有该纤维的束的纤维排列体，上述选择结合性物质是核酸、抗体或抗原。
4.权利要求1～3中任意一项所述的纤维或含有该纤维的束的纤维排列体，上述纤维具有光透过性。
5.权利要求1～3中任意一项所述的纤维和含有该纤维的束的纤维排列体，上述纤维具有电传导性。
6.权利要求1～5中任意一项所述的固定纤维和含有该纤维的束的纤维排列体，其特征在于，具有柔性。
7.权利要求1～6所述的纤维和含有该纤维的束的纤维排列体，其特征在于，在纤维端固定上述选择结合性物质。
8.权利要求1～7所述的纤维排列体，在纤维排列体的全部或一部分，上述选择结合性物质的种类不同。
9.权利要求8所述的纤维排列体，固定了上述选择结合性物质的各纤维可以区别。
10.权利要求1～9中任意一项所述的纤维排列体，可以直接通过纤维检测与固定的选择结合性物质反应的物质。
11.权利要求1～10中任意一项所述的纤维排列体，其特征在于，上述纤维为光纤。
12.一种选择结合反应的结果的测定方法，使含有对应选择结合性物质的被测试样对权利要求1～11中任意一项所述的纤维排列体发生作用，洗涤后，测定与该纤维结合的上述对应选择结合性物质，其中，上述对应选择结合性物质与固定在该纤维排列体的纤维上的上述选择结合性物质选择性结合。
13.权利要求12所述的方法，上述纤维具有光透过性，上述选择结合性物质固定在纤维的一端部。
14.权利要求13所述的方法，上述对应选择结合性物质被荧光或发光物质标记，或者是与被荧光或发光物质标记的测定用物质选择性结合的物质，反应和洗涤后，由上述纤维的另一端侧测定上述对应选择结合性物质或上述测定用物质的标记所用的荧光或发光物质发出的荧光或发光。
15.一种方法，在权利要求5所述的纤维排列体上外加电压或电流，使该纤维排列体的纤维上固定的上述选择结合性物质与含有对应选择结合性物质的被测试样选择性结合。
16.一种选择结合性物质与对应选择结合性物质的结合反应方法，在基材上固定选择结合性物质，使含有与上述选择结合性物质选择性结合的对应选择结合性物质的被测试样液和上述固定化选择结合性物质接触，使上述选择结合性物质与上述对应选择结合性物质进行结合反应，在该步骤中，使上述被测试样液和/或上述对应选择结合性物质相对于固定了上述选择结合性物质的面相对移动。
17.权利要求16所述的方法，在基材上固定选择结合性物质，使含有与上述选择结合性物质选择性结合的对应选择结合性物质的被测试样液和上述固定化选择结合性物质接触，使上述选择结合性物质与上述对应选择结合性物质进行结合反应，在该步骤中，在与固定了上述选择结合性物质的面的垂直轴交叉的方向，且上述选择结合性物质固定化区域两端的外侧设置的导电电极间外加交流电压，同时进行上述结合反应。
18.权利要求16或17所述的方法，上述选择结合性物质固定化区域存在多个，存在其排列而成的选择结合性物质排列区域，在该选择结合性物质排列区域两端的外侧设置上述导电电极。
19.权利要求16至18中任意一项所述的方法，上述选择结合性物质是选自核酸、蛋白质、糖类、抗体或抗原性化合物中的至少一种。
20.权利要求19所述的方法，上述选择结合性物质和上述对应选择结合性物质是单链核酸，上述结合反应是核酸间的杂交。
21.一种选择结合反应装置，是在基材上固定选择结合性物质，使含有与上述选择结合性物质选择性结合的对应选择结合性物质的被测试样液和上述固定化选择结合性物质接触，使上述选择结合性物质与上述对应选择结合性物质进行结合反应的装置，具有设置上述基材的基台；在与固定了上述选择结合性物质的面的垂直轴交叉的方向，且在上述选择结合性物质固定化区域两端的外侧设置的导电电极；以及在该导电电极间外加交流电压的交流电压外加手段。
22.一种选择结合性物质固定用基材，是用于在基材上固定选择结合性物质，使含有与上述选择结合性物质选择性结合的对应选择结合性物质的被测试样液和上述固定化选择结合性物质接触，使上述选择结合性物质与上述对应选择结合性物质进行结合反应的上述基材，具有固定基材上的选择结合性物质的选择结合性物质固定用部位，以及在选择结合性物质固定用区域两端的外侧设置的导电电极。
23.权利要求22所述的基材，上述选择结合性物质固定用部位存在多个，存在其排列而成的选择结合性物质排列区域，在该选择结合性物质排列区域两端的外侧设置上述导电电极。
24.权利要求22或23所述的选择结合性物质固定用基材，上述选择结合性物质固定用部位为在基材上设置的凸部或凹部。
25.权利要求24所述的基材，上述选择结合性物质固定用部位是插入设置于上述基材上的孔中的纤维或该纤维的束的端部。
26.权利要求22至25所述的基材，选择结合性物质固定在上述选择结合性物质固定用部位上。
27.权利要求22至26中任意一项所述的基材，上述选择结合性物质是选自核酸、蛋白质、糖类、抗体或抗原性化合物中的至少一种。
28.权利要求27所述的基材，上述选择结合性物质和上述对应选择结合性物质是单链核酸，上述结合反应是核酸间的杂交。
29.权利要求22至28中任意一项所述的基材，上述导电电极的材质是选自铂、金、银、铝、铜、钯的金属单质或它们的合金、碳或碳化合物、或者导电性聚合物中的至少一种。
全文摘要
本发明公开了一种固定了选择结合性物质的排列体，其可以不依赖于位置关系地区分识别各个试样，可以组合任意的排列体，另外可以根据使用方法自由改变密度，且简便地检测出结合的试样和其他试样的反应。本发明提供固定了选择结合性物质的纤维或含有该纤维的束的纤维排列体。另外，提供一种选择结合性物质和对应选择结合性物质的结合反应的方法，其通过在选择结合反应步骤中，在与固定选择结合性物质的面的垂直轴交叉的方向上外加交流电压等方法，使上述被测试样液和/或上述对应选择结合性物质相对于固定了上述选择结合性物质的面相对移动。
文档编号B01J19/00GK1496480SQ02806339
公开日2004年5月12日 申请日期2002年1月11日 优先权日2001年1月12日
发明者曾根三郎, 久, 薙野邦久, 史, 日笠雅史, 二, 信正均, 渡边幸二 申请人:东丽株式会社