核酸提纯盒的制作方法

背景技术：

基于dna和rna对于二氧化硅表面的亲和力(固相吸附)的初始核酸提纯方法由boom等人介绍。通过高浓度的离液盐(通常为异硫氰酸胍或盐酸胍)将促进二氧化硅表面的核酸吸引。boom的方法使用离液盐溶液来使生物试样变性，并使得它利用离心力而通过过滤器，以便促进dna和rna吸附至二氧化硅表面上。一旦核酸结合在过滤器上，就用乙醇缓冲剂进行一次或多次洗涤，以便除去离液盐和其它生物杂质，同时保持核酸结合(离液盐在下游应用中对于大部分核酸都是破坏性的)。作为最终步骤，在除去乙醇(通过高速旋转)后，核酸需要使用洗提缓冲液(水或低盐缓冲液)来再水合。再水合促进了dna和rna从二氧化硅表面的脱开，且最终的旋转产生了溶液，提纯的核酸重新悬浮在该溶液中。

这种方案的变化形式在其它地方介绍，使用离心力或真空作为液体流动驱动力。不过，所有这些方法都相当复杂和费时间，包括多个移液步骤和随后应用不同的驱动力来控制液体流动，这通常在重复提纯工艺之间产生较高的产量变化。

例如，在人工实施通过真空的提纯方案时，提纯处理包括5个主要步骤，这5个主要步骤对应于5个不同的液体流过二氧化硅过滤器，即：包含核酸、洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2的试样混合物，用于清洗过滤器，并消除任何量的污染物；空气，用于干燥过滤器和消除任何挥发性污染物的痕迹；以及洗提缓冲液，用于从过滤器上释放核酸，因此，nas可进一步用于下游用途(例如qpcr放大和检测)。在各步骤结束时，甚至在一定容积的液体流过过滤器之后还保持真空吸力1或2分钟，以便保证在下一次液体移液之前几乎没有液体留在过滤器裂缝内。

核酸生产的可复制性取决于对试样和缓冲液与过滤器的接触时间以及液体流的量和分布进行复制的可能性，这取决于操作人员的技能。

因此，本发明的目的是提供一种提纯装置，该提纯装置提供了独立于各操作人员的、可复制的提纯结果。

这通过一种用于从复杂生物试样中提纯生物或化学分析物的微流体装置和方法而实现。该微流体装置包括：腔室，过滤器嵌入该腔室中；多个储存器；以及阀。所述装置能够与外部泵交接，该外部泵通过自动仪器来操作。因此，这里的装置和方法提供了传统核酸提纯方法的端对端的自动实施方式。

技术实现要素：

本发明涉及一种微流体装置，该微流体装置有封闭腔室，该封闭腔室包含用于从复杂生物试样中提纯生物或化学分析物的过滤器，所述腔室除了所述过滤器之外还容纳有多个口部，如下所述：第一口部，该第一口部使得腔室能够通过第一流动通路而与真空发生器进行气体连通；第二口部，该第二口部使得腔室能够通过第二流动通路而与一个或多个储存器进行液体连通；第三口部，该第三口部使得腔室能够通过第三流动通路而与一个或多个接收容器和真空发生器都进行气体和液体连通；以及过滤器，该过滤器布置在第三口部以及第一和第二口部之间，这样，通过第一和/或第二口部进入腔室和通过第三口部离开腔室的流体流过该过滤器。

这里公开的发明还涉及一种使用这里公开的微流体装置而从复杂生物试样中提纯生物或化学分析物的方法，该方法包括以下步骤：(a)通过在腔室和第一储存器之间施加负压差而使得液体试样能够通过第二口部进入腔室，而在流动通路内的阀打开第一和第二口部以及关闭第三口部；(b)通过在所述第一接收容器和腔室之间施加负压差而使得试样能够通过过滤器流入第一接收容器内，而在流动通路内的阀关闭第一口部，使得第二口部向大气压通气，并打开第三口部；以及(c)通过在腔室和一个接收容器之间施加负压差而从过滤器洗提分析物，而在流动通路内的阀打开第一和第二口部以及关闭第三口部。

具体实施方式

在原则上，提纯能够基于色谱法中广泛已知的任何效应(例如置换，亲和，阳离子交换，阴离子交换，尺寸排除，反相和正常相)，且其选择主要取决于要提纯的分析物。不过，尺寸排除不如其它技术优选，因为在第一技术的情况下不能实现永久的结合。对于后者，可以发现一些条件，在这些条件下，要提纯的分析物选择性地结合到介质上，而理想的是试样的其它组分通过介质而并不结合。

本发明的微流体装置包括含有过滤器的封闭腔室。这里的过滤器表示与试样的不同组分差异地相互作用的介质。在普通色谱法中，这种介质通常称为静止相。当试样在合适的缓冲液(在色谱法中通常称为运动相)中通过所述介质而移动时，差异的相互作用(也称为分离)将引起差异的保留时间，因此导致提纯效果。

在这里公开的装置中使用的过滤器是适于从复杂生物试样中提纯生物或化学分析物的过滤器。分析物是要提纯的物质。复杂生物试样是除了分析物之外还包含不同大小和化学性质的许多不同组分(例如蛋白质、核酸、激素、脂质、盐)的试样。优选的试样是细胞裂解物

在优选实施例中，过滤器由二氧化硅制成或至少包括二氧化硅。例如，过滤器可以是二氧化硅隔膜的形式或者含有二氧化硅珠或二氧化硅涂覆珠的树脂的形式。二氧化硅表面有利于分离或提纯核酸，特别是dna。已知二氧化硅在某些盐和ph条件下吸附dna分子，且二氧化硅吸附已经成为用于提纯dna的重要技术。

在本发明的一个实施例中，过滤元件集成在提纯空腔中，并通过固定环来固定。在优选实施例中，提纯隔膜过滤器插入至空腔中，该空腔作为微流体装置的主体的一部分，且隔膜过滤器通过压缩它的固定环而保持就位(图2a和d)。

在可选实施例中，提纯空腔是单独的部件，它装配至微流体装置中，且不需要固定环来将隔膜过滤器保持就位。提纯空腔自身提供了夹持结构部，它将所述空腔和隔膜过滤器固定就位，其中，隔膜正确压缩(图2b和c)。

与包括固定环的空腔相比，优选通过夹持结构部来保持就位的单独空腔具有多个优点

通过夹持结构部来实现隔膜过滤器的可复制的压缩。这保证了可复制的压缩，所述可复制的压缩产生了通过隔膜过滤器的可复制的液体流，因此产生提纯核酸或其它提纯分析物的可复制的生产。

优选是，将通过它的夹持结构部来保证将提纯空腔正确定位在微流体装置中，而不需要控制由设计给出的压缩量。这有利于制造。

提纯空腔不需要固定环，这导致减少了试样的污染。固定环破坏流体通路并收集液体的残余物，该液体残余物在缓冲液之间产生污染，并导致最终提纯的洗提液中的一定量的污染物，这可能阻碍下游的分析，例如pcr。可脱离的提纯空腔在它的壁上产生平滑的过渡，这减少了可以粘附至壁上的污染物的量，通常为5至10折(fold)。

优选是，分析物是核酸。术语核酸包括呈处理的和未处理的形式的mrna(信使rna)、trna(转移rna)、hn-rna(异源核rna)、rrna(核糖体rna)、lna(锁定核酸)、mtrna(线粒体rna)、nrna(核rna)、sirna(短干扰rna)、snrna(小核rna)、snorna(小核仁rna)、scarna(小cajal体特定rna)、microrna、dsrna(双链rna)、核酶、核糖开关、病毒rna、dsdna(双链dna)、ssdna(单链dna)、质粒dna、粘粒dna、染色体dna、病毒dna、mtdna(线粒体dna)、ndna(核dna)、sndna(小核dna)等或者所有其它可设想的核酸。

除了所述过滤器之外，腔室还容纳如下多个口部：第一口部，该第一口部使得腔室能够通过第一流动通路而与真空发生器进行气体连通；第二口部，该第二口部使得腔室能够通过第二流动通路而与一个或多个储存器进行液体连通；第三口部，该第三口部使得腔室能够通过第三流动通路而与一个或多个接收容器和真空发生器进行气体和液体连通。

真空发生器位于腔室的上游。一个或多个储存器也位于腔室的上游，但是在与真空发生器不同的另一流动通路中。所述一个或多个接收容器位于腔室的下游。第三流动通路的真空发生器位于接收容器的更下游。

储存器通常包括至少一个含有要提纯试样的储存器以及可选的一个或多个包含一种或多种洗涤缓冲液和/或洗提缓冲液和/或再生缓冲液的储液器。一个或多个容器通常包括用于接收分析物的至少一个容器以及可选的用于接收其它液体的一个或多个容器，例如流过液、洗涤缓冲液和/或再生缓冲液。

过滤器位于第三口部以及第一和第二口部之间，以使得通过第一和/或第二口部进入腔室并通过第三口部离开腔室的流体流过该过滤器。最优选是，过滤器横过所述腔室的整个横截面而膨胀。不过，介质并不必须填充腔室的整个高度。优选是，过滤器直接布置在第三口部上面。

优选是，该装置是微流体盒。盒的意思是能够由较大单元通过合适的接口部来驱动的可消耗部件。通常，该单元包含易于清洁的昂贵和/或耐久的元件以及一个用于自动控制过程的软件代码。该单元可以可选地包括其它元件，用于在提纯单元的上游或下游执行其它处理。

在一个实施例中，该装置是一次性的，这意味着该装置设计成用于单次使用，它在使用后被处置。在另一实施例中，该装置是可重复使用的，它通常需要在每次使用之后再生该装置。

所述装置还可以包括阀，理想的是，真空发生器是分离的。真空发生器抽空腔室的压力，从而产生相对负压。根据口部的设置(即，打开或关闭)，流体从一个储存器被吸入腔室内和/或从腔室被吸入一个接收容器中。在优选实施例中，真空发生器是注射器泵或隔膜泵。在另一优选实施例中，利用相同的真空发生器来将真空施加至第一口部和/或第三口部。

已知的微流体装置不包括用于追踪所述系统中的压力的装置。本发明优选是包括一个或多个压力传感器。压力传感器优选是位于接收容器上游的第三流动通路内。另一压力传感器优选是位于真空发生器下游的第一流动通路内。上述压力传感器可以用于确定由过滤器引起的压力降，该压力降指示过滤器的流体状态。因此，人们可以确定(i)何时完成方法步骤，从而使得时间和缓冲液减至最少(例如，当在干燥步骤中过滤器完全干燥时；当在清洗步骤中过滤器充分清洗了液体残留物时，这优选是在各液体的流动之后和下一个液体的流动之前发生)；(ii)当液体完全流过过滤器时，当由于试样的密度和粘度而对液体流动有增加的阻力时，系统能够“即时”增加吸入压力；(iii)当过滤器堵塞时；以及(iv)各液体流过过滤器所需的时间，这能够与预定界限值比较，作为对提纯方法的控制。

如上所述，这里公开的装置具有用于与腔室连通的三个口部：第一口部(气体出口部)，第二口部(液体进口部)和第三口部(液体/气体出口部)。每个口部能够通过位于相应的流动通路内的阀而单独地打开，关闭或与大气通气。优选是使用多口部阀，且需要时使用相同的多口部阀来驱动两个或三个口部。优选是，由第三流动通路在它的相应阀和过滤器之间包围的死区容积在lμl和10ml之间。通过对合适的口部施加真空以及通过在各步骤中打开和关闭合适的阀而实现液体的受控流动(包括用于过滤器的完全润湿的无流动状态)。与已知装置相比，这给予该装置更高的复制性，而与生物试样类型无关。

例如，在通过真空来人工执行提纯方案的普通提纯套件中，提纯方法包括五个主要步骤，对应于五种不同液体流过过滤器，即：装载包含核酸的试样混合物，利用洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2来洗涤，以便冲洗所述过滤器并除去任何量的污染物，对过滤器进行空气干燥，并除去挥发性污染物的任何痕量，以及进行洗提，以便从过滤器中释放核酸，以便进一步用于下游应用(如qpcr放大和检测)。在各步骤结束时，即使在一定容积的液体已经流过过滤器之后，也保持真空抽吸一或两分钟，以确保在下一液体移液之前几乎没有液体留在过滤器裂缝内，该操作称为“清除”。

为了实现相同的效果，自动方案包括基本上相同的步骤，通过使得各口部连接到合适的储存器上以及通过由压力源(例如注射器或旋转泵)、一组阀、一组微流体通道和使用软件的微控制器来一直施加合适的压力差而实现这些步骤，以使使得所有步骤都自动化。

这里公开的微流体装置特别适合在使得一种或多种分析物与其它组分分离的方法中使用，即在提纯方法中。因此，本发明的另一目的是一种使用这里所述的微流体装置而从复杂生物试样中提纯生物或化学分析物的方法，该方法依次包括以下步骤：(a)通过在腔室和第一储存器之间施加负压差，从而使得液体试样能够通过第二口部进入腔室，而在流动通路内的阀对于第一和第二口部打开，对于第三口部关闭；(b)通过在所述第一接收容器和腔室之间施加负压差，从而使得试样能够流过过滤器进入第一接收容器，而在流动通路内的阀对于第一口部关闭，使得第二口部与大气压通气，并对于第三口部打开；以及(c)通过在腔室和一个接收容器之间施加负压差而从过滤器中洗提分析物，而在流动通路内的阀对于第一和第二口部打开，对于第三口部关闭。

在步骤a中的压力可以由位于第一流动通路中的真空发生器产生。在步骤b中的压力可以由位于第三流动通路中的真空发生器产生。

在步骤c中的洗提可以如下面详细所述来进行：

i)通过在腔室和第三储存器之间施加负压差，从而使得容纳在第三储存器中的洗提缓冲液能够通过第二口部进入腔室，在流动通路内的阀对于第一和第二口部打开，对于第三口部关闭。压力可以由位于第一流动通路中的真空发生器来产生；

ii)使得洗提缓冲液能够与过滤器接触预定时间，在流动通路内的阀对于第一和第二口部打开，对于第三口部关闭。该步骤使得过滤器能够充分润湿，以便释放合适的分析物；以及

iii)通过在所述第二接收容器和腔室之间施加负压差，从而使得洗提缓冲液(包含所释放的分析物)能够流过过滤器进入第二接收容器，而在流动通路内的阀对于第一口部关闭，使得第二口部向大气压通气，且对于第三口部打开。压力可以由第三流动通路的真空发生器来产生。

优选是，该方法还在步骤a和b之间包括使得试样能够与过滤器接触预定时间的步骤，而在流动通路内的阀对于第一和第二口部保持打开，对于第三口部关闭。

该方法可以选择地在步骤b和c之间包括以下步骤中的一个或多个：

(i)通过在第三流动通路和腔室之间施加负压而清洁和干燥过滤器预定时间，所述负压差由位于第三流动通路中的真空发生器来产生，而在流动通路内的阀对于第一口部关闭，使得第二口部与大气压通气，且对于第三口部打开；和/或

(ii)使得位于第二储存器中的洗涤缓冲液能够通过第二口部进入腔室，并通过在所述接收储存器和所述第二储存器之间施加负压差而流过过滤器和进入接收容器，而在流体通路内的阀对于第二和第三口部打开，对于第一口部关闭。压力可以由位于第三流动通路中的真空发生器来产生；和/或

iii)通过在第三流动通路和腔室之间施加负压，从而使得气体能够流过过滤器预定时间，而在流动通路内的阀对于第一口部关闭，使得第二口部与大气压通气，且对于第三口部打开。气体使得液体移出，并干燥过滤器。压力可以由位于第三流动通路中的真空发生器来产生。

优选是，确定压力差，以便确定一个或多个阀转换的时间，并因此执行下一个方法步骤。穿过过滤器的压力降指示能够驱动所述阀以便执行下一个方法步骤。

更优选是，只有当第一和第二压力传感器之间的压力差的一阶导数的值低于预定界限值时，气流才用于干燥过滤器。

表1详述了通过自动装置来进行提纯处理的方法步骤的一个实例。附图中所示的流体图表示了用于各所述步骤的口部/阀设置。

表1.提纯过程的实例的详细方案。

本发明的优点在于可以实现整个自动化，而不需要人工操作来完成提纯处理，从而获得可复制的结果。而且，提纯装置/工艺能够与其它上游或下游装置/工艺(例如，裂解、放大和检测)相关联。与现有技术相反，液体通过施加至第一口部的真空而移动到腔室中和过滤器上，而第三口部关闭。这防止了流过过滤器，同时允许过滤器预润湿预定的培养时间。在打开该口部的阀之后，通过施加至第三口部的真空，使得液体通过过滤器。总之，与已知方法相比，获得了相等或更高的核酸生产。

附图说明

图1表示了来自用于人工提纯的商业套件的提纯柱(1)，它包括塑料本体(2)和隔膜过滤器(3)，该隔膜过滤器(3)通过固定环(10)而被挤压和保持就位。塑料本体包括液体进口(4)和液体出口(5)。

图2a表示了具有集成提纯空腔(101)的微流体装置(100)的一部分和通过固定环(10)而保持就位的隔膜过滤器(3)。

图2b表示了具有集成提纯空腔(101)的微流体装置(100)和通过固定环(10)而保持就位的隔膜过滤器(3)的旋转图。还表示了连接至提纯空腔(101)的气体口部(102)、液体进口部(103)和出口部(104)。

图2c表示了单独的提纯空腔(200)。

图2d表示了组装在微流体装置(100)中的提纯空腔(200)。夹紧结构部(201)将提纯空腔(200)保持就位，并对隔膜过滤器(3)施加正确的挤压。还表示了气体口部(203)、液体进口部(204)和出口部(205)。

图2e表示了在装载液体(步骤1)和洗涤/洗提(步骤2)的过程中口部设置和流动方向。实心箭头表示液体流；虚线箭头表示气体流；x表示由阀关闭的口部。

图3至11：表示了表1中详细介绍的各步骤的口部/阀设置的详细流体图。应当知道，本发明的装置可以但并不必须包括图中所示的每个元件。说明书和/或权利要求说明了基本元件。除了所述元件之外，可以彼此独立地选择一个或多个其它的可选元件。可选元件表示如下。1：真空发生器1(例如注射器泵)；2：真空发生器2(可选的，例如隔膜泵)；3-7：阀(例如多口部阀)；8和9：压力传感器(可选)；10：腔室；11：固定环(可选)；12：过滤器；13：废物接收容器(可选)；14：洗提液接收容器；15：试样储存器；16-17：储存器(可选)；18：洗提缓冲液储存器。