一种增强破乳菌破乳性能的方法与流程

本发明涉及环境微生物技术领域，具体涉及一种增强破乳菌破乳性能的方法。

背景技术：

微生物破乳菌由于其环境友好、对极端条件具有良好的适应性等优势，在石油开采及油田污染控制中具有极大的应用前景。菌体破乳机制的探究对于定向改善菌体破乳效果具有重要的指导意义，关于菌体破乳机制的研究也受到越来越多的关注。大部分研究认为菌体表面的疏水性和带电性是影响破乳的关键因素，由于菌体表面带电性调控手段的限制，较多的研究在于疏水性与破乳活性之间的关系。

目前，调控菌体表面疏水性多通过改变菌体的培养条件来实现。研究表明培养基中碳源、pH、表面活性剂及温度都会影响菌体表面的疏水性通过改变菌体培养的碳源种类，得到疏水性差异的菌体，菌体对水的接触角范围为40～90°。通过改变培养基pH实现菌体表面疏水性的调控，菌体对水的接触角变化范围为50～114°。然而，通过改变培养条件获得的菌体疏水性成本较高、菌体的培养周期长。此外，菌体的表面疏水性仅在较窄的范围内变化(偏亲水性)，并且培养条件变化会引起菌体表面其它性质的变化。因此，需要提出一种能在较宽范围内调控菌体表面疏水性和带电性的方法，并且保证在调控一种表面性质时，另外一种表面性质不受到显著影响。

磁性纳米粒子(Magnetic Nanoparticles,MNPs)与菌体的结合在污染物富集、微生物回收及病毒的快速检测中得到广泛应用。但是利用磁性纳米粒子特殊的表面性质定向调控微生物菌体表面的性质还未有报道。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种能快速、有效调控破乳菌表面疏水性和带电性，从而增强破乳菌破乳性能的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种增强破乳菌破乳性能的方法，该方法包括以下几个步骤：

(1)通过共沉淀法制备Fe₃O₄磁性纳米粒子，并对所得Fe₃O₄磁性纳米粒子进行修饰，得到疏水性磁性纳米粒子或带电性磁性纳米粒子；

(2)培养生物破乳菌，得到菌悬液；

(3)将步骤(1)所得疏水性磁性纳米粒子或带电性磁性纳米粒子中的一种与步骤(2)所得菌悬液按质量比(0.1～0.4):1混合，得到破乳性能强的磁响应破乳菌；

(4)在外磁场作用下促使磁响应破乳菌破乳。

通过疏水性磁性纳米粒子、带电性磁性纳米粒子对破乳菌进行修饰，使得菌体对水的接触角(疏水性表征)可以实现85～125°范围内调控或菌体表面带电性可以实现在-40～-17mV范围内调控，优选菌体对水的接触角(疏水性表征)可以实现95～115°范围内调控，菌体表面带电性可以实现在-30～-20mV范围内调控。接触角处于此范围内，磁响应破乳菌能最快地迁移到油水界面发挥作用，因而有利于破乳速率的提高；Zeta电位处于此范围内时，菌体会产生一定程度的团聚，这种团聚状态有利于菌体在界面发挥架桥作用，并且显著改善菌体的沉降性能，因而有利于脱水效果的改善。因此，菌体表面性质在此范围内时，乳菌破乳半衰期缩短，极大地加快了破乳速率；脱出水透射光从5％上升至70％，表明脱出水质量得到极大改善。

所述的共沉淀法为：将FeCl₃和FeSO₄在氨水作用下，共沉淀得到Fe₃O₄磁性纳米粒子，其中，FeCl₃和FeSO₄的摩尔比为1：(1.5～2.5)。

所述疏水性磁性纳米粒子的制备包括以下步骤：将Fe₃O₄磁性纳米粒子与正硅酸四乙酯按2g：(0.5～2)mL的比例混合，得到二氧化硅修饰的磁性纳米粒子Fe₃O₄@SiO₂；然后将Fe₃O₄@SiO₂与硅烷化试剂按2g：(8～15)mL的比例进行混合，得到疏水性磁性纳米粒子。

所述Fe₃O₄磁性纳米粒子与正硅酸四乙酯的混合温度为20～30℃，混合时间为5～10h，搅拌速率为400～800rpm；

所述Fe₃O₄@SiO₂与硅烷化试剂的混合温度为20～30℃，混合时间为5～10h，搅拌速率为400～800rpm。

所述硅烷化试剂中碳链长度为1～16。

所述带电性磁性纳米粒子的制备包括以下步骤：将Fe₃O₄磁性纳米粒子与正硅酸四乙酯按2g：(0.5～2)mL的比例进行混合，得到二氧化硅修饰的磁性纳米粒子Fe₃O₄@SiO₂；然后将Fe₃O₄@SiO₂与四乙烯二胺按按1g：(0.5～2)mL的比例进行混合，得到带电性磁性纳米粒子。

所述Fe₃O₄磁性纳米粒子与正硅酸四乙酯的混合温度为20～30℃，混合时间为5～10h，搅拌速率为400～800rpm；

所述Fe₃O₄@SiO₂与四乙烯二胺的混合温度为20～30℃，混合时间为5～10h，搅拌速率为400～800rpm。

不同碳链长度的硅烷化试剂会表现不同程度的疏水性，将这些硅烷化试剂嫁接到磁性纳米粒子表面能实现具有梯度疏水性的磁性纳米粒子。由于硅烷化试剂不能直接与Fe₃O₄磁性纳米粒子结合，而硅烷化试剂与二氧化硅能进行特异性化学反应，因而先把二氧化硅通过-OH间的反应覆盖到Fe₃O₄表面，然后与硅烷化试剂反应，就可以合成稳定的具有梯度疏水性的磁性纳米粒子。

分子中氨基的含量越高，其具有的正电效应会越显著，为了合成带较高正电荷的磁性纳米粒子，需要将带有多个氨基官能团的分子结合到磁性纳米粒子表面。四乙烯二胺分子具有四个氨基，并且能与缩水甘油醚之间发生特异性反应。利用这种反应原理，及缩水甘油醚与二氧化硅之间的特异性化学反应，先包裹二氧化硅，然后进行四乙烯二胺的覆盖，就能实现对磁性纳米粒子表面带电性的调控。

这两种合成方法操作较简单，制备过程中磁性纳米粒子的损失较少，并且能实现磁性纳米粒子疏水性和带电性在较大范围的变化。

所述破乳菌为细胞具有破乳活性的产碱杆菌。

步骤(3)所述混合的条件为：在1500～3000rpm的条件下漩涡振荡80～100s。

破乳菌表面带有丰富的基团，表现出一定程度的疏水性，并且带有较大的负点性。疏水性的磁性纳米粒子与疏水性的磁性纳米粒子在疏水性作用力下进行较稳定的结合；带正电荷的磁性纳米粒子与带负电荷的磁性纳米粒子在静电引力的作用下进行较稳定的结合。

步骤(4)所述破乳的条件为：磁场强度为0.5～2T，破乳时间为10～15h，磁响应破乳菌的浓度为500～1000mg/L。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几方面：

(1)实现了菌体破乳性能的强化，加快了菌体破乳速率，改善了菌体脱水质量；

(2)能够实现对破乳菌关键表面性质疏水性和带电性的单一调控，从而快速、有效调控菌体表面疏水性和带电性。

附图说明

图1为疏水性磁性纳米粒子对破乳菌破乳效果的影响结果；

图2为带电性磁性纳米粒子对破乳菌破乳效果的影响结果；

图3为单纯破乳菌的半衰期检测结果。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

高效生物破乳菌产碱杆菌筛选于克拉玛依油田长期受石油污染的土壤，保存在斜面培养基上，将保藏菌种活化后接种至100mL肉汤培养基富集培养72h，再将10mL培养液接入100mL发酵培养基中培养7d，培养后将菌株的全培养液在12000rpm下高速离心10min，获得湿菌，使用正己烷洗提离心三次，冷冻干燥24h得到菌体干粉。

磁性纳米粒子的制备：分别称取5.56g FeSO₄·7H₂O和11.6g FeCl₃·6H₂O在N₂吹脱下于500rpm条件下溶于350mL超纯水中；快速加入20mL的浓氨水(25％)，搅拌6h。去离子水洗三遍，磁铁回收得到Fe₃O₄磁性纳米粒子。将得到的Fe₃O₄磁性纳米粒子分散到混合液(120mL乙醇、30mL超纯水、2mL氨水)中，超声5min。在上述溶液中加入4mL正硅酸四乙酯再超声5min，机械搅拌6h(500rpm)；外磁场收集，制得二氧化硅修饰的磁性纳米粒子Fe₃O₄@SiO₂。

修饰合成具有不同疏水性和带电性系列的纳米粒子：将Fe₃O₄@SiO₂分散到100mL甲苯中，加入10mL不同碳链长度的硅烷化试剂，超声5min，机械搅拌6h(500rpm)；磁铁回收，乙醇清洗后40℃下烘干即得疏水性系列的磁性纳米粒子Fe₃O₄@Cn。将Fe₃O₄@SiO₂分散到100mL甲苯中，加入4mL硅烷化试剂(KH560)，90℃条件下搅拌6h。乙醇清洗，磁铁回收后再分散于100mL甲苯中，加入0.2～2mL三乙烯四胺溶液，超声5min，机械搅拌6h(500rpm)；磁铁回收，乙醇清洗、超纯水清洗后磁铁回收，冷冻干燥得到带电性系列的磁性纳米粒子Fe₃O₄@NH₂。

对破乳菌表面疏水性和带电性进行调控。将疏水性磁性纳米粒子或带电性修饰的磁性纳米粒子与破乳菌分别按照质量比为(0.1～0.4):1在2000rpm条件下漩涡混匀90s，即得到表面性质梯度变化的磁响应性破乳菌。将得到的疏水性梯度变化的磁响应破乳菌进行接触角测试；将带电性修饰梯度变化的磁响应破乳菌进行Zeta电位的测试。对于接触角的测试，将制得的磁响应破乳菌悬液烘干，利用真空油压机在15Mpa条件下将干燥的磁响应破乳菌压成薄片。将制得的薄片置于载玻片上，进行对空气和水的接触角测定。对于Zeta电位的测定，将制得的磁响应破乳菌悬液调至OD600nm为1.0左右，pH调至中性条件下，进行Zeta电位的测定。

磁响应破乳菌的破乳效果：疏水性和带电性修饰的磁响应破乳菌的破乳效果主要通过破乳率和破乳速率来表征。将疏水性和带电性修饰的纳米粒子悬液与菌悬液以质量比为(0.1～0.4):1在转速为2000rpm条件下漩涡混匀90s，取1mL混合液和9mL乳状液于20mL的刻度玻璃试管中上下震荡120次使磁响应破乳菌与乳状液充分混合。将乳状液置于Turbiscan专用玻璃容器中，在35℃条件下测试12h，根据背散射光计算破乳率和破乳半衰期。

实施例1

由图1可知，利用磁性纳米粒子实现了对破乳菌表面疏水性的调控，并且发现不同疏水性程度修饰的磁响应破乳菌破乳率差异较小，破乳速率差异较大。磁响应破乳菌破乳速率随疏水性呈现先上升后下降的规律，当菌体对水的接触角在95～115°范围内，菌体破乳速率得到改善；用M@C9修饰的破乳菌接触角值为105°，破乳速率最快，加快了约1.0h。破乳速率的改善表明：在相同时间内可处理的乳状液体积增加，这对于调高破乳效率，降低破乳成本具有重要的意义。

实施例2

由图2可知，利用磁性纳米粒子实现了对破乳菌表面带电性的调控，并且发现不同带电性修饰的磁响应破乳菌，破乳率和破乳速率都呈现较大差异。当磁响应破乳菌Zeta电位低于-25mV时，磁响应破乳菌破乳率和破乳速率较高；当磁响应破乳菌Zeta电位超过-25mV时，菌体破乳率和破乳速率显著下降，其中破乳率降低15％，破乳速率减慢1.0h。因此对于磁响应破乳菌而言，适于破乳的带电性范围为-30～-20mV时，此时在维持较高破乳率的前提下破乳速率相对于菌体提高0.5h。

对比例

采用与实施例1相同的菌种以及破乳条件，但菌种未经过磁性纳米粒子的修饰。分别设置了两组试验B1和B2测试菌体的破乳结果，其结果如图3所示。从图中可以看出，未经过磁性纳米粒子修饰的菌种，其破乳半衰期为3h，说明本发明的破乳方法可以有效缩短破乳菌的破乳半衰期。

实施例3

一种增强破乳菌破乳性能的方法，包括以下几个步骤：

(1)将FeCl₃和FeSO₄在氨水作用下，共沉淀得到Fe₃O₄磁性纳米粒子，其中，FeCl₃和FeSO₄的摩尔比为1：1.5，然后将Fe₃O₄磁性纳米粒子与正硅酸四乙酯按2g：0.5mL的比例混合，得到二氧化硅修饰的磁性纳米粒子Fe₃O₄@SiO₂；然后将Fe₃O₄@SiO₂与硅烷化试剂按2g：8mL的比例进行混合，得到疏水性磁性纳米粒子，其中，Fe₃O₄磁性纳米粒子与正硅酸四乙酯的混合温度为20℃，混合时间为10h，搅拌速率为400rpm；所述Fe₃O₄@SiO₂与硅烷化试剂的混合温度为20℃，混合时间为10h，搅拌速率为400rpm，所述硅烷化试剂中碳链长度为1；

(2)培养产碱杆菌，得到菌悬液；

(3)将步骤(1)所得疏水性磁性纳米粒子或带电性磁性纳米粒子中的一种与步骤(2)所得菌悬液按质量比0.1:1混合，得到破乳性能强的磁响应破乳菌，其中，混合的条件为：在1500rpm的条件下漩涡振荡80s；

(4)在外磁场作用下促使磁响应破乳菌破乳，其中，破乳的条件为：磁场强度为0.5T，破乳时间为10h，磁响应破乳菌的浓度为500mg/L。

实施例4

一种增强破乳菌破乳性能的方法，包括以下几个步骤：

(1)将FeCl₃和FeSO₄在氨水作用下，共沉淀得到Fe₃O₄磁性纳米粒子，其中，FeCl₃和FeSO₄的摩尔比为1：2.5，然后将Fe₃O₄磁性纳米粒子与正硅酸四乙酯按2g：2mL的比例混合，得到二氧化硅修饰的磁性纳米粒子Fe₃O₄@SiO₂；然后将Fe₃O₄@SiO₂与硅烷化试剂按2g：15mL的比例进行混合，得到疏水性磁性纳米粒子，其中，Fe₃O₄磁性纳米粒子与正硅酸四乙酯的混合温度为30℃，混合时间为5h，搅拌速率为800rpm；所述Fe₃O₄@SiO₂与硅烷化试剂的混合温度为30℃，混合时间为5h，搅拌速率为800rpm，所述硅烷化试剂中碳链长度为16；

(2)培养产碱杆菌，得到菌悬液；

(3)将步骤(1)所得疏水性磁性纳米粒子或带电性磁性纳米粒子中的一种与步骤(2)所得菌悬液按质量比0.4:1混合，得到破乳性能强的磁响应破乳菌，其中，混合的条件为：在3000rpm的条件下漩涡振荡100s；

(4)在外磁场作用下促使磁响应破乳菌破乳，其中，破乳的条件为：磁场强度为2T，破乳时间为15h，磁响应破乳菌的浓度为1000mg/L。

实施例5

一种增强破乳菌破乳性能的方法，包括以下几个步骤：

(1)将FeCl₃和FeSO₄在氨水作用下，共沉淀得到Fe₃O₄磁性纳米粒子，其中，FeCl₃和FeSO₄的摩尔比为1：1.5，然后将Fe₃O₄磁性纳米粒子与正硅酸四乙酯按2g：0.5mL的比例进行混合，得到二氧化硅修饰的磁性纳米粒子Fe₃O₄@SiO₂；然后将Fe₃O₄@SiO₂与四乙烯二胺按按1g：0.5mL的比例进行混合，得到带电性磁性纳米粒子。其中，Fe₃O₄磁性纳米粒子与正硅酸四乙酯的混合温度为20℃，混合时间为10h，搅拌速率为400rpm；所述Fe₃O₄@SiO₂与四乙烯二胺的混合温度为30℃，混合时间为10h，搅拌速率为400rpm。

(2)培养产碱杆菌，得到菌悬液；

(3)将步骤(1)所得疏水性磁性纳米粒子或带电性磁性纳米粒子中的一种与步骤(2)所得菌悬液按质量比0.1:1混合，得到破乳性能强的磁响应破乳菌，其中，混合的条件为：在1500rpm的条件下漩涡振荡80s；

(4)在外磁场作用下促使磁响应破乳菌破乳，其中，破乳的条件为：磁场强度为0.5T，破乳时间为10h，磁响应破乳菌的浓度为500mg/L。

实施例6

一种增强破乳菌破乳性能的方法，包括以下几个步骤：

(1)将FeCl₃和FeSO₄在氨水作用下，共沉淀得到Fe₃O₄磁性纳米粒子，其中，FeCl₃和FeSO₄的摩尔比为1：2.5，然后将Fe₃O₄磁性纳米粒子与正硅酸四乙酯按2g：2mL的比例进行混合，得到二氧化硅修饰的磁性纳米粒子Fe₃O₄@SiO₂；然后将Fe₃O₄@SiO₂与四乙烯二胺按按1g：2mL的比例进行混合，得到带电性磁性纳米粒子。其中，Fe₃O₄磁性纳米粒子与正硅酸四乙酯的混合温度为30℃，混合时间为5h，搅拌速率为800rpm；所述Fe₃O₄@SiO₂与四乙烯二胺的混合温度为30℃，混合时间为5h，搅拌速率为800rpm。

(2)培养产碱杆菌，得到菌悬液；

(3)将步骤(1)所得疏水性磁性纳米粒子或带电性磁性纳米粒子中的一种与步骤(2)所得菌悬液按质量比0.4:1混合，得到破乳性能强的磁响应破乳菌，其中，混合的条件为：在3000rpm的条件下漩涡振荡100s；

(4)在外磁场作用下促使磁响应破乳菌破乳，其中，破乳的条件为：磁场强度为2T，破乳时间为15h，磁响应破乳菌的浓度为1000mg/L。