利用水包油型固体乳化制备不同粒径多孔β‑TCP微球的方法与流程

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种利用水包油型固体乳化制备不同粒径多孔β-TCP微球的方法。

背景技术：

治疗因先天性疾病、意外、组织病变等造成的骨组织损伤是骨科的一个重大难题。骨组织损伤造成的自体不能愈合或愈合困难，衍生了很多的治疗方法以达到病人正常的生命活动。传统的治疗方法包括软骨钻孔术、自体或异体软骨移植术等。但这些方法都有各自的缺陷，难以在临床广泛应用。骨组织工程支架应运而生，其克服或改进了以上的困难，为解决骨组织损伤的患者带来了福祉。

磷酸钙是人体硬组织中的一种重要无机成分，广泛存在于牙齿和骨部位。磷酸钙陶瓷由于其突出的生物相容性、生物活性和骨诱导性，经常被用作骨移植替代材料。β-TCP作为一种磷酸钙陶瓷，与天然骨基质有相似的组成，并且生物相容性良好以及可降解，在体内可以以体液介导和细胞介导的方式降解，其降解产物能参与生命活动和代谢，成为有生命组织的一部分。

β-TCP陶瓷在骨组织工程中，可由粉末、微球、大块支架等形式进行应用。粉末形式的应用通常缺乏气孔，不能为细胞提供良好的生长场所以及营养运输。传统的β-TCP大块支架由于其脆性，而不能切割成特殊的形状以应用于不规则的骨缺损。而微球形式正好能克服以上的缺陷，此外微球还具有大的比表面积，可塑性并且可用于载药，能给细胞提供良好的场所和营养运输。因此制备β-TCP微球并将其应用于骨组织损伤治疗成为了当今时代的热点。

微球的研究开始多以实心微球为主，例如PEREZ R A等人[Tissue.Eng.Regen.Med.,2013,7:353.]通过将α-TCP骨水泥加入到植物油中，用乳化法制备得到实心微球，所得的微球比表面积小，气孔率低。Bernhardt等人[Sci-Mater.Med.,2013,24,1755]以含有HA粉末的海藻酸盐溶胶通过离子型凝胶作用成球,再在650℃下烧除海藻酸盐得到表面有大孔结构的HA微球。

尽管近年来制备不同粒径而保持多孔结构的微球方法不时有所报道，但有些方法存在过于复杂、成本高、会引入抗原性物质以及成功率低等问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服当前β-TCP微球制备过程中存在的上述不足和问题，利用水包油型固体乳化制备得到了不同粒径的多孔β-TCP微球，该方法操作简单、成功率高且不会引入新的杂质。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

利用水包油型固体乳化制备不同粒径多孔β-TCP微球的方法，包括以下步骤：(a)将硝酸钙溶液和磷酸氢铵溶液混合反应，调节溶液pH至中性，分离得羟基磷灰石前驱体；(b)将聚乙烯醇缩丁醛(PVB)溶于有机溶剂中得聚乙烯醇缩丁醛溶液，将羟基磷灰石前驱体分散到聚乙烯醇缩丁醛溶液中得混合溶液，将混合溶液滴加到搅拌状态下的聚乙烯醇(PVA)溶液中，分离得前驱体微球；(c)前驱体微球烧结即得多孔β-TCP微球。

进一步的，步骤(a)具体为将磷酸氢铵溶液缓慢滴加到硝酸钙溶液中，反应物硝酸钙与磷酸氢铵的摩尔比为3:2。

进一步的，所述硝酸钙溶液的浓度为0.5mol/L-2mol/L，所述磷酸氢铵溶液的浓度为0.3mol/L-1.2mol/L。

进一步的，步骤(a)中用氨水将溶液pH调至中性后陈化24-48h，接着过滤并用去离子水洗涤得沉淀，将沉淀置于-40℃至56℃干燥24-48h得羟基磷灰石前驱体。

进一步的，步骤(b)中羟基磷灰石前驱体与聚乙烯醇缩丁醛的质量比为6：3-2。

进一步的，步骤(b)中聚乙烯醇溶液与混合溶液的体积比为100:2-4。

进一步的，步骤(b)中将聚乙烯醇缩丁醛溶于二氯甲烷中得到浓度为25-50g/L的聚乙烯醇缩丁醛溶液，所述聚乙烯醇溶液的质量分数为1％。

进一步的，步骤(b)中在4-8℃、200-500rpm的搅拌速度下，将混合溶液滴加到聚乙烯醇溶液中，滴加完成后过滤并用去离子水洗涤固体颗粒，将固体颗粒置于-40℃至56℃干燥24-48h得前驱体微球。

进一步的，步骤(c)中烧结过程具体为：首先将前驱体微球以2℃/min的升温速率从室温升至600℃，保温2h；接着以5℃/min的升温速率升至1100℃，保温2小时；最后冷却至室温。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)制得的β-TCP微球具有不同的粒径和多孔结构、较大的比表面积和良好的生物相容性；(2)通过控制油相浓度以及转速达到控制微球粒径的目的，因此根据不同要求可制备不同粒径的微球，操作简便、产量高；(3)制备得到的β-TCP微球应用广泛，可用于载药和注射以及生物支架材料和不规则骨组织损伤修复材料等方面。

附图说明

图1是本发明实施例1制备的β-TCP多孔微球的X射线衍射图。

图2是本发明实施例1制备的β-TCP多孔微球的场发射扫描电子显微镜照片。

图3是本发明实施例2制备的β-TCP多孔微球的场发射扫描电子显微镜照片。

图4是本发明实施例3制备的β-TCP多孔微球的场发射扫描电子显微镜照片。

图5是本发明实施例4制备的β-TCP多孔微球的场发射扫描电子显微镜照片。

图6是本发明实施例4制备的β-TCP多孔微球中某单个微球的场发射扫描电子显微镜照片。图7是本发明实施例4制备的β-TCP多孔微球中某单个微球的表面场发射扫描电子显微镜(SEM)照片。

具体实施方式

为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体实施例进行进一步说明。

实施例1

称取3.9618g(NH4)₂HPO₄、11.8075gCa(NO₃)₂·4H₂O分别溶于去离子水中，用100mL容量瓶定容。将100mL(NH4)₂HPO₄溶液由分液漏斗缓慢滴加到90mLCa(NO₃)₂溶液中，用氨水调节溶液的pH＝7。溶液陈化24小时后过滤，将所得沉淀用去离子水洗涤5次，将沉淀放入-21℃冰箱中进行冷冻干燥，得到纳米级别的羟基磷灰石前驱体。称取0.5g PVB溶于10mL二氯甲烷溶剂中，搅拌12小时，再称取1g羟基磷灰石前驱体加入到溶液中，继续搅拌3小时，得到浆料。将5gPVA溶于500mL去离子水中得PVA溶液，在8℃、转速为200rpm条件下，将浆料滴加到PVA溶液中，搅拌3小时后过滤，用去离子水洗涤5次，所得固体采用和前述同样方式冷冻干燥后得到前驱体微球。将前驱体微球置于马弗炉中烧结得到多孔β-TCP微球，烧结程序为：从室温升温至600℃的升温速率为2℃/min，600℃保温2小时，再从600℃以5℃/min的速率升温至1100℃，1100℃保温2小时，最后冷却至室温。

图1是本发明实施例1制备得到的多孔β-TCP微球的X射线衍射(XRD)图。该XRD图正好对应PDF卡片09-0169，说明此微球的化学成分为β-TCP。图2为本发明实施例1所制得的多孔β-TCP微球的SEM图，该图显示其粒径在400-500um。

实施例2

称取0.5g PVB溶于15mL二氯甲烷中溶剂中，搅拌12小时，再称取1g实施例1制得的羟基磷灰石前驱体加入到溶液中，搅拌3小时，得到浆料。将5gPVA溶于500mL的去离子水中得PVA溶液，在8℃、转速为200rpm条件下，将浆料滴加到PVA溶液中，搅拌3小时后过滤，用去离子水洗涤5次，所得固体冷冻干燥后得到前驱体微球。将前驱体微球置于马弗炉中烧结得到多孔β-TCP微球，烧结程序为：从室温升温至600℃控制升温速率为2℃/min，600℃保温2小时，再以5℃/min的升温速率从600℃升温至1100℃，保温2小时，最后冷却至室温。

图3是本发明实施例2制得的多孔β-TCP微球的SEM图，该图显示其粒径在150-200um。

实施例3

称取0.5g PVB溶于10mL二氯甲烷溶剂中，搅拌12小时，再称取1g实施例1制得的羟基磷灰石前驱体加入到溶液中，搅拌3小时，得到浆料。将5gPVA溶于500mL的去离子水中得PVA溶液，在8℃、转速为400rpm条件下，将浆料滴加到PVA溶液中，搅拌3小时后过滤，用去离子水洗涤5次，所得固体冷冻干燥后得到前驱体微球。将前驱体微球置于马弗炉中烧结得到多孔β-TCP微球，烧结程序为：从室温升温至600℃控制升温速率为2℃/min，600℃保温2小时，再以5℃/min的升温速率从600℃升温至1100℃，保温2小时，最后冷却至室温。

图4是本发明实施例3制得的多孔β-TCP微球的SEM图，该图显示其粒径在200-250um。

实施例4

称取0.5g PVB溶于15mL二氯甲烷溶剂中，搅拌12小时，再称取1g实施例1制得的羟基磷灰石前驱体加入到溶液中，搅拌3小时，得到浆料。将5gPVA溶于500mL的去离子水中得PVA溶液，在8℃、转速为400rpm条件下，将浆料滴加到PVA溶液中，搅拌3小时后过滤，用去离子水洗涤5次，所得固体冷冻干燥后得到前驱体微球。得到多孔β-TCP微球，烧结程序为：从室温升温至600℃控制升温速率为2℃/min，600℃保温2小时，再以5℃/min的升温速率从600℃升温至1100℃，保温2小时，最后冷却至室温。

图5是本发明实施例4制得的多孔β-TCP微球的SEM图，该图显示其粒径在50-100um。图6和图7分别为实施例4所制得的β-TCP微球在放大倍数为500和5000下的SEM图，可惜清晰的观察到微球表面的多孔结构。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式的改变，这些均属于本发明的保护之内。