微流体装置及其用图
【专利说明】微流体装置及其用途
[0001] 政府支持
[0002] 本发明是由空海作战系统司令部（Space and Naval Warfare Systems Command) 资助的基金No. N66001-11-1-4182下的政府支持来完成的。政府在本发明中具有一些权 利。
[0003] 相关申请
[0004] 本申请要求于2012年9月21日提交的美国临时申请No. 61/704, 128的权益。通 过引用将该申请的全部教导并入本发明中。
【背景技术】
[0005] 用于细胞分离的常规的大规模方法包括使用膜基过滤器的物理过滤法，以及利用 细胞尺寸、变形性和密度的不同来过滤掉靶细胞的密度梯度离心法。这些技术是劳动密集 型的，并且需要多步骤的样品制备，这可能引入人工因素，或者导致期望细胞的损失。膜过 滤法还容易遇到堵塞问题，需要经常进行清理。此外，也有报道证明经过过滤和离心技术 的靶细胞具有机械应力引入的在初始表型上的变化。最近，探讨了将惯性微流体装置作 为无过滤器的尺寸基细胞分级方法。参见Di Carlo D. Inertial microfluidics. Lab on a chip.2009;9(21):3038_46;Kuntaegowdanahalli SS 等，Lab on a chip.2009;9(20); 2973-80 ;Bhagat AAS 等，Biomedical Microdevices· 2010 ;12 (2):187-95。
[0006] 然而，仍然需要开发可使细胞损失最小并维持初始靶细胞表型用于后续分析的更 简单并且更高效的技术来处理血液样品。
【发明内容】
[0007] 本发明总体涉及用于颗粒聚集和混合的具有弯曲微通道的微流体装置，所述弯曲 微通道具有非矩形横截面。在一个具体方面中，本发明涉及这样的微流体装置，其包括至少 一个入口以及曲线微通道，所述曲线微通道具有由径向内边、径向外边、底边和顶边限定的 梯形横截面，所述横截面具有a)高度不等的所述径向内边和所述径向外边，或b)高度与所 述径向外边的高度相等的所述径向内边，并且其中所述顶边具有宽度与所述底边各不相等 的至少两个连续的直区段。所述微流体装置还包括至少一个出口。在某些方面中，所述微 流体装置包括两个出口。在一些方面中，所述微流体装置包括单个的入口。
[0008] 在一些方面中，所述微流体装置的所述横截面可具有（a)大于所述径向外边高度 的所述径向内边高度，或（b)小于所述径向外边高度的所述径向内边高度，或（C)包括形成 阶形剖面的至少一个阶梯的所述顶边，或（d)包括处于所述径向内边与所述径向外边之间 的至少一个浅区的所述顶边。所述梯形横截面可为直角梯形横截面。在某些方面中，所述 梯形横截面的所述顶边及/或底边可为弯曲的，该弯曲可为凸起或凹陷。
[0009] 在另一些方面中，所述梯形横截面的所述径向内边和所述径向外边的高度可为约 20微米（μ m)至约200 μ m。在某些方面中，所述梯形横截面的所述顶边和所述底边的宽度 可为约100 μ m至约2000 μ m。
[0010] 在一个方面中，所述曲线微通道可为螺旋微通道。另一方面，所述曲线微通道可为 蛇形微通道。所述曲线微通道可具有约2. 5mm至约25mm的曲率半径，以及约4cm至约IOOcm 的长度。
[0011] 另一方面，本发明涉及按尺寸从颗粒混合物分离一个或多个颗粒的方法。所述方 法包括将所述混合物引入微流体装置的至少一个入口，所述微流体装置包括曲线微通道， 所述曲线微通道具有由径向内边、径向外边、底边和顶边限定的梯形横截面，所述横截面具 有小于所述径向外边高度的径向内边高度，以基于粒度沿着所述微通道的所述横截面的部 分分离颗粒的流率来进行所述引入，其中较大的颗粒沿着所述微通道的所述径向内边流至 第一出口，并且较小的颗粒沿着所述微通道的其它部分流到至少一个其它出口，从而按尺 寸从所述混合物分离所述颗粒。所述方法还可包括从所述第一出口收集根据尺寸分离的颗 粒。在一个方面中，所述流率可为约0. 5mL/min至约7. 5mL/min。在一些方面中，所述颗粒 可为细胞，例如干细胞。
[0012] 在一个具体方面中，所述流率可为约2. 5mL/min，所述较大颗粒的直径可为约 18 μ m至约40 μ m，并且所述较小颗粒的直径可为约10 μ m至约20 μ m。在另一个具体方面 中，所述流率可为约I. 5mL/min，所述较大颗粒的直径可为约15 μ m至约25 μ m，并且所述较 小颗粒的直径可为约5 μπι至约10 μπι。在另一个具体方面中，所述流率可为约2. 5mL/min 至约3. OmL/min，所述较大颗粒的直径可为约25 μ m至约40 μ m，并且所述较小颗粒的直径 可为约5 μ m至约15 μ m。
[0013] 另一方面，所述细胞混合物可为血液样品，并且所述较大细胞可为循环肿瘤细胞 (CTC)，并且所述较小细胞可为血细胞。在一个方面中，可将流率适配为在约8分钟内按尺 寸分离约7. 5mL的血液。另一方面，所述较大细胞可为白细胞，并且所述较小细胞可为血细 胞。另一方面，所述混合物可为骨髓样品，其中可从血细胞分离干细胞。
[0014] 另一方面，本发明涉及从混合物浓缩细胞的方法。所述方法包括将所述混合物引 入微流体装置的至少一个入口，所述微流体装置包括曲线微通道，所述曲线微通道具有由 径向内边、径向外边、底边和顶边限定的梯形横截面，所述横截面具有大于所述径向外边高 度的径向内边高度，以沿着所述微通道的所述横截面的所述径向内边分离所述细胞，并以 将它们导向第一出口的速率来进行所述引入，从而从所述混合物浓缩所述细胞。所述方法 可包括从所述第一出口收集浓缩的细胞。在一些具体方面中，所述流率可为约0. 5mL/min 至约 10mT ,/mi η 〇
[0015] 另一方面，本发明涉及从混合物过滤粒子的方法。所述方法包括将包含粒子的混 合物引入微流体装置的至少一个入口，所述微流体装置包括曲线微通道，所述曲线微通道 具有由径向内边、径向外边、底边和顶边限定的梯形横截面，所述横截面具有大于所述径向 外边高度的径向内边高度，以沿着所述微通道的所述横截面的所述径向内边分离粒子并将 它们导向第一出口的速率来进行所述引入，从而从所述混合物中分离所述粒子。在一些方 面中，所述混合物可为水。所述方法可包括从所述第一出口收集颗粒。在一些具体方面中， 所述流率可为约〇. 5mL/min至约10mL/min。
[0016] 另一方面，本发明涉及将细胞分布于混合物中的方法。所述方法包括将所述混合 物引入所述微流体装置的至少一个入口，所述微流体装置包括曲线微通道，所述曲线微通 道具有由径向内边、径向外边、底边和顶边限定的梯形横截面，所述横截面包括形成阶形剖 面的至少一个阶梯的所述顶边，以沿着所述阶形剖面的部分来分布细胞的流率进行所述引 入，其中细胞在分布至分离出口之前、期间或之后都不撞击所述边，从而将所述细胞分布于 所述混合物中。所述方法可包括从所述分离出口收集经分布的细胞。在一些具体方面中， 所述流率可为约2mL/min至约10mL/min。
[0017] 另一方面，本发明涉及将细胞混合于液体中的方法。所述方法包括将液体和细胞 引入所述微流体装置的至少一个入口，所述微流体装置包括曲线微通道，所述曲线微通道 具有由径向内边、径向外边、底边和顶边限定的梯形横截面，所述横截面的所述顶边包括处 于所述径向内边与所述径向外边之间的至少一个浅区，以沿着所述微通道混合细胞并将所 述混合物导向第一出口的流率进行所述引入。所述方法可包括从所述第一出口收集所述混 合物。在一些具体方面中，所述流率可为约0. lmL/min至约2mL/min。
[0018] 本发明具有许多优点，包括分辨率比用现有微流体装置可得分辨率更高的分离。 通道尺寸的大小一般大于颗粒直径的3倍，这不仅使该装置不会受到堵塞问题影响并且具 有高通量，而且还降低了制造成本。这些优点显示了弯曲微流体装置在未来的广泛应用。此 外，对于通道形状的变化，这里描述的本发明在此提供了相对于传统的矩形弯曲微通道的 许多明显优点。特别是对于高分辨率颗粒分离的应用，根据颗粒的直径和流率沿着内侧和 外侧将它们分成两条主流。该类型装置能够达到传统矩形通道无法企及的高分辨率高通量 分离。
【附图说明】
[0019] 通过如在附图中所示的对本发明示例性实施例的如下更具体描述，前述内容将变 得显而易见，其中在所有不同附图中相同的附图标记指相同的部件。附图不一定是成比例 的，相反重点在于描述本发明的实施例。
[0020] 图IA和图IB示出了两种典型的曲线微通道的顶视图的示意图（图IA :螺旋形，图 IB :蛇形）。左边示出了螺旋微通道的剖切图。通道的宽度一般大于深度。矩形横截面通 道中的迪恩流（Dean flow)具有从内侧流向外侧的主流，以及与顶壁和底壁平行的流。在 迪恩流和惯性上升的影响下，颗粒将聚集于具有更低迪恩流的通道内半侧。通过诸如通道 尺寸、纵横比、曲率半径、颗粒直径和流率等参数来控制颗粒位置。
[0021] 图2a至图2d是弯曲通道的不同横截面的示意图。图2a):具有较深内侧（曲率 中心附近）和浅外侧的弯曲微通道。两个迪恩涡心向内侧倾斜，使颗粒陷于其中。这种类 型的微通道可用于颗粒浓缩和过滤；图2b):具有浅内侧和较深外侧的弯曲微通道。两个 涡心向外侧倾斜，并且能够使一些较小直径的颗粒陷于其中，可应用于基于尺寸的分离；图 2c):在具有类阶梯形横截面的弯曲微通道中，颗粒陷于阶梯的角落；图2d):具有夹在中间 的浅区的弯曲微通道，产生复杂的迪恩流和惯性上升分布，阻止颗粒聚集或困陷。这样的通 道可用作混合机。
[0022] 图3A和图3B是具有单个入口和两个出口管的实际梯形横截面螺旋微流体装置的 照片。图3A中示出了填充了用于显示的染料的通道。该装置由经等离子体结合的两个PDMS 层制成，其中具有螺旋模式的一层由经微磨的PMM模具铸造。图3B示出了剖切图。通道 的宽度为600 μπι，内高度（底）为80μπι，并且外高度（顶）为140ym。
[0023] 图4A至图4H示出了以下出口处的荧光珠分布比较的顶视图，图4A至图4D):高 度80 μ m宽度600 μ m的矩形横截面螺旋微通道，并且图4E至图4H)如图IA中描述的梯形 横截面螺旋微通道，流率从0. 5mL/min (左）升高至7. 5mL/min (右）。所示珠的直径为：图 4A和图4E)中为5·78μπι，图4B和图4F)中为mum，图4C和4G)中为Ιδ.δμπι，图4D 和图4Η)中为26. 25 μ m。
[0024] 图5是与实验结果比较的横跨梯形横截面螺旋通道的迪恩流场的计算流体动力 学（CFD)的模拟结果，表示螺旋通道横截面中颗粒的力平衡位置。箭头标出了迪恩流的方 向和大小，图谱表示迪恩流的大小。点来自实验结果的26. 25 μπι珠的位置。
[0025] 图6Α至图6D示出了使用具有梯形横截面的螺旋通道从新鲜人血中分离嗜中性 粒细胞的结果和照片。图 6Α):使用 Mono-Poly Resolving Medium(Catalog#1698049，MP Biomedicals)从新鲜人血中分离的主要为嗜中性粒细胞的多形核白细胞（PNL)，并且使用 以IXPBS稀释的0. 1%血细胞比容的血液样品来揭示在多种流率下通道内每种细胞的位 置。对由Phantom v9. 1快速摄像头捕捉的一系列明视场图像取标准差，从而得到所示的顶 视图图像。该实验中使用的通道具有宽度为500 μπι并且内壁或外壁处深度分别为90 μπι和 120μπι的梯形横截面。顶部的虚线表示内通道壁，而底部的虚线表示外通道壁。图6Β):向 具有不同血细胞比容的血液样品添加用APC缀合的抗CD45抗体染色的经分离的PNL，并用 作以0. 8mL/min流率螺旋通道的输入样品。分别通过流式细胞分析和血细胞计数来确定内 出口的输出级分中回收的PNL细胞和RBS细胞的计数。图6C):当使用0.1%血细胞比容的 新鲜人血作为0. 8mL/min下的输入样品时，对内出口输出级分的吉姆萨染色。大多数细胞 是嗜中性粒细胞。图6D):经螺旋通道以0. 8mL/min的流率处理1%血细胞比容的血沉棕黄 层，并且对输入细胞和输出细胞在具有1 μΜ PM或没有PM的条件下进行四唑氮蓝（NBT) 测试。该图像示出，只有在外加 PM的条件下细胞才会变蓝，表示该装置不会活化样品中的 嗜中性粒细胞，并且输出的嗜中性粒细胞保持可存活状态，并能够通过体外刺激来活化。
[0026] 图7A和图7B是描述用内部为80 μ m、外部为130 μ m和宽度为600 μ m的梯形横截 面螺旋装置分离后从两个出口收集的MSC的尺寸分布图，手动测量来自每个出口收集物的 100个细胞。图7A):以2. 2mL/min的流率泵入样品。图7B):以3. OmL/min的流率泵入样 品。
[0027] 图8A和图8B是来自以2. 5mL/min流率的内80μπκ外130μπι和宽度600 μπι的梯 形横截面螺旋装置的内输出（图8Β)和外输出（图8Α)的MSC收集的显微图像。
[0028] 图9Α示出了颗粒聚集并陷于迪恩漩涡内的原理的梯形横截面通道的示意图。图 9Β示出了实际的去除了两个出口管的PDMS铸造的梯形横截面螺旋微流体装置的照片。左 边示出了横截面的剖切图。螺旋曲线半径为7. 5_至12. 5_不等。通道横截面的内高度 和外高度分别为80 μ m和130 μ m。通道的宽度为600 μ m。
[0029] 图IOA是顶视图图像，示出了在0. 5mL/min至7. 5mL/min的流率下，内/外深度为 80/130 μ m的梯形横截面螺旋微通道的出口与高度为80 μ m的矩形通道的出口的荧光珠分 布比较。图IOB是结合了来自顶视图和侧视图的26. 25 μ m荧光珠分布的迪恩流场（内/外 深度：80/140 μ m，宽度：600 μ m，流率：3. 5mL/min，通道半径：7. 5mm)的CFD模拟，表示颗粒 的力平衡位置。黑色锥表示迪恩流的方向和大小。灰色圈是来自实验结果的26. 25 μπι珠 在典型流率下的位置。
[0030] 图11Α、图IlB和图IlC是用内/外深度为80/130 μm、宽为600 μπι的梯形横截面 螺旋微通道以3. 4mL/min流率进行颗粒分离的FACS结果图。图IlA :输入0. 665%体积对 体积浓度（约2.6X106/mL)的16·68μπι颗粒和26·9μπι颗粒，图11B:内侧输出，图11C: 外侧输出。
[0031] 图12示出不同位置的颗粒上的力方向的示意图。黑色圈表示不稳定平衡点的位 置。白色圈表示稳定的力平衡点。白色锥表示迪恩速度的方向和对数大小。
[0032] 图13是具有宽度为500 μ m、深度为70 μ m(内）和100 μ m(外）的梯形横截面的 螺旋通道的示意图，以描述工作原理。在出口处，较大的白细胞（WBC)因惯性升力（FJ和 迪恩阻力（F d)的合力聚集于内壁附近，而较小的红细胞（RBC)陷于迪恩涡心，并在外壁附 近形成宽的条带。
[0033] 图14A至图14D是：表示在以下通道中ΙΟμπι(白色）和6μπι(灰色）珠的惯性聚 集的示意图（不按比例）和平均复合荧光图像。图14Α):最优流率lmL/min(De = 4. 31) 下具有500 ymX90ym(WXH)的矩形横截面的螺旋通道；图14B):最优流率2mL/min(De = 8. 63)下具有500 μ mX 120 μ m的矩形横