专利名称：一种改变大肠杆菌脂肪酸组成的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学与生物能源领域，具体地涉及一种改变大肠杆菌脂肪酸组 成的方法，使工程大肠杆菌胞内不饱和脂肪酸的含量增加，由此制备的生物柴油更适合实 际应用。
背景技术：
柴油作为一种重要的石油炼制产品，在各国燃料结构中占有较高的份额，已成为 重要的动力燃料。面临石油储量的不断减少、能源需求的不断增长以及化石燃料引起的 环境污染问题，开发新的、对环境无害的、非石油类的可再生资源是未来能源发展的主题思 路。生物柴油是生物质能的一种形式，其主要成分是脂肪酸甲酯，被国际可再生能源界誉为 最具发展前景的替代油品，也是柴油发动机燃料的最佳替代品，其对柴油的替代有助于降 低化石燃料对环境的影响，与普通柴油相比，可减少90%的空气毒性。在世界性能源危机的 背景下，生物柴油已经成为时代的新宠，受到多方关注。传统的生物柴油生产工艺是以油料作物、野生油料植物以及动物油脂、餐饮垃圾 油等为原料通过酯交换反应从而制成脂肪酸甲酯。但利用植物油为原料成本高，其成本占 到总生产成本的70% -85%，而以餐饮废弃油为原料，也存在原料难以收集和运输困难等 问题，这些都严重制约了生物柴油的产业化进程，因此寻找一种廉价的原料成为生物柴油 产业化的关键。微生物油脂又称单细胞油脂，是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定的条件 下利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源，在菌体内合成的。大部分微生物油 脂的脂肪酸组成和一般植物油相近，以16-18碳脂肪酸如油酸、棕桐酸、亚油酸和硬脂酸为 主，因此微生物油脂发酵可能是生物柴油产业和生物经济的重要研究方向。大肠杆菌作为生物工程领域最常使用的微生物，具有遗传背景清楚，技术操作简 单，培养条件简单，大规模发酵经济的优点，倍受遗传工程专家的重视，已经成为微生物催 化合成化学品和燃料的理想受体菌。利用工程大肠杆菌生产生物燃料是不与作物争地、不 靠天生产的生物柴油生产新途径。然而，大肠杆菌自身的脂肪酸组成并不适合用于生产生 物柴油，在37°C的培养条件下，大肠杆菌合成的脂肪酸中棕榈酸等饱和脂肪酸的含量可达 40% _50%，棕榈酸甲酯含量高的生物柴油，其动力学粘度大，作为燃料使用时喷射效果不 佳；倾点和冷滤点高，低温流动性较差，这在很大程度上限制了在低温天气下的使用。通过 基因工程手段，调节大肠杆菌脂肪酸合成的相关酶的活性，增加不饱和脂肪酸合成，可以使 得到的工程大肠杆菌的脂肪酸组成更适合于生物柴油的生产。大肠杆菌不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸合成的分支点为β -羟基癸酰-ACP脱水酶 (FabA)在脂肪酸链延伸的过程中引入了一个双键。该酶是由两个18KD的多肽链组成的 同源二聚体，它特异性选择_羟基癸酰-ACP作为底物，催化其生成反-2-癸烯酰-ACP和 顺-3-癸烯酰-ACP的混合物，该反应的过程中生成的反-2-癸烯酰-ACP可从酶上解离，如 果解离发生，则该中间体迅速被烯酰-ACP还原酶还原，进一步生成饱和脂肪酸；然而一旦该中间体异构化生成顺-3-癸烯酰-ACP，则该双键则会得到保留，并进一步延伸生成各种 不饱和脂肪酸，如棕榈油酸、顺_十八碳烯酸等。顺-3-癸烯酰-ACP链长的进一步延伸需 要β -酮脂酰-ACP合成酶I (FabB)来催化，FabB缺失的突变体不饱和脂肪酸合成的效率 同样大大降低，通过对FabB的序列分析，推导出其编码大小为42. 6KD的蛋白，该蛋白同样 以同源二聚体的形式发挥其催化活性。我们通过在工程大肠杆菌中过量表达这两个与不饱 和脂肪酸合成相关的基因，从而增加了大肠杆菌滋生的不饱和脂肪酸含量，使从工程大肠 杆菌中制备的生物柴油更适用于目前的柴油机。
发明内容
本发明的目的在于提供一种改变大肠杆菌胞内脂肪酸组成的方法，提高其脂肪酸 甲酯中的不饱和脂肪酸含量。为实现上述目的，本发明提供的工程大肠杆菌制备不饱和脂肪酸甲酯的步骤为a、将编码大肠杆菌β -羟基癸酰-ACP脱水酶(FabA)和β -酮脂酰-ACP合成酶 I (FabB)的基因重组到表达质粒启动子的下游，转化大肠杆菌细胞，获得工程大肠杆菌菌 株；b、将工程大肠杆菌按体积比0. 5-1. 5%的接种量接种到400-500mL含50 μ g -πιΓ1 卡那霉素的LB液体培养液中，在35-37°C和200-250rpm的条件下振荡培养至OD6tltl约为 0. 6-0. 8，加入诱导剂IPTG至终浓度0. I-Immol · L—1，继续培养3-24小时，离心收集菌体；C、菌体采用l-2mL去离子水悬浮，然后加入5_10mL氯仿/甲醇(体积比2:1)， 涡旋震荡3-5分钟，抽提细胞总脂；d、将步骤c中的抽提液在8000_10000rpm条件下离心5_10分钟，收集下层有机 相，用氮气吹干，加入2mL皂化试剂，置于60-70°C水浴中反应1_2小时；e、向上述皂化体系中加入2mL甲酯化试剂，置于60_70°C水浴中反应0. 5-1小时， 采用2mL正己烷萃取脂肪酸甲酯，减压蒸馏浓缩，制得生物柴油。步骤d中的皂化试剂为6%的NaOH甲醇水溶液(甲醇与水的体积比为4:1)。步骤e中的甲酯化试剂为三氟化硼/甲醇(体积比1:4)。与公知技术相比，本发明具有以下优点本发明中的工程大肠杆菌菌株其饱和脂肪酸组成大大降低，采用该菌株制备的脂 肪酸甲酯，不饱和脂肪酸组成较高，这种生物柴油更适合于在现有柴油机中使用。
图1是β -羟基癸酰-ACP脱水酶(FabA)和β -酮脂酰-ACP合成酶I (FabB)共 表达载体示意图。
具体实施例方式实施例1 构建大肠杆菌β -羟基癸酰-ACP脱水酶(FabA)和β -酮脂酰-ACP合 成酶I(FabB)共表达的载体，具体过程如下以寡核苷酸 5，-CAT GCC ATG GTA GAT AAA CGC GAA TC-3，禾口 5，-ACG CGT CGA CTC AGAAGG CAG ACG TAT CC-3’为引物，以大肠杆菌基因组DNA为模版，用PCR方法扩增出
4β-羟基癸酰-ACP脱水酶(FabA)蛋白基因，并在5’端和3’端分别引入NcoI和SalI位点， 然后用上述酶切位点将此基因克隆到pET30a (Novagen)载体上，得到重组质粒ρΕΤ-FabA ； 以寡核苷酸 5' -CAT GCC ATG GTG AAA CGT GCA GTG ATT AC-3'禾Π 5' -ACG CGT CGA CTT AAT CTT TCA GCT TGC GC-3’为引物，以大肠杆菌基因组DNA为模版，用PCR方法扩增出 β -酮脂酰-ACP合成酶I (FabB)蛋白基因，并在5’端和3’端分别引入NcoI和SalI位点， 然后用上述酶切位点将此基因克隆到pET30a载体上，得到重组质粒pET-FabB ；以寡核苷酸 5' -ACG CGT CGA CTT AAT ACG ACT CAC TAT AG-3'禾P 5' -CCG CTCGAG TCA GM GGC AGA CGT ATC C-3，为引物，以重组质粒pET-FabA为模版，用PCR方法扩增出T7_FabA片段，并在 5’端和3’端分别引入SalI和NcoI位点，然后用上述酶切位点将此基因克隆到pET_FabB 载体上，得到重组质粒pET-FabAB，如图1。实施例2 用构建好的工程菌株发酵生产生物柴油，其步骤如下a、将工程大肠杆菌按体积比0. 5%的接种量接种到400mL含50 μ g · ml/1卡那霉 素的LB液体培养液中，在37°C和250rpm的条件下振荡培养至0D_约为0. 6，加入诱导剂 IPTG至终浓度0. Immol · L—1，继续培养3小时，离心收集菌体；b、菌体采用ImL去离子水悬浮，然后加入5mL氯仿/甲醇(体积比2 1)，涡旋震 荡3分钟，抽提细胞总脂；C、将步骤b的抽提液在SOOOrpm条件下离心5分钟，收集下层有机相，用氮气吹 干，加入2mL 6%的NaOH甲醇水溶液(甲醇与水的体积比为4 1)，置于60°C水浴中反应 2小时；d、向上述皂化体系中加入2mL三氟化硼/甲醇(体积比1 4)，置于60°C水浴中 反应1小时，采用2mL正己烷萃取脂肪酸甲酯，减压蒸馏浓缩，制得生物柴油。实施例3 用构建好的工程菌株发酵生产生物柴油，其步骤如下a、将工程大肠杆菌按体积比1. 5%的接种量接种到500L含50 μ g · mL—1卡那霉素 的LB液体培养液中，在35°C和200rpm的条件下振荡培养至0D_约为0. 8，加入诱导剂IPTG 至终浓度Immol · L—1，继续培养24小时，离心收集菌体；b、菌体采用2mL去离子水悬浮，然后加入IOmL氯仿/甲醇(体积比2:1)，涡旋 震荡5分钟，抽提细胞总脂；C、将步骤b的抽提液在IOOOOrpm条件下离心10分钟，收集下层有机相，用氮气吹 干，加入2mL 6%的NaOH甲醇水溶液(甲醇与水的体积比为4 1)，置于70°C水浴中反应 1小时；d、向上述皂化体系中加入2mL三氟化硼/甲醇(体积比1 4)，置于70°C水浴中 反应0. 5小时，采用2mL正己烷萃取脂肪酸甲酯，减压蒸馏浓缩，制得生物柴油。实施例4 用构建好的工程菌株发酵生产生物柴油，其步骤如下a、将工程大肠杆菌按体积比1 %的接种量接种到450L含50 μ g · mL—1卡那霉素的 LB液体培养液中，在36°C和220rpm的条件下振荡培养至0D_约为0. 7，加入诱导剂IPTG 至终浓度0. 5mmol · L—1，继续培养12小时，离心收集菌体；b、菌体采用1. 5mL去离子水悬浮，然后加入SmL氯仿/甲醇(体积比2:1)，涡旋 震荡4分钟，抽提细胞总脂；C、将步骤b的抽提液在9000rpm条件下离心8分钟，收集下层有机相，用氮气吹
5干，加入2mL 6%的NaOH甲醇水溶液(甲醇与水的体积比为4 1)，置于65°C水浴中反应 1. 5小时； d、向上述皂化体系中加入2mL三氟化硼/甲醇(体积比1 4)，置于65°C水浴中 反应1小时，采用2mL正己烷萃取脂肪酸甲酯，减压蒸馏浓缩，制得生物柴油。
权利要求
一种改变大肠杆菌细胞脂肪酸组成的方法，主要步骤如下a)将编码大肠杆菌β 羟基癸酰 ACP脱水酶(FabA)和β 酮脂酰 ACP合成酶I(FabB)的基因重组到表达质粒启动子的下游，转化大肠杆菌细胞，获得工程大肠杆菌菌株；b)将工程大肠杆菌按体积比0.5 1.5％的接种量接种到400 500mL含50μg·mL 1卡那霉素的LB液体培养液中，在35 37℃和200 250rpm的条件下振荡培养至OD600约为0.6 0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1 1mmol·L 1，继续培养3 24小时，离心收集菌体；c)菌体采用1 2mL去离子水悬浮，然后加入5 10mL氯仿/甲醇(体积比2∶1)，涡旋震荡3 5分钟，抽提细胞总脂；d)将步骤c中的抽提液在8000 10000rpm条件下离心5 10分钟，收集下层有机相，用氮气吹干，加入2mL皂化试剂，置于60 70℃水浴中反应1 2小时；e、向上述皂化体系中加入2mL甲酯化试剂，置于60 70℃水浴中反应0.5 1小时，采用2mL正己烷萃取脂肪酸甲酯，减压蒸馏浓缩，制得生物柴油。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤d中的皂化试剂为6%的NaOH甲醇水溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，甲醇水溶液中的甲醇与水的体积比为 3-4 2-1。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤e中的甲酯化试剂为三氟化硼/甲醇，三氟 化硼/甲醇的体积比1-2 4-3。
全文摘要
一种改变大肠杆菌胞内脂肪酸组成的方法，将大肠杆菌调控不饱和脂肪酸合成的基因β-羟基癸酰-ACP脱水酶(FabA)和β-酮脂酰-ACP合成酶I(FabB)采用原核表达载体在大肠杆菌中过量表达，从而使工程大肠杆菌的不饱和脂肪酸含量显著增加，采用该工程菌株制备的生物柴油，其脂肪酸组成更加合理，低温流动性更好，更适合于实际应用。
文档编号C10L1/02GK101899468SQ20091015787
公开日2010年12月1日 申请日期2009年7月9日 优先权日2009年7月9日
发明者刘炜, 咸漠, 孟鑫, 徐鑫, 曹玉锦, 杨建明 申请人:青岛生物能源与过程研究所