专利名称：一种提高绿豆叶肉原生质体分裂频率以培养再生器官的方法
技术领域：
本发明是一种培养绿豆原生质体，提高该原生质体分裂频率，从而培养再生器官的方法，属于遗传工程领域。
豆科植物的原生质体培养是具有经济价值的豆科作物遗传操作的重要手段。绿豆原生质体培养的研究已有报道〔1〕，〔2〕，但器官发生较难，分化成苗者更未见报道，影响绿豆叶肉原生质体器官发生的原因是多方面的，植物激素是其中最重要因素之一。对于促进绿豆叶肉原生素体分裂频率的研究也未见于报道。
本发明认为影响原生质体培养获得成功的因素是多方面的，但植物的激素是豆科植物原生质体培养中至关重要的因素之一，植物激素在诱导再生细胞分裂和诱导培养物脱分化，形态发生和发育中起着相当重要的作用。本发明的目的在于通过研究植物激素对绿豆原生质体分裂的影响，提供出提高绿豆原生质体分裂频率的方法。
材料和方法一、试管苗的培育取绿豆种子为试材，先经海鸥洗涤剂清洗3～5分钟，于70%(V/V)酒精浸渍2～3分钟，在0.1%升汞溶液中灭菌15分钟，用无菌水洗涤3～5次后置于MS基本培养基上，培养基约在1～1.1Kg/cm2压力下灭菌20分钟，接种于培养基上的种子，在26±1℃，1500-2000勒克斯培养条件下每天光照10小时，取培养9～21天试管苗真叶作游离叶肉原生质体的材料。
二、叶肉原生质体的游离和培养切取幼嫩真叶，剪成1～1.5mm薄片，置入混合酶液内分离原生质体，混合酶液是由0.7%(W/V)纤维素酶(“ONOZUKA”R-10 Yakult Pharmaceutical Industry Co.Ltd.Japan)，0.7%(W/V)半纤维素酶(No.H-2125，Sigma Chemical Company，U.S.A)和0.4%(W/V)果胶酶及CPW 13M甘露醇〔5〕组成。PH5.6。酶液经微孔滤器(抽滤膜孔径为0.45μ)灭菌，材料置于26±1℃恒温摇床(45-50转/分)17小时，然后用400目镍网过滤，去除细胞和小细胞团，用离心机(500转/分)离心2分钟收集原生质体，再用CPW 13M溶液漂洗原生质体三次，最后以所试原生质体培养基制成悬浮液，原生质体密度为105-106个/毫升。
将原生质体悬浮液分装到细胞培养瓶(60×30×20mm)，每瓶1至2毫升，在27±0.5℃人工气象箱内弱光(200-300勒克斯)下静止培养。
选用D2A培养基〔3〕(铁盐和微量元素用量按MS培养基)为原生质体培养基，各组成成份列为表Ⅰ，选用生长素2，4-D，NAA，细胞分裂素ZEA，BAP及其它激素GA3五种植物激素进行各种配比组成试验，每种激素浓度均为0.5毫克/升。在培养7天后，于倒置显微镜下观察计数。原生质体分裂的百分率为分裂的原生质体数/成活原生质体总数×100%，每次计数500个以上原生质体，每种处理重复三次以上。
试验结果一、单一植物激素对绿豆叶肉原生质体分裂的作用在培养基中单独添加2，4-D，6BA，ZEA，NAA，GA3任何一种激素时，原生质体分裂频率均较低(表二)，其中2，4-D，BAP，ZEA三组合频率相仿，单一使用NAA与GA3时，对原生质体生长不利，GA3不利更加明显。
二、激素组合和激素组的效应在控制培养组织的分化试验中，激素的组合甚为重要。本发明采用生长素与细胞分裂素结合使用，或同时使用二种生长素，或同时使用二种细胞分裂素(表三)，结果表明，不同激素组合的效应有很大差异。按表三所获结果可归纳出如下几点1.在培养基中添加一种生长素(为便于分析，把GA3归为生长素类)和一种细胞分裂素时，不同组合间激素效应畋鸷苊飨浴Ｉに ，4-D与细胞分裂素ZEA及BAP二类植物激素混合使用时，对原生质体再生细胞的分裂表现了良好的协同作用。
2.NAA无论与细胞分裂素BAP或ZEA相配比时，原生质体分裂频率下降明显，表现了仰制效应。赤霉素在与BAP，ZEA混合时亦相当明显地具有不利影响。
3.在绿豆叶肉原生质体培养基中二种生长素时2，4-D无论在与NAA或GA3配比混合，结果均表现了对原生质体分裂的不利影响。而值得注意的是，在培养基中含有NAA与GA3混合激素成份时，原生质体分裂频率很低，强烈地抑制了原生质体的生长与分裂。
4.采用二种细胞分裂素BAP与ZEA组合，其分裂频率虽较低，但比添加二种生长素配比组合要高。
综上所述并与表二结果相比可知，单独使用一种植物激素时效果欠佳，即便采用二种同类植物激素(生长素或细胞分裂素)对绿豆叶肉原生质体再生细胞的分裂亦无良好的作用。
三、四种激素成份配比对原生质体再生细胞分裂频率的影响。
为了进一步测试多种激素混合配比对绿豆叶肉原生质体再生细胞分裂的作用，我们设计了四种激素成份配比试验，并以添加五种激素成份组合及无激素组合加以比较。由
图1可以看出，不同激素配比组合对绿豆叶肉原生质体分裂频率的提高确有异乎寻常的作用。附加2，4-D，NAA二种生长素和BAP，ZEA二种细胞分裂素的培养基，促进原生质体再生细胞的分裂效果特别显著，分裂频率可达7.86%，是本发明所有处理中分裂频率最高的组合。若在上述激素组合中去掉2，4-D而添加GA3时，分裂频率降至5.48%，但总的效应表现较好。
若在分裂频率最高的组合中添加GA3时，也即五种激素2，4-D，NAA，BAP，ZEA和GA3各以0.5毫克/升浓度同时存在时，原生质体频率明显降止1.45%，再次表现了GA3在此组合形式中对绿豆叶肉原生质体分裂的抑制作用。
此外，由附图1中不难看出，在四种激素配比组合中有GA3，2，4-D同时存在时，不论再添加BAP和ZEA或NAA，BAP，或NAA，ZEA，其分裂频率最高在2.65%，最低为1.91%。上述三种激素配比方式显然远不如2，4-D，NAA，BAP，ZEA四种激素配比组合为好。
四、细胞分裂及愈伤组织诱导与根的形成附图2-a是绿豆叶肉原生质体。原生质体在适合的激素配比组合培养基中培养2～3天后，膨大拉长变成椭圆形，培养4～7天后，见到再生细胞的第一次分裂(附图2-b)，细胞分裂大致有均等分裂及不等分裂二种情况，7～12天可见到第二次分裂(附图2-c)，15天左右可见到10～12个细胞的多细胞团(附图2-d)，20天左右原生质体培养物均出现了直接为1～2毫米的肉眼可见的小愈伤组织(附图2-e)。此时转至愈伤组织扩增培养基上，培养基成份中去除甘露醇，葡萄糖用量增至5000毫克/升蔗糖浓度相同，琼脂的最终浓度为0.6%，其它成份与表一相同。培养25天左右，愈伤组织生长良好并呈现淡绿色。将此愈伤组织转至分化培养基(培养基中激素成份为为BAP及ZEA，浓度各为0.1毫克/升)，20天后愈伤组织迅速扩增，但未见器官分化，此时愈伤组织逐步变褐色，仅见边缘部分有绿色。再次转至诱导愈伤组织培养基扩增愈伤组织，经60多天三次转接，愈伤组织生长良好。再次转至2，4-D浓度为3毫克/升及BAP浓度为0.2毫克/升培养基培养时，出现类似胚状体的结构，18天后即见根产生(附图2-f)。随着根的生长，愈伤组织变褐，诱导芽的分化试验正在进行。
在那些原生质体分裂频率低，不适宜原生质体生长的激素配比组合中，在培养2～3天后原生质体大部分不膨大拉长，有的即使膨大，细胞内原生质含量少，空泡化细胞增多，有的细胞出现细胞壁皱缩，细胞质收缩，边缘粗糙成团现象。此时即使出现少量一次分裂细胞，但不能持续分裂，最终导至解体死亡。
本发明涉及植物细胞分裂及器官发生过程中外源激素之间的相互作用，提供了绿豆叶肉原生质体的培养方法，提高了原生质体的分裂频率，选择了原生质体诱导愈伤组织扩增培养基和分化培养基中的激素成份，通过四个月的培养，由愈伤组织诱导出根的生长。
众所周知，豆科植物是重要的籽粒用粮食经济作铮侍迮嘌际醯牟欢贤黄朴胪晟疲雇庠茨康幕虻牡既氤晌赡埽诙箍浦参镉旨际跎辖傩碌耐揪丁
表一原生质体培养基成份物盐(毫克/升)CaCl2900 H3BO36.2KNO31484 MnSO4·4H2O 22.3NH4NO3270 ZnSO4·7H2O 8.6KH2PO480 KI 0.83MgSO4·7H2O 900 Na2MoO4·2H2O 0.375FeSO4·7H2O 27.8 CuSO4·5H2O 0.025Na2-EDTA 37.3 CoCl2·6H2O 0.025维生素(毫克/升)盐酸硫胺素4生物素10.64盐酸素0.7烟酸4.0氨基酸(毫克/升)叶酸0.4精氨酸10肌醇100谷氨酰胺293.2激素(毫克/升)Zea2，4-D0.5Zeatin0.5NAA 0.5 GA30.5BAP0.5葡萄糖30000甘露醇45000蔗糖30000水解乳蛋白LH500PH5.6
表二单一激素对叶肉原生质体分裂的影响激素培养7天后的一次分裂百分比(%)2，4-D0.78BAP0.70Zeatin0.76NAA0.40GA30.19
表三不同激素组合对原生质体分裂的效应激素(0.5毫克/升)培养7天后分裂总频率一次分裂(%)二次分裂(%)一种生长激素与细胞分裂素混合2，4-DBAP4.320.034.352，4-DZeatin3.851.235.08NAABAP0.5900.59NAAZeatin0.3400.34GA3BAP 0.56 0 0.56GA3Zeatin 0.27 0 0.27二种生长素混合2，4-DNAA0.360.030.392，4-D GA30.28 0.03 0.31NAA GA30.05 0 0.05二种细胞分裂素混合BAPZeatin0.9600.96培养基的其它成份见表一。
参考文献1.黄美娟、李向辉等1982“中国科学院遗传研究所研究工作年报P34。
2.Xu.Z.H，et.al.，1981ZPhanrenphysiol.，104289-2983.Li.X.H.，1981Theor.Appl.Genet.，60345-34权利要求
1.一种从绿豆叶肉原生质体培养再生器官的方法，本发明的特征由下列各项构成a.采用HgCl2的消毒得到无菌的绿豆种子；b.使消毒的无菌绿豆种子在25-26℃光照条件下，在基本培养基上生长9-21天；c.切取幼嫩叶子；d.切割小块的绿豆幼嫩叶片浸入含有混合酶液的CPW13M溶液中，其中酶液成份为0.1%(w/v)纤维素酶，0.4%(w/v)果胶酶；e.按d所制备的混合物试验材料，置于25-27℃摇床上处理17小时；f.经酶介17小时后用滤网过滤以便去除细胞及碎片，然后离心沉淀原生质体；g.用CPW13M溶液漂洗收集原生质体；h.在含有糖及植物激素2.4-D，NAA，BAP，Zeatip的原生质体培养基上进行原生质体悬浮培养；i.对绿豆原生质体在27℃及光照条件下进行浅层液体悬浮培养，约25天左右形成1～2毫米大小的愈伤组织；j.直径在1～2毫米的愈伤组织转接到固体培养基上进行扩增。k.愈伤组织转接到分化培养基，经多次继代，至出现类似胚状体结构；l.在含有植物激素的分化培养基上继代培养，一部分处理分化产生不定根。
2.根据权利要求1所述的培养再生器官的方法，其特征在于所采用的原生质体培养基含有生长素2，4-D，NAA和细胞分裂素BAP，ZEA，其浓度用量分别在0.3～0.7毫克/升范围内，在此原生质体培养基上原生质体再生细胞的分裂频率达7.86%左右。
3.根据权利要求1所述的培养再生器官的方法，其特征在于所采用的原生质体诱导愈伤组织扩增培养基中BAP及ZEA浓度分别在0.3～0.7毫克/升范围内。
4.根据权利要求1所述的培养再生器官的方法，其特征在于所采用的分化培养基中2，4-D浓度为1～2毫克/升，BAP浓度为0.1～0.4毫克/升。
全文摘要
在对绿豆叶肉原生质体培养中，用附加浓度分别为0.5毫克/升的生长素NAA，2，4-D与细胞分裂素BAP，ZTA的D
文档编号C25C7/00GK1038315SQ8810353
公开日1989年12月27日 申请日期1988年6月8日 优先权日1988年6月8日
发明者王韫珠, 葛扣林 申请人:复旦大学