专利名称：一种氨基甲酸酯类农药半抗原的新制备法的制作方法
技术领域：
本发明属于农药残留检测领域，涉及一种氨基甲酸酯类农药半抗原的新制备法。
背景技术：
农药大量使用所造成的环境毒性问题，已经引起人们的高度重视。氨基甲酸酯类杀虫剂是农药化学领域的一个重要分枝，与有机磷类、拟除虫菊酯类一起，成为杀虫剂的主体。其商品化品种大约有40余种，其中吨位较大的约有10余种。1989年在世界杀虫剂市场中，氨基甲酸酯类杀虫剂销售额占总杀虫剂销售额的21％，仅次于有机磷类，居第二位。近几年来，由于有机氯农药受到禁用，抗有机磷杀虫剂的昆虫品种增多，这就使得氨基甲酸酯的用量逐年增加，因而环境、食品中的氨基甲酸酯类农药的残留情况备受关注，其检测方法也日渐发展。由于氨基甲酸酯类农药不稳定，传统的分析方法很难快速、方便、准确地检测，农药免疫分析方法的兴起[2-3]，为氨基甲酸酯类农药的免疫检测提供了新思路。
农药的免疫检测的基本原理是脊椎动物机体具有免疫系统，在受到进入体内异源大分子量物质刺激的时候能发生保护性应答(免疫应答)，产生特异性的保护物质(免疫球蛋白——抗体)来识别该异源物质(抗原或免疫原)，并与之结合，从而“钝化”该物质以排除其干扰。对于农药小分子化合物一般不具备免疫原性，即不能刺激动物的免疫应答反应而产生抗体，但其具有反应原性，即能与相应抗体发生特异性结合反应。可以将农药小分子以半抗原的形式通过一定碳链长度的连接分子(又称间隔臂)与分子量大的载体(蛋白质)以共价键相偶联制备人工抗原，连接在载体蛋白质上的农药小分子便成为特定的抗原决定簇。接下来以人工抗原免疫动物，产生对该农药分子具特异性的抗体。利用农药分子的反应原性和抗体(或抗原)上标记物的生物放大或物理、化学放大作用，可对样本中超微量农药残留进行定性定量检测。由于抗原抗体反应的特异性，大大简化甚至省去复杂的样品前处理过程，避免了大量使用溶剂对实验人员的健康造成不良的影响和对环境的污染，加快了分析速度。免疫分析一般不需要贵重仪器，具有便携性，对使用人员的专门技术要求也不高，便于推广。由于小分子化合物免疫分析特异性强、灵敏度高、方便快捷、安全廉价、适应性强，在超微量农药残留分析方面显示出独到的优势，被列为90年代优先研究开发的新分析技术的第一位。
在免疫分析中要获得对农药分子具高特异性和亲和力的抗体，首先制备具有高免疫原性和特异性的人工抗原，人工抗原的制备包括两步(1)合成保留农药分子结构且带活性基团的半抗原。(2)使半抗原的活性基团与白蛋白、卵清蛋白等反应，得到抗原。所以成功合成半抗原是免疫分析中最关键的步骤，一般从以下三个方面加以注意(1)为增强免疫反应时抗体对半抗原的免疫识别，减少二者相互作用时的空间障碍常需在半抗原与载体蛋白之间插入4-6个碳链长的间隔臂(或连接分子)。间隔臂应尽量避免连结在目标分子的官能团处或靠近官能团处，最好在位于重要的特征性官能团的远端，否则会减少抗体与目标分子的识别和结合位点。(2)对某些不具备反应活性基团的则必须进行人工化学修饰，将反应活性基团引入半抗原分子中，使之成为衍生物，然后才能与载体蛋白进行偶联反应。反应活性基团包括羧基、羟基、氨基和疏基等。(3)保留农药分子结构，以增强抗体对目标分子的特异性与亲和力。
对于氨基甲酸酯类农药的免疫分析，国内外曾做过一些研究。其中在氨基甲酸酯类农药半抗原的合成中保留农药分子结构的方法通常是采用光气的方法，即将酚类物质与碱反应生成酚盐，接着通入过量光气，形成氯甲酸萘酯的结构。这种合成方法使用了大量的光气，而光气是一种毒性很大的气体，在操作的时候一定要避免泄漏，这增大了操作的难度，也增加了生产中的危险性，并且极易造成环境的污染。实际这种方法也是传统的氨基甲酸酯类农药的一种生产路线。本合成方法在半抗原的设计中避开了光气的使用，采用对硝基苯卤甲酸酯合成对硝基苯碳酸酯的结构。该发明避免了与光气的直接接触，增加了生产的安全性，减少了对环境的污染，同时也取得了较好的产率。
发明内容
本发明提供了一种氨基甲酸酯类农药免疫分析中半抗原制备的新方法。所述方法如下(1)把含羟基官能团的化合物溶于有机溶剂，以弱碱为反应的缚酸剂，滴加入一定量溶于有机溶剂的对硝基苯卤甲酸酯，整个过程温度控制在-10℃-50℃，反应得到对硝基苯碳酸酯类化合物。(2)把对硝基苯碳酸酯类化合物溶于有机溶剂，在碱性条件下，与结构为NH2-(CH2)n-COOH(n是从1-10的整数)的有机物反应，合成氨基甲酸酯类农药的半抗原。
具体实施方案(1)将含羟基官能团的化合物溶于有机溶剂，与弱碱混合，对硝基苯卤甲酸酯溶于有机溶剂，磁力搅拌溶解后，把对硝基苯卤甲酸酯的溶液向含有羟基官能团的化合物和弱碱的混合溶液中滴加，滴加过程保持-4℃-6℃。整个操作过程用氮气保护保持无水状态。薄板层析跟踪反应，室温下反应进行1-5个小时结束。用乙醚和二氯甲烷对产品进行重结晶，得到纯品对硝基苯碳酸酯。
(2)把所得对硝基苯碳酸酯溶于四氢呋喃中，NH2-(CH2)n-COOH(n是从1-10的整数)溶于碱性水溶液中，把四氢呋喃溶液滴加入碱性水溶液中进行反应，薄板层析跟踪反应，确定反应结束时间。反应结束后，调节反应液为酸性环境，用乙酸乙酯提取，提取液加无水Na2SO4干燥。产品用硅胶柱常压层析纯化。得到氨基甲酸酯类半抗原。
图1 1-萘基-4-硝基苯基碳酸酯的红外光谱图。从谱图中可以看出1770cm-1羰基(C＝O)的特征吸收峰，1343cm-1和1521cm-1的硝基(-NO2)特征吸收峰。
图2 1-萘基-4-硝基苯基碳酸酯的核磁共振氢谱图。从谱图中可以看出芳环氢原子7.2-8.4的化学位移。
图3牛血清蛋白(BSA)、牛血清蛋白和西维因半抗原的偶联物(BSA-CNH)的红外光谱对比图。从谱图中可以看出蛋白BSA有蛋白质类共有的3306cm-1、1653cm-1538cm-1吸收峰。偶联产物BSA-CNH显示出了蛋白BSA 3306cm-1、1653cm-1和1538cm-1的特征吸收外，还出现了1720cm-1处的氨基甲酸酯的羰基吸收峰，1225cm-1处的半抗原中C-O-C的特征吸收峰。所以BSA-CNH兼有BSA和CNH的吸收峰。
具体实施方案上述方法将通过下面的实例进一步描述，但是提供的实例不能作为对此方法的限制。
实施例1将0.8g萘酚溶于20ml无水二氯甲烷后，加入0.58ml无水吡啶形成混合溶液，向此混合溶液中滴加溶有1g对硝基苯氯甲酸酯的无水二氯甲烷溶液15ml，整个体系保持在-4℃-6℃。反应用氮气保护，保持无水状态。用薄板层析法(TLC)跟踪反应，确定反应时间。用二氯甲烷和乙醚重结晶。得到淡黄色的1-萘基对硝基苯基碳酸酯晶体，收率为80％。通过红外光谱表征，有羰基和硝基的特征峰(附图1)。通过核磁共振氢谱进一步证明所得产物结构的正确性。(附图2)把上步制得的1-萘基对硝基苯基碳酸酯1.2mmol溶于四氢呋喃中，0.16g 6-氨基己酸溶于碳酸氢钠溶液，把四氢呋喃溶液逐滴加入碳酸氢钠溶液中，滴加过程保持-4℃-4℃，TLC跟踪反应，确定反应时间。反应结束后，加HCl调反应液的pH为酸性，用乙酸乙酯提取三次，提取液加无水Na2SO4干燥。然后浓缩至大约5ml，所得的溶液用硅胶柱常压层析纯化。收集目标组分，减压蒸除溶剂得到白色晶体为氨基甲酸酯类农药西维因的半抗原。收率在90％以上。
实施例2将0.6g 3-甲基苯酚溶于15ml无水二氯甲烷后，加入0.58ml无水吡啶形成混合溶液，向此混合溶液中滴加溶有1g对硝基苯氯甲酸酯的无水二氯甲烷溶液15ml，整个体系保持在-4℃-6℃。反应用氮气保护，保持无水状态。用TLC跟踪反应，确定反应时间。用二氯甲烷和乙醚重结晶。得到淡黄色的3-甲基苯基对硝基苯碳酸酯晶体，收率为87％。通过红外光谱表征，有羰基和硝基的特征峰，通过核磁共振氢谱进一步证明所得产物结构的正确性。
把上步制得的3-甲基苯基对硝基苯碳酸酯1.2mmol溶于四氢呋喃中，0.16g 6-氨基己酸溶于碳酸氢钠溶液，把四氢呋喃溶液逐滴加入碳酸氢钠溶液中，滴加过程保持-4℃-6℃，TLC跟踪反应，确定反应时间。反应结束后，加HCl调反应液的pH为酸性，用乙酸乙酯提取三次，提取液加无水Na2SO4干燥。然后浓缩至大约5ml，所得的溶液用硅胶柱常压层析纯化。收集目标组分，减压蒸除溶剂得到白色晶体为氨基甲酸酯类农药速灭威的半抗原。收率在90％以上。
实施例3将0.8g 3，4-二甲基苯酚溶于无水15ml二氯甲烷后，加入0.58ml无水吡啶形成混合溶液，向此混合溶液中滴加溶有1g对硝基苯氯甲酸酯的无水二氯甲烷溶液15ml，整个体系保持在-4℃-6℃。反应用氮气保护，保持无水状态。用TLC跟踪反应，确定反应时间。用二氯甲烷和乙醚重结晶。得到淡黄色的3，4-二甲基苯基对硝基苯碳酸酯晶体，收率为85％。通过红外光谱表征，有羰基和硝基的特征峰，通过核磁共振氢谱进一步证明所得产物结构的正确性。
把上步制得的3，4-二甲基苯基对硝基苯碳酸酯1.2mmol溶于四氢呋喃中，0.16g 6-氨基己酸溶于碳酸氢钠溶液，把四氢呋喃溶液逐滴加入碳酸氢钠溶液中，滴加过程保持-4℃-4℃，TLC跟踪反应，确定反应时间。反应结束后，加HCl调反应液的pH为酸性，用乙酸乙酯提取三次，提取液加无水Na2SO4干燥。然后浓缩至大约5ml，所得的溶液用硅胶柱常压层析纯化。收集目标组分，减压蒸除溶剂得到白色晶体为氨基甲酸酯类农药巴沙的半抗原。收率在90％以上。
实施例4将0.9g 2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃酚溶于15ml无水二氯甲烷后，加入0.58ml无水吡啶形成混合溶液，向此混合溶液中滴加溶有1g对硝基苯氯甲酸酯的无水二氯甲烷溶液15ml，整个体系保持在-4℃-6℃。反应用氮气保护，保持无水状态。用TLC跟踪反应，确定反应时间。用二氯甲烷和乙醚重结晶。得到淡黄色的呋喃酚对硝基苯基碳酸酯晶体，收率为87％。通过红外光谱表征，有羰基和硝基的特征峰，通过核磁共振氢谱进一步证明所得产物结构的正确性。
把上步制得的呋喃酚对硝基苯基碳酸酯1.2mmol溶于四氢呋喃中，0.16g 6-氨基己酸溶于碳酸氢钠溶液，把四氢呋喃溶液逐滴加入碳酸氢钠溶液中，滴加过程保持-4℃-6℃，TLC跟踪反应，确定反应时间。反应结束后，加HCl调反应液的pH为酸性，用乙酸乙酯提取三次，提取液加无水Na2SO4干燥。然后浓缩至大约5ml，所得的溶液用硅胶柱常压层析纯化。收集目标组分，减压蒸除溶剂得到白色晶体为氨基甲酸酯类农药呋喃丹的半抗原。收率在90％以上。
实施例5将0.86g 2-氯-4，5-二甲基苯酚溶于20ml无水二氯甲烷后，加入0.58ml无水吡啶形成混合溶液，向此混合溶液中滴加溶有1g对硝基苯氯甲酸酯的无水二氯甲烷溶液15ml，整个体系保持在-4℃-6℃。反应用氮气保护，保持无水状态。用TLC跟踪反应，确定反应时间。用二氯甲烷和乙醚重结晶。得到淡黄色的2-氯-4，5-二甲基苯对硝基苯基碳酸酯晶体，收率为73％。通过红外光谱表征，有羰基和硝基的特征峰，通过核磁共振氢谱进一步证明所得产物结构的正确性。
把上步制得的2-氯-4，5-二甲基苯对硝基苯基碳酸酯1.2mmol溶于四氢呋喃中，0.16g 6-氨基己酸溶于碳酸氢钠溶液，把四氢呋喃溶液逐滴加入碳酸氢钠溶液中，滴加过程保持-4℃-6℃，TLC跟踪反应，确定反应时间。反应结束后，加HCl调反应液的pH为酸性，用乙酸乙酯提取三次，提取液加无水Na2SO4干燥。然后浓缩至大约5ml，所得的溶液用硅胶柱常压层析纯化。收集目标组分，减压蒸除溶剂得到白色晶体为氨基甲酸酯类农药氯灭杀威的半抗原。收率在90％以上。
实施例6称取实施例1制备的西维因的半抗原(CNH)0.43g和0.25g N-羟基琥珀酰亚胺置反应瓶中，加入四氢呋喃溶解，另取0.59g N，N，-二环己基炭二亚胺溶于四氢呋喃，将此溶液加入反应瓶中，室温搅拌反应，4小时结束。反应液在4℃条件下密闭静置，过滤，得活化酯液。称取10mg牛血清蛋白(BSA)溶于1ml 0.05mol/L的碳酸盐缓冲液中，在磁力搅拌下等量分次地将活化酯溶液滴加到BSA溶液中，反应一个小时结束。将反应液置透析袋中，用磷酸盐缓冲液透析。所得透析产品即为西维因抗原(BSA-CNH)。通过红外(附图3)可以鉴定半抗原和蛋白发生偶联反应生成抗原，进一步证明半抗原新合成方法的可行性。
权利要求
1.一种制备氨基甲酸酯类农药半抗原的新方法，其特征在于包括以下步骤(1)对硝基苯卤甲酸酯活化含羟基官能团的化合物，得到对硝基苯碳酸酯类化合物。(2)以对硝基苯碳酸酯类化合物为原料，合成氨基甲酸酯类农药的半抗原。
2.如权利要求1所述的一种制备氨基甲酸酯类农药半抗原的新方法，其特征在于对硝基苯卤甲酸酯的结构式为 (X为Cl、Br、I)
3.如权利要求1所述的一种制备氨基甲酸酯类农药半抗原的新方法，其特征在于把含羟基官能团的化合物溶于有机溶剂，以碱为反应的缚酸剂，滴加一定量溶于有机溶剂的对硝基苯卤甲酸酯，整个过程温度控制在-10℃-50℃，反应得到对硝基苯碳酸酯类化合物。
4.如权利要求3所述的含羟基官能团的化合物的结构式为A-OH，式中A表示(1)-(4)的基团， R1-R5为相同的或不同的氢原子、氯原子、烷基、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷羰基、氯代烷氧基、N，N-二烷基取代氨基、N，N-二链烯基取代氨基、N，N-烷基炔基取代氨基、N，N-二烷基氨基取代亚氨基、二氧戊环基和烷基取代二氧戊环基， R6-R10为氢原子或烷基， R11-R18为相同的或不同的氢原子、烷基、苯基、N，N-二烷基取代氨基、N，N-二烷基取代氨基甲酰基， R19-R20为氢原子、烷基、烷硫基、烷基磺酰基、N，N-二烷基取代氨基甲酰基、腈基取代烷基、腈基取代烷硫基，R19和R20也可以相互结合形成杂环。
5.如权利要求3所述的对硝基苯碳酸酯的结构式为 式中A表示的基团如权利要求4所述。
6.权利要求3中所述的对硝基苯卤甲酸酯活化含羟基官能团的化合物的反应条件为(1)有机溶剂保持无水状态，其用量为反应物的溶解量；(2)碱为吡啶、三乙胺等有机碱，其摩尔用量为对硝基苯卤甲酸酯的摩尔量的1-10倍；(3)含羟基官能团的化合物与对硝基苯卤甲酸酯的摩尔比为1∶8-8∶1；(4)整个过程温度为滴加温度为-4℃-10℃，反应温度为0℃-50℃。整个体系保持无水状态。
7.权利要求6中所述的对硝基苯卤甲酸酯活化A-OH的反应条件为(1)有机溶剂是无水的二氯甲烷，其用量为反应物的溶解量；(2)碱为吡啶，碱的摩尔用量为对硝基苯卤甲酸酯的摩尔量的1-5倍；(3)含羟基官能团的化合物与对硝基苯卤甲酸酯的摩尔比为1∶4-4∶1；(4)整个过程温度为滴加温度为-4℃-6℃，反应温度为10℃-40℃。
8.如权利要求1所述的一种制备氨基甲酸酯类农药半抗原的新方法，其特征在于把对硝基苯碳酸酯类化合物溶于有机溶剂，在碱性条件下，与结构为NH2-(CH2)n-COOH(n是从1-10的整数)的有机物反应，合成氨基甲酸酯类农药的半抗原。其结构式为 其中A的结构如权利要求4所述。
9.权利要求8中所述的以对硝基苯碳酸酯类化合物为原料，合成氨基甲酸酯类农药的半抗原的反应条件为把对硝基苯碳酸酯溶于溶解量的四氢呋喃中，NH2-(CH2)n-COOH(n是从1-10的整数)溶于溶解量的碳酸氢钠水溶液中，将两种溶液混合后，4℃-40℃条件下发应。
全文摘要
本发明提供一种合成氨基甲酸酯类农药半抗原的新方法。该方法包括以下步骤(1)用对硝基苯卤甲酸酯活化含羟基官能团的化合物，得到对硝基苯碳酸酯类化合物。(2)以对硝基苯碳酸酯类化合物为原料，合成氨基甲酸酯类农药的半抗原。用对硝基苯卤甲酸酯合成农药半抗原的方法与传统的方法相比，避免了有毒气体——光气的使用，增加了生产的安全性，减少了对环境的污染，并且提高了反应的收率。
文档编号G01N33/532GK1725010SQ20041007060
公开日2006年1月25日 申请日期2004年7月22日 优先权日2004年7月22日
发明者马光辉, 苏志国, 杨耀军, 孟凡涛 申请人:中国科学院过程工程研究所