用于分析生物流体的可置换腔的制作方法

专利名称：用于分析生物流体的可置换腔的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于分析生物流体的腔，尤其涉及允许对生物流体中的粒子物质进行枚举的腔。
背景技术：
传统枚举液体介质中粒子成分的方法，如列举血液中的血细胞或者尿及其它生物流体中的细菌或其它物质，是用血细胞计数器，该血细胞计数器包括具有精确高度和精确尺寸的可视的、带有刻度的腔。将含有要枚举的粒子的液体引入腔中。必要时，将液体稀释以便使粒子数量降低到一个可处理的范围内。操作员则对给定区域内的粒子数计数。由于腔的面积和高度是精确已知的，因此，可以计算出单位体积内的粒子数。虽然这些腔基本上刻有刻度以对已知区域分界，但如果腔用在图片分析器上就不需要刻了。使用图片分析器时，不再需要形状规则的腔，这是因为从图片上完全可以计算出可视区域的面积。
由于这样的腔体制作精密，因此，血细胞计数器相对较贵而且不可回收。现代精密塑料模制技术使得可以用足够低廉的成本生产多种型号的血细胞计数器腔以便于在一些情况下可一次性使用，然而很难精确模制出有足够精密度和/或厚度要比传统的小0.1mm的腔。
美国专利4950455描述了一个计数腔，该计数腔由刚性载玻片和刚性盖玻片形成，中间充斥着刚性粒子如玻璃珠。玻璃珠在载玻片和盖玻片之间保持一个细小的间距，以此形成计数腔。
然而，由刚性粒子分隔开的上下两片刚性平板形成的计数腔有很大的局限性。由图1和图2可以看出，由2标出的现有技术装置包括下载玻片3，上盖玻片4和多个玻璃珠5形成的夹层。由于并非所有的玻璃珠完全一样，直径的变量系数达到10％或者更大，大的玻璃珠6在一定程度上“支起”盖玻片4，因此小的珠子7对分离没有影响。珠子直径大小不一是个问题，因为尽管决定和控制平均尺寸很容易，直径分布情况较难控制，最终表现为系统的准确度比预期的要低。这导致平均玻璃珠粒径形成的上下层间距要加上一个标准偏差。残余粒子的存在引起如图2所示的更大的问题。制作腔时或由环境引进或进样时会出现残余粒子。残余粒子8“支起”盖玻片4，在腔内形成体积增大的大区域，这就破坏了腔的准确度。
这种现有技术的腔的另外一个问题是很难在一台仪器中组装大量的用来自动扫描和计数粒子的这种可置换件，例如图片分析系统。
现在需要一种仪器和方法来克服现有技术的局限性，该仪器和方法具有分析生物流体的腔，包括枚举流体中的粒子，成本不高，不易留住粒子残余物，容易组装使用在自动测试系统上。

发明内容
根据本发明，用来分析生物流体的设备包括第一平面构件，第二平面构件，和至少三个分离器。至少一个平面构件是透明的。分离器放置在两平面构件之间，将这两构件分离成具有一定高度的腔。至少一个构件或分离器足够柔软使得腔的高度与分离器的平均尺寸大小相当。在使用过程中，将被分析的生物流体放置在腔内部。
根据本发明的一个方面，每个平面构件都是可卷在一个卷轴上的卷带。在一些实施例中，这些平面构件一开始是相互连接。在另外一些实施例中，每个平面构件一开始是相互分离的。
根据本发明的另一个方面，设有至少一个源卷轴和至少一个接收卷轴的磁带盒。平面构件一开始绕在源卷轴上，并在仪器运转时传输到接收卷轴上。分析区域设置在源卷轴和接收卷轴之间。在仪器运转时平面构件经过分析区域。
本发明有许多优点。我们发现如果计数腔是由放置在平面构件中的分离器形成，并且如果至少一个平面构件和分离器是柔软的，这个腔就与现有技术中的装置运转不同，而这些不同之处极具优势。当计数腔充满液体时，毛细力将把上下平面构件拉在一起，进而对滞留的分离器稍稍施加了压力。这个压力将使得柔性零件变形来促使腔的厚度与放置在平面构件中的分离器的平均粒径近似。例如，如果上下平面构件都是刚性的而分离器是柔性的，比平均粒径大的分离器将被挤压，并且平面构件将互相靠近直到越来越多的分离器开始接触到平面构件，进而阻止进一步的靠近。此时，如果分离器高度的标准偏差可被接受并且分离器足够柔软，腔的高度近似于分离器的平均高度并容易确定。再比如，如果分离器是刚性的而上平面构件是柔软的，上平面构件就会变形，在有较大分离器的小区域被“支起”，在较小分离器处下降。假如上平面构件足够柔软的话，腔的平均高度就近似于分离器的平均高度。
因此，本发明的一个优点是由于腔的高度大致一致，因此形成的腔有可准确测定的体积。
本发明的另一个优点是造价便宜且可达到理想的准确度。本发明不要求准确加工的空隙或分离器来精确确定体积。结果，此项发明的造价不贵且依然能达到理想的准确度。此外，由于造价不贵，本发明实际上可以以可置换的形式提供。
结合本发明的以下详细描述和附图，本发明的这些和其它目的，特点和优点将更为明显。


通过以下附图进一步阐明本发明的原理，其中图1为现有技术的横截面示意图，其中使用的系统中所有零件均是刚性；图2为现有技术的横截面示意图，其中使用的系统中所有零件均是刚性的组件，且残余粒子留在系统中；图3为本发明的横截面示意图，其中分离器相对于上下平面构件是柔性的；图4为本发明的横截面示意图，其中上平面构件与其它构件相比是柔软的；图5为本发明的横截面示意图，其中上平面构件与其它构件相比是柔软的，并且有残余粒子滞留其中；图6为本发明的第一实施例的示意图；图6A为设计用于使用本发明第二实施例的装置的示意图；图7为含有本发明第一个具体实施例的磁带盒示意图；图8为设计使用本发明的一个实施例的仪器示意图；图9为图6中仪器的示意图，其中样品加在平面构件上；图10为样品被分散在平面构件之间后的示意图；图11为分析区域的示意图。
具体实施例方式
参考图3-11，用来分析生物流体的本发明仪器10包括第一平面构件12，第二平面构件14，和至少3个分离器16。平面构件12、14中至少一个是透明的。分离器16放置在构件12、14之间，将构件12、14分开形成具有高度20的腔18。构件12、14中至少一个或者分离器16足够柔韧，能使得构件12、14间的腔的高度20近似于分离器16的平均高度。
分离器16可以是任何结构，它被设置在平面构件12、14之间，运转时将平面构件12、14相互分离开。在平面构件间伸展的分离器16的尺寸参照在此称为分离器16的高度22。多个分离器16的高度22通常基本上互不完全相等，而是对用于类似分析仪器上的分隔工具来说在商业业上可接受的范围之内。球状珠子是可接受的分离器16的一种，商业上可广泛获取，如从美国印第安纳州的费氏实验室(Bangs Laboratories ofFishers)中就可获取。
在一些实施例中，分离器16包括比第一构件12和第二构件14之一柔韧或者比两者都柔韧材料；例如，相对而言，平面构件12和14之一或者两者相对于分离器16是刚性的，分离器16相对于平面构件12和14之一或两者来说是柔韧的。
在另外一些实施例中，分离器16中包括柔软性不及平面构件12和14之一或者两者的材料；例如，相对而言，平面构件12和14之一或者两者相对于分离器16是柔韧的，分离器16相对于平面构件12和14中的一个或者两个是刚性的。
根据上述的柔软特性，假设平面构件12、14中的至少一个是透明的，平面构件12、14可由多种材料制成。可以接受的平面构件12、14的一种是含有丙烯酸或聚苯乙烯的透明塑料膜。卷状的平面构件12、14尤其有用，这是因为它们易于绕在卷轴上。在一些实施例中，第一构件和第二构件中之一或两者包括多个相互连接的刚性零件。
现在参照图3，本发明10的具体实施例中第一构件12和第二构件14由大量球状珠子形式的分离器16形成的腔18分隔开。这些珠子16由比第一构件12和第二构件14更为柔软的材料制成；比如，平面构件12、14可能相对于珠子16要硬一些，珠子16相对于平面构件12、14要柔软一些。可使用由聚苯乙烯、聚碳酸酯、硅树脂或类似材料制成的珠子。这里，较大的珠子16A被压缩到一点，在该点平面构件12、14接近大多数珠子16接触到的平面构件12、14的内表面24之处，这样使得腔的高度20稍小于平均的珠子粒径。
图4中，本发明10的另一实施例中，第一平面构件12由比球状珠子16和第二平面构件14更为柔软的材料制成，帐篷状覆盖珠子16，其中珠子之间为由支起平面构件12的珠子粒径决定的随机高度。如果膜的厚度能薄到足够如所示的那样柔软，无论哪种透明塑料膜，如丙烯酸、聚苯乙烯或类似材料都可以。显然，在这种情况下，尽管局部小区域与所希望的腔的高度20稍有出入，所有支起区域的平均高度将非常接近于平均粒径。我们的测试表明，使用本发明，在腔的高度低于4微米时，腔的平均高度可以控制在1％或更好。
图5中示出了图4中的腔18，其中留有一些粒子残余物26。残余物26的上平面构件12被支起，在残余物26之下的区域高度未知，但这种干扰只影响腔18的小部分区域，这与整个系统是刚性时的情况相反。
图6示出了本发明10的另一实施例，其中下平面构件12由一英寸宽、厚度大约在50微米左右的透明塑料薄膜带(例如聚乙烯脂(PET))制成，上平面构件14由与下平面构件12相同的材料制成，只是厚度为23微米，两者之间的腔18由多个平均尺寸为4微米的塑料珠16形成。上平面构件14内层涂有显色剂，如吖啶橙(acridine orange)，当用荧光照射检测时，这种显色剂能区别显色活的白细胞。其它荧光试剂包括astrozone橙、FITC、罗丹明或类似试剂。用透射光照区别显色白细胞的试剂包括astrozone橙，亚甲基蓝、噁嗪170。上平面构件14上按一定间隙凿有大量的孔28(例如，直径大约在300微米左右)，平面构件12、14连接在孔28之间的某处29上来形成一系列分离的分析腔18。
本实施例中平面构件12、14之间的间隔已知的其粒径准确可控(如粒径为4微米)的球状珠子16形成。这些珠子随机分布在平面构件12、14两者之一上，并附在含有染色材料的试剂膜上成为其中一部分。粘住珠子16的材料应能使珠子直到液体膜运动停止时仍粘在平面构件12、14上而不至于被扫走。另一个珠子镀膜的可行办法是使珠子悬浮在浓度为0.5％的植烷凝胶(phytagel)溶液中，并通过喷涂或弯月形涂装(meniscuscoating)。珠子16的最佳浓度取决于珠子的类型及它们的制作方法以及上下平面构件12、14的相对硬度决定。通过批量实验(batch-to-batch)，将一系列珠子浓度涂于要用的平面构件12、14，随后加入含有染料如血红蛋白的液体，来决定这个最佳浓度，其中根据所用的含有染料的液体液体层厚度来给出有用的光学密度。绘制该液体层的平均光学密度相对珠子16的密度的变化曲线。来决定增加珠子浓度时对液体层厚度再无影响的点；例如，腔的高度20基本一致的点。另一种提供分离器的方法是在平面构件12、14两者之一反向浮饰，产生平均高度大约4微米的凸起，例如用激光刻蚀技术在压送辊产生凹陷的方式将平面构件12、14之一通过该压送辊组合。
图7示出了带有壳32的磁带盒30，其中有一个源卷轴34、接收卷轴36和在两者之间延展的磁带38。“磁带38”是上述的、图6中所示的本发明的实施例。开始时，磁带38绕在源卷轴34上。磁带38的前进由转子40控制，转子40可牵引磁带38到离测试区域42很远之处并根据需求从源卷轴34处将磁带38牵引过来。磁带盒30上有一通孔使得光学系统可经由磁带38提供照明。
图8示出了包括磁带盒32在内的光学分析系统44。光学分析系统44由联在一起的零件组成，其中有透镜46，可变波长光源48和电荷耦合(CCD)相机50，该系统在三维方向可动，以使得该系统在测试区域42处聚焦于磁带38，并能在X-Y方向上运动以便能扫描到整个测试区域42，而这些都由系统计算机52来控制。用来从样品试管中提取生物流体并把样品滴一小滴在磁带38上的样品探头在这里没有示出。采样装置可以采用管状穿刺式探头或相似的探头，用步进马达驱动针管提取并滴生物流体样品。这些装置被广泛采用并为本领域人员所熟知，因此不再进一步描述。
图9示出了图8中在一滴生物流体54(如血液)滴入平面构件12、14之间形成的腔18中样品入口处28(见图6)后的装置。
图10是生物流体34的样品膜64整个区域的示意图，其一般来说有不规则的边界。在本例中，生物流体是血液。由于在样品膜64中的白细胞倾向于很容易夹在腔18中，一般来说在进口28的几毫米之内白细胞浓度达到最高。
图11为图10中分析区域66的示意图，其中如果是整个血液样品的话，会显示出被血浆62包围的血红细胞56、白细胞58、血小板60。也可以看到珠子16，且由于尺寸和折光率的不同很容易将其和其它成分区分开。
用传统图示法或美国专利5321975及6350613中所述的技术，对每个单独的白细胞58进行分类，从而表证白细胞58(白细胞分类计数)的特性。这两篇专利都在此作为参考。有大量的区别显色不同类型白细胞的离体活体染色/染料的描述，正如美国专利6235536中所描述，这篇专利也在此作为参考。由于白细胞58稍受压力极易显像，在出现有问题的分类时，保存的细胞图像可由技术人员观察。
作为本发明实用性的一个例子，样品膜64中白细胞58计数通过枚举所有在样品膜64中发现的白细胞58并除以样品膜64的体积来实现。尽管有可能将特定数目的样品放入腔18中，然而放置大致数量并间接测量体积这一方式更为优选。这种方式由如下机理实现1)第一次滴样品的样品滴体积可利用干涉成像根据光学技术来计算，该光学技术可以的自美国康涅狄格州Middlefield的Zygo公司；或者2)膜成型后的样品体积通过测量膜64的面积并乘与膜的平均高度来得到。
图6A示出了包括现本发明的另一实施例10的光学分析系统44，其包括磁带盒30，在该磁带盒中有下平面构件卷轴68、上平面构件卷轴70，接收卷轴72。平面构件12、14的行进由接收压送辊74控制，接收压送辊74在离测试区域42很远的地方提供牵引力给结合的平面构件12、14，并可根据所需将平面构件12、14从它们的卷轴上拉过来。光学分析系统44由一些连在一起的零件组成，其中有透镜46，可变波长的光源48和一个CCD照相机，这个光学分析系统在三维方向上可动使其聚焦在测试区域42上的连接在一起的平面构件12、14上，并提供X-Y运动使其能扫描完整个测试区域42，所有这些均在系统计算机52的控制下。示出了滴在下平面构件14上的一滴生物流体54(如血液)。压送辊74运转可将平面构件12、14送至刚过压送辊74的一处，在此处排列在平面构件12、14之间的分离器16与两构件相接，生物流体接触到两平面构件12、14的内层表面24并延展成一薄薄的样品膜64。平面构件12、14被带向前以便于被光学分析系统44读取。
由于系统44的整体准确度在使用体积测量方法时是依赖于腔高度20的准确度，因此用内标方法测量确切的腔的高度20是可取的。内标的一个例子中有不与样品混溶的柔性材料或流动材料，并且其中包含已知的、稳定和均一浓度的光敏染料。这些材料可以是染好色的柔性珠子，染色油或类似的材料可以出现在腔18的一个或多个区域之中。由于光学密度与校准材料的厚度成正比，对完全充满腔高度20的部分校准材料的光学密度进行测量，可以使得腔的准确高度20的计算在光学系统的精确能力内。
尽管腔18最大频率地用于在整个血液中枚举出血细胞，但其在测量许多未稀释的、有足够粒子计数的液体时也是同样有用。腔的高度20不限于现在所说的4微米，而能随着不同分离器的尺寸或浓度可大可小。
尽管本发明已经根据详细的具体实施例来进行显示和描述，但是，本领域技术人员可以理解，可以作出各种形式和细节上的改变而不偏离本发明的主旨和范围。
权利要求
1.一种用于分析生物流体的仪器，其包括第一平面构件；第二平面构件，其中至少第一平面构件和第二平面构件之一是透明的；至少三个设置在平面构件之间的分离器，其将平面构件分隔开，以形成在平面构件之间延展的具有一定高度的腔；其中，至少第一平面构件和第二平面构件之一，或分离器是柔软的以使得腔的高度基本一致。
2.根据权利要求1所述的仪器，其特征在于，第一平面构件和第二平面构件中至少其中之一包括柔性塑料。
3.根据权利要求2所述的仪器，其特征在于，第一平面构件和第二平面构件都包括柔性塑料。
4.根据权利要求1所述的仪器，其特征在于，分离器相对于第一平面构件和第二平面构件是柔性的。
5.根据权利要求1所述的仪器，其特征在于，分离器、第一平面构件和第二平面构件的其中之一至少要比其他的分离器、第一和第二平面构件具有更大的柔性。
6.根据权利要求5所述的仪器，其特征在于，第一平面构件比第二平面构件和分离器具有更大的柔性。
7.根据权利要求1所述的仪器，其特征在于，分离器连接在第一平面构件和第二平面构件至少其中之一上。
8.根据权利要求1所述的仪器，其特征在于，至少第一平面构件或第二平面构件之一包括连接的刚性零件。
9.根据权利要求1所述的仪器，其特征在于，第一平面构件和第二平面构件之一包括连接的刚性零件，而另外一个平面构件则包括柔性塑料。
10.根据权利要求1所述的仪器，其特征在于，分离器包括均匀染色，可轻微挤压的塑料珠子。
11.根据权利要求1所述的仪器，其特征在于，分离器是连接在第一平面构件和第二平面构件至少一个上、高度均一的凸起。
12.根据权利要求1所述的仪器，其特征在于，第一平面构件和第二平面构件其中之一包括一个或多个孔。
13.一种用于分析生物流体的仪器，其包括一个包括彼此间隔并在离散点粘结的第一平面构件和第二平面构件的磁带，其中第一平面构件和第二平面构件中至少一个是透明的，在平面构件间至少形成有一个有一定高度的腔，至少三个分离器设置在其中一个腔中，第一平面构件、第二平面构件或分离器中至少一个是柔性的使得腔的高度可以保持基本一致；一个磁带卷绕其上的源卷轴；和一个磁带卷绕其上的接收卷轴。
14.根据权利要求13所述的仪器，其特征在于，至少一个腔有孔。
15.根据权利要求13所述的仪器，其特征在于，分离器、第一平面构件和第二平面构件其中之一至少要比其他两个之一有更大的柔性。
16.根据权利要求15所述的仪器，其特征在于，第一平面构件比第二平面构件和分离器的柔性更大。
17.根据权利要求13所述的仪器，其特征在于，第一平面构件和第二平面构件的至少之一包括柔性塑料。
18.根据权利要求17所述的仪器，其特征在于，第一平面构件和第二平面构件都包括柔性塑料。
19.根据权利要求13所述的仪器，其特征在于，分离器连接在第一平面构件和第二平面构件至少之一上。
20.根据权利要求13所述的仪器，其特征在于，第一平面构件和第二平面构件两者之一包括连接的刚性零件，另外一个平面构件则包括柔性塑料。
21.根据权利要求13所述的仪器，其特征在于，分离器包括均匀染色，可轻微挤压的塑料珠子。
22.一种用于分析生物流体的仪器，包括第一平面构件；第一源卷轴；第二平面构件，第一平面构件和第二平面构件中至少有一个是透明的；第二源卷轴；多个连接在第一平面构件或第二平面构件上的分离器；一对压送辊，其彼此分开一段距离，以使得第一平面构件和第二平面构件在压送辊之间被牵引时与所有分离器都能接触到；至少一个一定高度的腔，该腔形成于两平面构件之间、压送辊辊下游处，其中，第一平面构件和第二平面构件之一或分离器是柔软的使得腔的高度能基本一致；和至少一个接收卷轴来接收一个或两个所述平面构件。
23.根据权利要求22所述的仪器，其特征在于，至少一个腔中有一个孔。
24.根据权利要求22所述的仪器，其特征在于，分离器、第一平面构件和第二平面构件其中之一至少要比其他两个之一有更大的柔性。
25.根据权利要求24所述的仪器，其特征在于，第一平面构件有比第二平面构件和分离器更大的柔性。
26.根据权利要求22所述的仪器，其特征在于，第一平面构件和第二平面构件两者之一包括连接的刚性零件，另外一个平面构件则包括柔性塑料。
27.一种用来枚举整个抗凝固血液样品的细胞或粒子成分的方法，其包括以下步骤提供一种用于分析生物流体的仪器，该仪器包括第一平面构件，第二平面构件，其中至少两者之一是透明的；至少三个排列在平面构件之间的分离器，将平面构件分隔开以形成在平面构件之间延展的并具有一定高度的腔；其中第一平面构件和第二平面构件中至少一个，或分离器是柔软的，以使得腔的高度能基本一致；将一定数量的生物流体沉积与第一平面构件或第二平面构件的表面相接触；两构件相互接近，以在由分离器分隔的两平面构件之间限制的生物流体形成膜；测出膜内包含的生物流体的体积；直接或间接枚举出膜内基本上所有的有用成分；以单位体积计数来表示枚举的成分。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，生物流体是血液。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤通过测量分离器的透过光的平均衰减作用来计算腔的高度。
30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，测定膜内生物流体的体积还包括以下步骤测量膜的面积；和将腔的高度乘以膜的面积计算出生物流体的体积。
31.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，两构件互相接近前，由沉积在平面构件上的生物流体液滴的干涉图像计算得出膜的体积。
32.一种用来枚举整个抗凝固血液样品的细胞或粒子成分的方法，其包括以下步骤提供包括相互间隔并在离散点粘结的第一平面构件和第二平面构件的磁带，其中第一平面构件和第二平面构件中至少一个是透明的，在平面构件间形成至少一个有一定高度的腔，至少三个分离器设置在所述至少一个腔的每一个中，第一平面构件和第二平面构件中至少一个或分离器中是柔性的以使得腔的高度可以保持基本一致，一个磁带可卷绕其上的源卷轴，一个磁带可卷绕其上的接收卷轴；将一定量的生物流体沉积在至少一个腔中；测出包含在至少一个腔中至少一部分生物流体的体积；直接或间接列举出膜内所有的有用成分；以单位体积计数来表示枚举的成分。
全文摘要
一种分析生物流体的仪器，该仪器包括第一平面构件，第二平面构件，和至少三个分离器。至少一个平面构件是透明的。分离器放置在两平面构件之间，将这两组件分隔成具有一定高度的腔。至少一个组件或分离器足够柔软使得腔的高度与分离器的平均尺寸大小相当。在使用过程中，要分析的生物流体被放置在腔内部。
文档编号G01N15/14GK1957254SQ200580016745
公开日2007年5月2日 申请日期2005年4月7日 优先权日2004年4月7日
发明者史蒂芬·C·沃德劳 申请人:沃德劳有限合伙公司, 罗伯特·A·莱温, 史蒂芬·C·沃德劳