白消安免疫测定的制作方法

专利名称：白消安免疫测定的制作方法
技术领域：
本领域涉及确定人生物学流体中白消安的存在和/或确定其量以快速确定化学治疗中的最佳药物浓度的免疫测定领域。
背景技术：
癌症是用于描述一组恶性肿瘤的术语，当身体部分中的细胞开始不受控制地生长时，所有所述恶性肿瘤共享共同的发育性状。大多数癌症成为肿瘤，但也可出现在血液中并循环通过其他组织，它们在所述其他组织生长。癌恶性肿瘤最常用外科手术、化学疗法和/或放射疗法的组合进行治疗。用于治疗具体癌症的治疗类型取决于数种因素，包括癌恶性肿瘤的类型及其被诊断时的病期。
白消安是常用的细胞毒素剂，它用于治疗慢性髓细胞性白血病和高剂量移植前调制(conditioning)。这种化学治疗剂具有下式 这种化合物与使人虚弱的副作用有关，所述副作用例如粘膜炎、肝静脉梗阻症和骨髓抑制。通过监控体内的白消安水平并调节剂量，这些副作用在患者中可以得到较好控制和限制。
同时，在白消安的剂量和所产生的影响治疗效果的血清药物浓度之间常存在高度变化的关系。白消安的个体内和个体间药物代谢动力学可变性程度可以高达10倍(Slattery等人Blood 89(8)pp 3055-3060)并且受诸多因素影响(Gurney等人，J.Clin.Oncol.14，pp 2590-2611，1996)，所述因素包括○器官功能○遗传调节○疾病状况○年龄
○药物-药物相互作用○药物摄入的时间○药物施用方式，以及○技术相关的施用。
由于这种可变性，不同个体中同等剂量的相同药物可以导致明显不同的临床结果(Hon等人Clinical Chemistry 44，pp 388-400，1998)。基于个体的药物清除和患者中的最终血清药物浓度，相同白消安剂量的功效相当大地变化。治疗性药物管理将给临床医生提供关于患者在经口和静脉内药物施用中变化的理解。伴随治疗性药物管理，药物剂量将针对患者进行个别化处理，并且有效治疗癌症而没有不希望的副作用的机会将更高(Nieto，Current Drug Metabolism 2pp 53-66，2001)。
此外，白消安的治疗性药物管理将充当良好的工具以确保顺从实际处方剂量施用化学治疗并达到有效的血清浓度水平。已发现血清浓度的可变性不仅由生理因素引起，而且可以由施用技术的变化引起。
白消安的常规治疗性药物管理将要求适合一般实验室设备的简单自动化测试的可用性。目前关于白消安的测试涉及气相层析/质谱法(Slattery等人，Bone Marrow Transplant 16pp 31-42，1995)。GC/MS是劳动密集型的且昂贵。最适合简单和有效性标准的测试是免疫测定。为了最有效地监控药物水平，抗体应当对活性化合物最特异并对非活性阻断代谢物显示极低的交叉反应性至无交叉反应性，所述代谢物特别是四氢噻吩砜、四氢噻吩和四氢噻吩-3-醇-1，1-二氧化物。[四氢-3-噻吩醇1，1-二氧化物]。
发明概述根据本发明已生产一类新型抗体，它们基本上与白消安选择性反应以便与白消安结合而与白消安代谢物基本上没有任何交叉反应性，所述代谢物特别是四氢噻吩砜、四氢噻吩和四氢噻吩-3-醇-1，1-二氧化物。选择性反应是指这种抗体只与白消安分子反应并且基本上不与阻断性白消安代谢物反应，所述代谢物是四氢噻吩砜、四氢噻吩和四氢噻吩-3-醇-1，1-二氧化物。[四氢-3-噻吩醇1，1-二氧化物]。
已发现通过使用免疫原产生对白消安特异并且基本上不与白消安的阻断性代谢物反应或结合的抗体，所述免疫原是免疫原性多胺聚合物与化合物的缀合物，所述化合物是式II-A的化合物 其中A为较低级的亚烷基；X′为功能性连接基团；Y为有机间隔基团；X为能够与多胺聚合物结合的末端官能团；p和z为0-1的独立整数；式II-B的化合物 其中A′为较低级的亚烷基或较低级的亚链烯基(alkenylene)；X′、Y、X、p和z如上所述或其混合物，所述代谢物是四氢噻吩砜、四氢噻吩和四氢噻吩-3-醇-1，1-二氧化物。基本上与白消安选择性反应并且不与四氢噻吩砜、四氢噻吩和四氢噻吩-3-醇-1，1-二氧化物交叉反应的这些抗体的提供允许人们产生免疫测定，所述测定可以特异性检测并监控白消安治疗的患者流体样品中的白消安。还包括在本发明内的是用于所述免疫测定的试剂和试剂盒。
详述根据本发明提供了一类新型抗体，它们基本上与白消安选择性反应并且基本上不与上述白消安代谢物反应或交叉反应。已发现通过使用式II-A和II-B的这些α-取代的白消安衍生物作为免疫原，可以提供本发明的这类新型抗体。通过使用这些抗体已开发了用于检测和/或定量血液、血浆或其他体液样品中的白消安的免疫测定，包括用于此类免疫测定的试剂和试剂盒。通过使用这种免疫测定，可以检测和/或定量体液样品优选血液或血浆样品中的白消安的存在和量。这样，在治疗过程中可以监控用白消安治疗的患者并且根据所述监控调整其治疗。通过本发明人们可以达到用白消安作为化学治疗剂治疗的癌症患者中白消安的治疗性药物管理。
本发明测定中利用的试剂是聚合物载体与式II-A和II-B的化合物的缀合物。这些缀合物是样品中存在的白消安与本发明抗体结合的竞争性结合配偶体。因此，与抗体结合的缀合物试剂量将与样品中的白消安量成反比。根据本发明，该测定利用任何常规测量方法用于检测并测量与抗体结合或未结合的所述缀合物量。通过使用所述方法，可以测定结合或未结合的缀合物量。一般通过将样品中白消安所产生的结合或未结合缀品物的测得量与由包含已知量白消安的样品的标准或校准曲线确定的结合或未结合缀合物的值联系起来确定样品中白消安的量，所述已知量在待测样品的预期范围内。利用与样品所使用的相同的免疫测定操作来确定产生校准曲线的这些研究。
由式II-A和II-B的化合物制备缀合物以及免疫原。载体缀合物或免疫原与式II-A和II-B化合物的多胺聚合物配体部分连接，其中X为X′。这些配体部分可以与载体或免疫原多胺聚合物上的一个或多个活性位点连接。
定义在本说明书自始至终应理解下述定义如本申请自始至终所使用的，术语“Me”指甲基原子团。术语“较低级的亚烷基”指包含1-6个碳原子的二价饱和直链或支链烃取代基。术语“较低级的亚链烯基”指包含2-6个碳原子并且在烃链中包含不饱和双键的二价直链或支链烃基团。
术语“免疫原”和“免疫原性”指能够在生物内引起、产生或生成免疫应答的物质。
术语“缀合物”指由两个部分结合在一起形成的任何物质。根据本发明的代表性缀合物包括通过将小分子例如式II的化合物与大分子例如载体或多胺聚合物特别是蛋白质结合在一起形成的那些。在缀合物中，小分子可以结合在大分子的一个或多个活性位点上。术语缀合物包括术语免疫原。
“半抗原”是部分或不完全抗原。它们是不含蛋白质的物质，主要是低分子量物质，它们不能刺激抗体形成，但它们可以与抗体反应。后者通过将半抗原与高分子量的免疫原性载体偶联并随后将这个偶联的产物即免疫原注射到人或动物受试者中形成。本发明的半抗原是白消安。
如本文所使用的，“间隔基团”或“间隔基”指通过CH2或功能性连接基团连接两个或更多个亚结构例如半抗原、载体、免疫原、标记或示踪物的化学结构部分。这些间隔基团将在本申请下文中被列举。间隔基团的原子以及间隔基团内部链的原子自身通过化学键相连。优选的间隔基中有直链或支链、饱和或不饱和的碳链。这些碳链还可在链的内部或在链的末端包括一个或多个杂原子。“杂原子”指除碳以外选自氧、氮和硫的原子。间隔基团还可包括环状或芳族基团作为链的一部分或作为链中一个原子上的取代基。
通过计数除氢以外的原子来确定间隔基团中的原子数目。通过沿着被连接的亚结构之间的最短路线计数除氢以外的原子数目来确定间隔基团内部链中的原子数目。功能性连接基团可用于激活半抗原或间隔基团，例如在半抗原或间隔基团上提供可用的功能位点，以用于合成半抗原与标记或载体或多胺聚合物的缀合物。
如本文所使用的术语“免疫原性载体”是免疫原性物质，通常为蛋白质，它可以与半抗原结合，在这个实例中所述半抗原为上文所述的白消安或白消安衍生物，从而使得这些半抗原衍生物能够诱导免疫反应并引起可以与这些半抗原特异性结合的抗体产生。免疫原性载体和连接基团将在本申请下文中被列举。免疫原性载体物质中包括蛋白质、糖蛋白、复合多氨基多糖、微粒和核酸，它们被识别为外来的并从而引发来自宿主的免疫应答。利用已知用于这种制备的任何常规方法可以从多糖制备多氨基多糖。
各种蛋白质的类型也可用作聚(氨基酸)免疫原性载体。这些类型包括清蛋白、血清蛋白、脂蛋白等。例证性的蛋白质包括牛血清清蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)等。可替代地，可以利用合成的聚(氨基酸)。
免疫原性载体还可包括多氨基-多糖，它是由单糖重复缩合形成的高分子量聚合物。多糖的实例有淀粉、糖原、纤维素、糖类树胶例如阿拉伯胶、琼脂等等。多糖还包含聚氨基酸残基和/或脂质残基。
免疫原性载体还可以是单独的或与上述聚(氨基酸)或多糖之一缀合的聚(核酸)。
免疫原性载体还可包括固体微粒。微粒直径一般为至少约0.02微米(μm)并且不超过约100μm，并且通常为约0.05μm-10μm。微粒可以是有机的或无机的，可膨胀的或不可膨胀的，多孔的或非多孔的，密度最优地为接近水的密度，一般约0.7-1.5g/mL，并且由可以是透明、部分透明或不透明的材料组成。微粒可以是生物材料，例如细胞和微生物，包括非限制性实例，例如红细胞、白细胞、淋巴细胞、杂交瘤、链球菌(Streptococcus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(E.coli)及病毒。微粒还可包括有机和无机聚合物、脂质体、胶乳、磷脂小泡或脂蛋白。
“聚(氨基酸)”或“多肽”是由氨基酸形成的聚酰胺。聚(氨基酸)的范围一般从约2,000分子量起，没有分子量上限，通常少于10,000,000并且一般不超过约600,000道尔顿。通常将存在不同的范围，这取决于是否涉及免疫原性载体或酶。
“肽”是由酰胺(肽)键连接两个或更多个氨基酸形成的任何化合物，通常为α氨基酸的聚合物，其中直链中每个氨基酸残基(除NH2末端之外)的α氨基基团与下一个残基的α羧基基团连接。术语肽、多肽和聚(氨基酸)在本文中意思相同用于指没有关于大小限制的这类化合物。这类中最大的成员被称为蛋白质。
“标记”、“检测分子”或“示踪物”是产生或可以被诱导以产生可检测的信号的任何分子。标记可以缀合分析物、免疫原、抗体或另一种分子，例如受体或能够与受体结合的分子，例如配体，特别是半抗原。标记的非限制性实例包括放射性同位素、酶、酶片段、酶底物、酶抑制剂、辅酶、催化剂、荧光团、染料、化学发光剂(chemiluminescer)、发光剂(luminescer)或敏化剂；非磁性或磁性微粒、固体支持物、脂质体、配体或受体。
术语“抗体”指抗原的特异性蛋白结合配偶体并且可以是任何物质或物质组，它们具有对排除其他物质的抗原的特异性结合亲和力。通称抗体包含多克隆抗体、单克隆抗体和抗体片段。
术语“衍生物”指由母体化合物通过一次或多次化学反应制成的化学化合物或分子。
术语“载体”指固体微粒和/或聚合性聚合物，例如免疫原性聚合物，例如上述的那些。当载体是固体微粒时，固体微粒可以与多胺聚合物结合、被多胺聚合物包被或以其他方式附着于多胺聚合物以提供一个或多个反应位点，所述位点用于结合式II化合物中的末端官能团X。
术语“试剂盒”或“测试试剂盒”指在执行测定中使用的材料的集合。取决于其交叉反应性和稳定性，可以以在相同或分开的容器内包装的组合的形式，并且以液体或冻干的形式提供试剂。可以选择试剂盒中所提供的试剂的量和比例以便为具体应用提供最佳结果。体现本发明特征的试剂盒包括白消安特异性的抗体。试剂盒可进一步包括分析物的配体以及校准和对照材料。试剂可以保持液体形式或可以被冻干。
短语“校准和对照材料”指包含已知量待测药物的任何标准或参照材料。通过比较从未知样品获得的结果和从标准获得的结果来计算药物浓度。这通常通过构建校准曲线来完成。
术语“生物学样品”包括，但不限于，来自活物或以前的活物的任意量物质。此类活物包括，但不限于，人、小鼠、猴子、大鼠、兔、马及其他动物。此类物质包括，但不限于，血液、血清、血浆、尿、细胞、器官、组织、骨、骨髓、淋巴、淋巴结、滑膜组织、软骨细胞、滑膜巨噬细胞、内皮细胞及皮肤。
试剂和免疫原在免疫测定构建中，构建白消安缀合物以与样品中的白消安竞争抗体上的结合位点。在本发明的免疫测定中，试剂是式II-A和II-B化合物的α-取代的白消安衍生物，其中末端官能团X转化为X″，所述X″类似于X′，是功能性连接基团，它使配体与多胺聚合物连接。在式II-A和II-B的化合物中，接头间隔基组成这些分子的-(X′-Y)z-部分。在缀合物和免疫原制备中这些接头被命名为X′并且间隔基被命名为-Y-。用于制备关于免疫测定的缀合物和免疫原的任何常规间隔基-连接基团均可用于式II-A和II-B的化合物中。此类常规接头和间隔基在美国专利5,501,987和美国专利5,101,015中被公开。
根据本发明的实施方案，式II-A和II-B的化合物中的z可以为0。因此，式II-A和II-B的化合物无需包含任何间隔基团并且X可以直接连接于式II-A和II-B化合物内的其余部分分子。
优选的间隔基团中包括上述的间隔基团。特别优选的间隔基团是如下基团，例如包含1-10个碳原子的亚烷基或亚链烯基，或 -NH-(CH2)m-， 或 其中n和o为0-6的整数并且v为1-6的整数，其中亚烷基为尤其优选的间隔基团。
在由式II-A和II-B的化合物形成缀合物中，X′和X″优选为-CH2-或优选将间隔基连接到聚合物载体上的氨基基团的官能团。基团X″是式II-A和II-B化合物中的末端官能团X的结果，它能够结合多胺聚合物中的氨基基团，所述多胺聚合物用于结合载体或免疫原。能够与胺反应的任何末端官能团均可用作式II化合物中的官能团X。X中优选包括的这些末端官能团为 -N＝C＝R4，或 其中R3是氢或与其附着的氧原子一起形成活性酯，并且R4是氧或硫。原子团-N＝C＝R4可以是异氰酸酯或异硫氰酸酯。由OR3形成的活性酯包括亚氨酸酯，例如N-羟基琥珀酰胺、1-羟基苯并三唑和对硝基苯基酯。然而可以与氨基基团反应的任何活性酯均可使用。羧基基团和活性酯，即 通过常规方法与载体或免疫原性聚合物偶联。多胺聚合物例如蛋白质上的胺基团产生酰胺基团，它连接间隔基与本发明的聚合物、免疫原或载体和/或缀合物。
在本发明的免疫原和缀合物中，利用本领域技术人员已知的各种方法可以确立包含羧基基团的白消安半抗原与载体或免疫原上的多胺聚合物上的氨基基团之间的化学键。常优选形成酰胺键。通过羧基基团与离去基团试剂(例如N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑、对硝基苯酚等)反应首先活化式II化合物中白消安半抗原的羧酸部分来形成酰胺键。可以利用活化试剂，例如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺等。式II的白消安半抗原中激活形式的羧基基团随后与包含蛋白质载体的缓冲溶液反应。
在式II-A和/或II-B的白消安衍生物包含伯氨基或仲氨基基团以及羧基基团的情况下，在活化和偶联反应过程中必须使用胺保护基团以防止缀合物与其自身反应。一般通过形成相应的N-三氟乙酰胺、N-叔丁氧基羰基氨基甲酸乙酯(N-t-BOC氨基甲酸乙酯)、N-苯甲氧甲酰基氨基甲酸乙酯或类似结构来保护缀合物上的胺。一旦如上所述的与免疫原性聚合物或载体的偶联反应已经完成，则可以利用不以其他方式改变免疫原或缀合物结构的试剂去除胺保护基团。此类试剂和方法是本领域技术人员已知的，并且包括弱或强含水酸或无水酸、弱或强含水碱或无水碱、含氢化物的试剂例如氢硼化钠或氰基硼氢钠以及催化氢化作用。缀合半抗原与载体的各种方法也在美国专利3,996,344和美国专利4,016,146中被公开，所述专利引入本文作为参考。
另一方面，当式II-A或II-B化合物中的X是异氰酸酯或硫代异氰酸酯(thioisocyanate)原子团时，当与多胺聚合物的游离胺反应时这些原子团产生缀合物或免疫原，其中在式II-A或II-B的配体部分中的X′或X″是， 与多胺载体或免疫原性多肽上的氨基基团功能性连接。X′或X″形成间隔基团。
当式II-A或II-B化合物中的X是醛基时，经由胺键通过还原性胺化这些化合物可以连接到多胺多肽或载体的胺基团或间隔基团。使醛与胺缩合的任何常规方法例如通过还原性胺化可以用于形成这个键。在这种情况下，式II-A和II-B的配体部分中的X′或X″变成-CH2-。
通过首先用常规的氨基保护基团保护式V化合物中的两个伯胺基团，由式V的化合物制备式II-A和II-B的化合物 任何常规的氨基保护基团均可用于保护式V的化合物。优选的氨基保护基团是Boc[叔丁氧基羰基]。使胺反应以形成这些保护性胺基团的任何常规方法均可用于这个方法中。在下一步骤中，式V化合物中被保护的胺经由Horner或Wittig型反应与式VI的化合物反应 其中A′和p如上所述；并且R6为较低级的烷基并且X1为能够与多胺聚合物结合的末端官能团以形成式VII的化合物 其中X1、A′和p如上所述；并且R8为氨基保护基团。
如果希望产生具有接头间隔基团X′-Y的式II-A或II-B的化合物，则式VII的化合物与式VIII的化合物反应R10YXVIII其中R10为卤或NH2；X为能够与多胺聚合物反应的末端官能团；并且Y如上所述。
在其中式VIII化合物中的X1是活性酸衍生物的情况下，它通过形成常规的酯保护基团被保护。式VII和VIII的化合物反应产生式IX的化合物 其中R8、A′、p、X′、Y、X和z如上所述。
取决于式VII化合物中的官能团X，产生式IX化合物的式VII和VIII的化合物反应通过任何方法来执行，例如使如上所述的异氰酸酯、异硫氰酸酯、活性酯、酸或醛基与卤化物或胺缩合。
如果决定产生式II-A的化合物，则通过常规方法使式IX化合物中的双键氢化以使它们还原为饱和键。这将产生式X的化合物 其中A、z、p、X′、Y和X如上所述。
可以执行任何常规氢化方法以使式IX的化合物转化为式X的化合物。一般地这个反应利用披钯碳催化剂与氢一起进行。这种经由氢化的还原不仅还原了附加物与被保护的二胺链之间的双键，而且还原了取代基Y中的所有双键。如果希望产生含双键的间隔基Y取代基，则可以首先通过例如如上所述的氢化还原式VII的化合物以产生式VII-A的化合物
其中R8、A、p和X1如上所述并且与式VIII的化合物反应以获得式X的化合物，其中Y为包含至少一个双键的取代基。
在本发明的下一个步骤中，通过去除此类基团的任何常规方法从式IX或式X的化合物中去除氨基保护基团以形成式XI的化合物 其中A、p、z、X′和X如上所述；或式XII的化合物 其中A′、p、z和X如上所述。
这可以通过常规酸性水解来完成，例如用三氟乙酸，它特别适合于此类氨基保护基团并将使氨基基团转化为其酸加成氨基盐。经由甲磺酰化作用通过与甲磺酰氯(甲磺酰氯(mesychloride))反应，式XI和XII化合物的这些氨基盐可以分别转化为式II-A和II-B的化合物。这样，在式XI和XII化合物中的两个末端氨基基团的每一个上可以导入末端氨基基团上的甲磺酰基团。
在进行这个反应时，在式IX、X、XI和XII化合物中最好经由酯保护基团来保护游离的活性酸衍生物。在甲磺酰化作用后式II-A和II-B化合物的形成中，酸保护基团可以通过酸性水解去除。
通过使式II-A和II-B的化合物与多胺或多肽反应，可以将这些化合物转化为本发明的免疫原和/或缀合物试剂。假如多胺或多肽有免疫学活性，那么相同的多肽可以用作载体以及在本发明的免疫原中用作免疫原性聚合物。然而，为了形成缀合物，这些聚合物无需如免疫原所需产生免疫应答。根据本发明，通过使官能团与聚合物内包含的胺基团附着的常规方法，式II-A和II-B化合物中用X代表的各种官能团可以与聚合材料缀合。根据优选实施方案，式II-A和II-B化合物中的X为羧酸基团。
抗体本发明还涉及新型抗体，其包括利用上述免疫原产生的针对白消安的单克隆抗体。根据本发明，已发现根据本发明所产生的这些抗体与白消安选择性反应并且不与代谢物反应，所述代谢物会干扰关于白消安的免疫测定。本发明抗体不与这些四氢噻吩砜、四氢噻吩和四氢噻吩-3-醇-1，1-二氧化物代谢物反应的能力使得这些抗体在提供关于白消安的免疫测定方面特别有价值。
本发明涉及针对白消安的新型抗体和单克隆抗体。通过用本发明的免疫原免疫宿主动物可以方便地产生本发明的抗血清。合适的宿主动物包括啮齿类动物，例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠等，或较高等的哺乳动物，例如山羊、绵羊、马等。根据关于在动物中引起免疫应答的公认方案，可以给予初始剂量、放血和加强接种，例如在一个优选实施方案中，小鼠接受100ug免疫原/小鼠的初始剂量，腹膜内(i.p.)，以及在6个月的时间段内两次或更多次后续50-100 ug免疫原/小鼠的加强接种。通过定期放血，利用常规免疫测定观察到被免疫小鼠的血液样品发展了针对白消安结合的免疫应答。这些方法提供了便利方法以筛选产生具有所需活性的抗血清的宿主。抗体还针对白消安代谢物进行筛选并且显示基本上不与这些化合物结合。
通过根据上述方案免疫Balb/c小鼠随后在细胞融合前4天开始连续三天给小鼠腹膜内或静脉内(i.v.)注射100ug免疫原来方便地产生多克隆抗体。当然也可以采用抗体领域众所周知的其他方案。本文详述的完全免疫方案提供了针对白消安抗体的血清抗体应答的最佳方案。
从脾、外周血、淋巴结或宿主其他组织获得的B淋巴细胞可以用作单克隆抗体生产性细胞。最优选的是从脾获得的B淋巴细胞。通过将此类B淋巴细胞与无限增殖化细胞系融合获得能够产生本发明所需单克隆抗体的杂交瘤，所述无限增殖化细胞系是对杂交细胞赋予长期组织培养稳定性的细胞系。在本发明的优选实施方案中，无限增殖化细胞可以是类淋巴母细胞或浆细胞瘤细胞，例如骨髓瘤细胞，它本身是抗体产生性细胞但也是恶性的。通过将小鼠骨髓瘤细胞与来自针对白消安-蛋白质缀合物免疫的小鼠的脾细胞融合形成产生白消安单克隆抗体的鼠杂交瘤。通过克隆来自杂交瘤细胞的抗体表达基因并采用本领域现在众所周知的重组DNA方法将小鼠可变区的子序列与人恒定区连接或将人构架区与来自供体小鼠或大鼠免疫球蛋白的互补决定区(CDR′s)组合，可以产生嵌合的和人源化的单克隆抗体。实现鼠单克隆抗体人源化的改进方法在国际专利申请WO 92/11018中得到阐述，所述方法提供亲和力增强的抗体。
可以生产仅包括部分主要抗体结构的多肽片段，这种片段具有一种或多种免疫球蛋白活性。利用本领域众所周知的方法通过完整抗体的蛋白酶剪切，或利用定点诱变通过将终止密码子插在包含抗体基因的表达载体的所需位置上以产生Fab片段或(Fab′)2片段，可以产生这些多肽片段。通过用DNA接头连接VL和VH区可以产生单链抗体(参见，Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，855879-5883(1988)和Bird等人，Science，242423-426(1988))。
本发明的抗体对白消安是选择性的而与白消安阻断性代谢物基本上没有任何交叉反应性，所述代谢物是四氢噻吩砜、四氢噻吩和四氢噻-3-醇-1，1-二氧化物。基本上没有任何交叉反应性指本发明的抗体具有的与这些阻断性代谢物的交叉反应性为相对于与白消安的交叉反应性的少于10％，优选少于5％。
免疫测定根据本发明，由式II的这些化合物或其混合物的免疫原产生的缀合物和抗体可以用作确定患者样品中白消安的试剂。这种确定通过免疫测定来执行。其中由式II的化合物形成的试剂缀合物与样品中的白消安竞争根据本发明产生的抗体上的结合位点的任何免疫测定均可用于确定患者样品中白消安的存在。在怀疑含有白消安的样品中进行此类关于白消安测定的方法包括组合(a)水性介质样品、(b)根据本发明所产生的针对白消安的抗体以及(c)由式II的化合物或其混合物形成的缀合物。通过测量加入到样品和抗体混合物中的已知量缀合物与特异性抗体结合的抑制可以确定样品中白消安的量。将已知量缀合物的此类结合被未知样品抑制的结果与在相同测定中通过利用已知白消安标准溶液得到的结果进行比较。在确定未知样品中的白消安量时，样品、由式II化合物形成的缀合物以及抗体可以以任何顺序加入。
各种方法可以用于测量与抗体结合的由式II化合物形成的缀合物量。一种方法是其中缀合物与抗体的结合导致荧光团缀合物旋光率下降。液体混合物中荧光团缀合物旋光率的下降量可以通过荧光偏振技术来检测，所述技术例如美国专利4,269,511和美国专利4,420,568中所公开的。在这种情况下，样品为流体样品并且抗体可溶解于包含样品和缀合物的水性介质中。
另一方面，抗体可以包被或吸附在纳米微粒(nanoparticle)上从而使得当这些微粒与由式II化合物形成的白消安缀合物反应时，这些纳米微粒形成聚集体。然而，当抗体包被或吸附的纳米微粒与样品中的白消安反应时，与这些纳米微粒结合的来自样品的白消安不引起抗体纳米微粒聚集。通过吸光度可以测量测定混合物中的聚集或凝集量。
另一方面，通过将抗体或白消安缀合物与固体支持物附着可以进行这些测定，所述固体支持物例如微量滴定板或任何其他常规固体支持物，包括固体微粒。使抗体和蛋白质与此类固体微粒附着是本领域众所周知的。可以采用任何常规方法实现此类附着。在许多情况下，为了帮助测量，可以将标记放置在抗体、缀合物或固体微粒上，例如放射性标记或酶标记，作为检测与抗体结合或未结合的由式II化合物形成的缀合物量的辅助物。其他合适的标记包括发色团、荧光团等。
为方便起见，本发明的测定组分可以以试剂盒的形式提供，所述试剂盒为白消安测定中采用的预定量新型试剂的包装的组合。这些试剂包括本发明的抗体以及由式II化合物形成的缀合物。
除了这些必需试剂外，可以包括添加剂例如辅助试剂，例如稳定剂、缓冲剂等。各种试剂的相对量可以广泛地改变以提供基本上使测定灵敏性最优化的试剂溶液浓度。试剂可以以溶液的形式或作为干燥粉末，通常作为冻干粉末提供，包括赋形剂，其溶解后将为执行测定提供具有合适浓度的试剂溶液。
实施例在实施例中，Me代表甲基。在实施例中，下述缩写用于指定下述物质THF四氢呋喃TEA三乙胺TFA三氟乙酸EtOAc 乙酸乙酯NHSN-羟基琥珀酰亚胺MeOH 甲醇EDC1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺氢氯化物TLC薄层层析ANS8-苯胺基-1-萘磺酸i.p. 腹膜内HRP辣根过氧化物酶TMB3，3′，5，5′-四甲联苯胺TRIS 三(羟甲基)氨基甲烷氢氯化物BSA牛血清清蛋白BTG牛甲状腺球蛋白KLH匙孔血蓝蛋白PBS磷酸缓冲盐水di 去离子水在这些实施例中，下面的方案1和方案2阐述了实施例中制备和通过编号提及的具体化合物。方案如下
方案1
方案2 实施例1白消安衍生物[7]的制备(方案1)向溶于8mL氯仿的1，4-二氨基-2-丁酮二氢氯化物(0.193g，1.1mmol)和TEA(0.76mL，5eq)悬浮液中逐滴加入溶于2mL氯仿的重碳酸二叔丁酯(0.48g，2eq.)。将所得到的混合物回流加热3小时，冷却至室温，用50mL氯仿稀释，并用1N HCl(2×15mL)、H2O(20mL)、饱和NaHCO3(25mL)和盐水(30mL)洗涤，随后用硫酸钠干燥1/2小时。浓缩有机层得到产物[1](黄色固体，95％得率)。产物结构由NMR确认。
向溶于15mL无水THF的[1](0.9g，3mmol)和三乙基4-膦酰基巴豆酸酯(1.6mL，2.2eq)溶液中按份加入氢化钠(0.26g，2.2eq.)。将所得到的混合物在室温下搅拌2小时。TLC显示反应并未彻底完成。去除溶剂得到残渣，所述残渣用EtOAc(80mL)吸收，用H2O(2×40mL)、盐水(40mL)洗涤，并用硫酸钠干燥1/2小时。浓缩有机层得到粗产物[2](褐色油)，它通过具有EtOAc/己烷溶剂系统的急骤柱层析进行纯化(20％得率)。产物结构由NMR确认。
在20％(w/w)Pd-C上于大气压下将溶于15mL MeOH的化合物[2](500mg，1.25mmol)溶液氢化12小时。将混合物用20mL MeOH稀释、通过滤纸过滤并浓缩以产生得率为60％的300mg产物[3]，由NMR确认结构。
向溶于1mL氯仿的化合物[3](300mg，0.75mmol)悬浮液中加入4mL三氟乙酸。将所得到的混合物在室温下搅拌1小时。去除溶剂和额外的TFA得到作为褐色油的化合物[4]，它无需进一步纯化即可在下一步骤反应中使用(100％得率)。
在冰水浴搅拌中向溶于10mL氯仿的化合物[4](0.32g，0.75mmol)、TEA(2.1mL，20eq.)悬浮液中逐滴加入溶于5mL氯仿的甲磺酰氯(0.6mL，10eq)。允许所得到的混合物加温至室温并在室温下搅拌过夜。去除溶剂得到粗产物(褐色油)，它通过具有EtOAc/己烷溶剂系统的急骤柱层析纯化以得到[5](140mg，52％得率)，由NMR确认结构。
将溶于甲醇/水(4∶1，10ml)的乙酯白消安衍生物[5](140mg，0.34mmol)和氢氧化钠(110mg，7eq)混合物回流加热2小时，用10mLH2O稀释并用1N盐酸酸化至pH1。去除溶剂得到粗产物，所述粗产物用6ml MeOH吸收。滤去NaCl盐并浓缩滤液产生得率为100％的产物[6]，由NMR确认结构。
向溶于3mL DMSO的白消安酸衍生物[6](120mg，0.36mmol)溶液中加入EDC·HCl(209mg，3eq.)和NHS(125mg，3eq.)。将反应混合物在室温下在氮下搅拌过夜以产生化合物[7]。将粗反应混合物用于实施例3、4和5的蛋白质缀合物。
实施例2白消安衍生物[11]的制备方案2向溶于1mL氯仿的来自实施例1的化合物[2](0.43g，1.08mmol)悬浮液中加入4mL三氟乙酸。将所得到的混合物在室温下搅拌1/2小时。去除溶剂和额外的TFA得到作为褐色油的化合物[8]；结构由NMR确认。这种材料无需进一步纯化即可在下一反应中使用(100％得率)。
向冰水浴中的溶于10mL氯仿的化合物[8](0.43g，1mmol)和TEA(2.8mL，20eq.)悬浮液中逐滴加入溶于5mL氯仿的甲磺酰氯(0.8mL，10eq)。允许所得到的混合物加温至室温并在室温下搅拌过夜。去除溶剂得到粗产物[9](褐色油)，它通过具有EtOAc/己烷溶剂系统的急骤柱层析进行纯化(30％得率)。结构由NMR确认。
将溶于甲醇/水(4∶1，10ml)的乙酯[9](160mg，0.45mmol)和氢氧化钠(110mg，7eq)混合物回流加热2小时，用10mL H2O水稀释并用1N盐酸酸化至pH1。去除溶剂得到粗产物，所述粗产物用6ml MeOH吸收。滤去NaCl盐并浓缩滤液产生产物[10](100％得率)。结构由NMR确认。
向溶于2mL DMSO的白消安酸衍生物[10](50mg，0.15mmol)溶液中加入EDC·HCl(88mg，3eq.)和NHS(52mg，3eq.)。将反应混合物在室温下在氮下搅拌过夜以产生活化的NHS酯[11]。将粗反应混合物用于实施例6的蛋白质缀合物。
实施例3白消安BTG免疫原的制备在冰浴中搅拌溶液的同时向溶于50mM磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.5)的17mL BTG(21.2mg/mL)中逐滴加入0.625mL实施例1中制备的活化的N-羟基琥珀酰亚胺酯白消安衍生物[7](溶于DMSO中，40mg/mL)。允许所得到的混合物在室温下搅拌过夜以使BTG与白消安衍生物[7]缀合。免疫原性缀合物随后通过透析进行纯化并根据先前所述方法(Wu等人，Bioconj.Chem.，8pp 385-390，1997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1997，Salamone等人，J.ForensicSci.pp 821-826，1998)进行表征。
实施例4白消安KLH免疫原的制备在冰浴中搅拌溶液的同时向溶于50mM磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.5)的24mL KLH(20.8mg/mL)中逐滴加入0.9mL实施例1中制备的活化的N-羟基琥珀酰亚胺酯白消安衍生物[7](溶于DMSO中，40mg/mL)。允许所得到的混合物在室温下搅拌过夜以使KLH与白消安衍生物[7]缀合。免疫原性缀合物随后通过透析进行纯化并根据先前所述方法(Wu等人，Bioconj.Chem.，8pp 385-390，1997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1997，Salamone等人，J.ForensicSci.pp 821-826，1998)进行表征。
实施例5具有衍生物7的白消安-BSA缀合物的制备在冰浴中搅拌溶液的同时向溶于磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.5)的20mL BSA溶液(50mg/mL)中逐滴加入0.9mL实施例1中制备的活化的N-羟基琥珀酰亚胺酯白消安衍生物[7](溶于DMSO中，40mg/mL)。允许所得到的混合物在室温下搅拌过夜以产生活化的酯[7]与BSA的缀合物。这个缀合物随后通过透析进行纯化并根据先前所述方法(Wu等人，Bioconj.Chem.，8pp 385-390，1997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1997，Salamone等人，J.ForensicSci.pp 821-826，1998)进行表征。
实施例6具有衍生物11的白消安-BSA缀合物的制备在冰浴中搅拌溶液的同时向溶于磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.5)的20mL BSA溶液(50mg/mL)中逐滴加入0.2mL实施例2中制备的活化的N-羟基琥珀酰亚胺酯白消安衍生物[11](溶于DMSO中，25mg/mL)。允许所得到的混合物在室温下搅拌过夜以产生活化的酯[11]与BSA的缀合物。这个缀合物随后通过透析进行纯化并根据先前所述方法(Wu等人，Bioconj.Chem.，8pp 385-390，1997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1997，Salamone等人，J.ForensicSci.pp 821-826，1998)进行表征。
实施例7白消安抗体的制备用100μg/小鼠的在完全弗氏佐剂中乳化的实施例3中制备的白消安-BTG免疫原或实施例4中制备的白消安-KLH免疫原腹膜内免疫10只雌性BALB/c小鼠。初始注射后4周将小鼠用100μg/小鼠的在不完全弗氏佐剂中乳化的相同免疫原加强一次。加强后10或28天通过眼眶放血从每只小鼠获得测试放血。来自这些测试放血的抗血清包含在实施例9、10a和10b中被评估的白消安抗体。
实施例8a使用白消安衍生物7-BSA缀合物的微量滴定板敏化方法在针对蛋白结合最优化并包含96孔/板的聚苯乙烯微量滴定板(Nunc MaxiSorp C8或F8 Immunomodules)中进行测量白消安浓度的ELISA方法。通过加入300μL溶于pH＝9.6的0.05M碳酸氢钠的10μg/mL白消安-BSA缀合物，并在室温下温育3小时，来用白消安-BSA缀合物(如实施例5中制备的)包被每个孔。将这些孔用pH9.6的0.05M碳酸氢钠洗涤并随后用400μL 5％蔗糖、0.2％酪蛋白酸钠溶液在室温下封闭30分钟。去除包被后的溶液后，将板在37℃干燥过夜。
实施例8b使用白消安衍生物11-BSA缀合物的微量滴定板敏化方法在针对蛋白结合最优化并包含96孔/板的聚苯乙烯微量滴定板(Nunc MaxiSorp C8或F8 Immunomodules)中进行测量白消安浓度的ELISA方法。通过加入300μL溶于7.5g/mL BSA、pH＝9.6的0.05M碳酸氢钠的2.5μg/mL白消安-BSA缀合物，并在室温下温育3小时，来用白消安-BSA缀合物(如实施例6中制备的)包被每个孔。将这些孔用pH9.6的0.05M碳酸氢钠洗涤并随后用400μL 5％蔗糖、0.2％酪蛋白酸钠溶液在室温下封闭30分钟。去除包被后的溶液后，将板在37℃干燥过夜。
实施例9抗体筛选方法-滴定度用如实施例8a和8b中所述的白消安-BSA敏化的微量滴定板进行筛选白消安抗体(实施例7中生产的)的ELISA方法。通过将包含白消安抗体(实施例7)的抗血清在包含0.1％BSA和0.01％硫柳汞的磷酸缓冲盐水中稀释至1∶100、1∶1,000、1∶10,000和1∶100,000来进行抗体筛选测定。向白消安-BSA敏化的孔(实施例8a和8b中制备的)的每个孔中加入100μL稀释抗体并在室温下振荡温育10分钟。在温育过程中，抗体与孔中的白消安-缀合物结合。用pH 7.8的0.02 M TRIS、0.9％NaCl、0.5％Tween-80和0.001％硫柳汞将板孔洗涤三次以去除任何未结合的抗体。为了检测与孔中白消安-BSA缀合物结合的白消安抗体量，向每个孔中加入100μL山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物(Jackson Immunoresearch)，所述缀合物在含0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞的PBS中稀释至预定的化活性(大约1/2000)，当与底物一起温育时它能够特异性结合鼠免疫球蛋白并产生有色产物。在室温下振荡温育10分钟后，其间第二种-HRP缀合物与孔中的白消安抗体结合，再次将板洗涤三次以去除未结合的第二种缀合物。为了在孔中产生可测量的颜色，洗涤后加入100μL的HRP底物TMB(TMB Liquid Substrate，Sigma)，以便在10分钟的室温振荡温育过程中显色。用于显色的温育后，向每个孔中加入50μL终止溶液(溶于diH2O的1.5％氟化钠)以终止显色并在振荡10秒后在650nm处测定吸光度(Molecular Devices Plate Reader)。孔中的抗体量与所测量的吸光度成比例并且表达为导致1.5吸光度的稀度(滴定度)。通过所测量抗体的抗体稀度对数(x轴)对650nm吸光度(y轴)作图并外推1.5吸光度处的滴定度来确定滴定度。滴定度决定在如实施例10a和10b所述的间接竞争性微量滴定板测定中使用的抗体的浓度(稀度)。
实施例10a使用白消安衍生物7-BSA敏化的板的间接竞争性微量滴定板免疫测定方法测定IC50和交叉反应性用实施例8a中所述的白消安衍生物7-BSA敏化的微量滴定板进行测量白消安浓度的ELISA方法。将白消安、四氢噻吩砜、四氢噻吩和四氢噻吩-3-醇-1，1-二氧化物在PBS或含0.1％BSA和0.01％硫柳汞的PBS中10倍稀释至0.01-100,000ng/mL的浓度范围。通过将50μL待测分析物与稀释至实施例9中测定的滴定度的50μL抗体(实施例7中制备的)一起温育来进行测定。在10分钟温育过程(室温，振荡)中，存在着对孔中的白消安缀合物与溶液中的分析物的抗体结合的竞争。温育后，用pH 7.8的0.02 M TRIS、0.9％NaCl、0.5％Tween-80和0.001％硫柳汞将板的孔洗涤三次以去除任何未结合的材料。为了检测与孔中白消安-BSA缀合物结合的白消安抗体量，向每个孔中加入100μL第二抗体即山羊抗小鼠抗球蛋白抗体-HRP酶缀合物(Jackson Immunoresearch)，所述缀合物在含0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞的PBS中稀释至预定的比活性(大约1/2000)，当与底物一起温育时它能够特异性结合鼠免疫球蛋白并产生有色产物。在室温下振荡温育10分钟后，其间第二种-HRP缀合物与孔中的白消安抗体结合，再次将板洗涤三次以去除未结合的第二缀合物。为了在孔中发展可测量的颜色，洗涤后加入100μL的HRP底物TMB(TMB Liquid Substrate，Sigma)，以便在10分钟的室温振荡温育过程中显色。用于显色的温育后，向每个孔中加入50μL终止溶液(溶于diH2O的1.5％氟化钠)以终止显色并在振荡10秒后在650nm处测定吸光度(Molecular Devices Plate Reader)。孔中的抗体量与所测量的吸光度成比例并且与样品中的白消安量成反比。将包含分析物的孔中的颜色的吸光度与不含分析物的进行比较并产生了标准曲线。关于给定分析物的IC50值被定义为对于不包含分析物的孔而言，抑制50％吸光度所需的分析物浓度。根据白消安IC50与四氢噻吩砜、四氢噻吩和四氢噻吩-3-醇-1，1-二氧化物IC50的比率作为百分比计算给定分析物的交叉反应性。当用如实施例7中所生产的抗体与实施例3和4的免疫原进行测量时，相对白消安的四氢噻吩砜、四氢噻吩和四氢噻吩-3-醇-1，1-二氧化物的百分比交叉再活化少于5％。结果见下表1。
实施例10b使用白消安衍生物11-BSA敏化的板的间接竞争性微量滴定板免疫测定方法测定IC50和交叉反应性用实施例8b中所述白消安衍生物11-BSA敏化的微量滴定板进行测量白消安浓度的ELISA方法。将白消安、四氢噻吩砜、四氢噻吩和四氢噻吩-3-醇-1，1-二氧化物在PBS或含0.1％BSA和0.01％硫柳汞的PBS中10倍稀释至0.01-100,000ng/mL的浓度范围。通过将50μL待测分析物与稀释至实施例9中测定的滴定度的50μL抗体(实施例7中制备的)一起温育来进行测定。在10分钟温育过程(室温，振荡)中，存在着对孔中的白消安缀合物与溶液中的分析物的抗体结合的竞争。温育后，用pH 7.8的0.02 M TRIS、0.9％NaCl、0.5％Tween-80和0.001％硫柳汞将板的孔洗涤三次以去除任何未结合的材料。为了检测与孔中白消安-BSA缀合物结合的白消安抗体量，向每个孔中加入100μL第二抗体即山羊抗小鼠抗球蛋白抗体-HRP酶缀合物(Jackson Immunoresearch)，所述缀合物在含0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞的PBS中稀释至预定的比活性(大约1/2000)，当与底物一起温育时它能够特异性结合鼠免疫球蛋白并产生有色产物。在室温下振荡温育10分钟后，其间第二种-HRP缀合物与孔中的白消安抗体结合，再次将板洗涤三次以去除未结合的第二缀合物。为了在孔中发展可测量的颜色，洗涤后加入100μL的HRP底物TMB(TMB Liquid Substrate，Sigma)，以便在10分钟的室温振荡温育过程中显色。用于显色的温育后，向每个孔中加入50μL终止溶液(溶于diH2O的1.5％氟化钠)以终止显色并在振荡10秒后在650nm处测定吸光度(Molecular Devices Plate Reader)。孔中的抗体量与所测量的吸光度成比例并且与样品中的白消安量成反比。将包含分析物的孔中的颜色的吸光度与不含分析物的进行比较并产生了标准曲线。关于给定分析物的IC50值被定义为对于不包含分析物的孔而言抑制50％吸光度所需的分析物浓度。根据白消安IC50与四氢噻吩砜、四氢噻吩和四氢噻吩-3-醇-1，1-二氧化物IC50的比率作为百分比计算给定分析物的交叉反应性。当用如实施例7中所生产的抗体与实施例3和4的免疫原进行测量时，相对白消安的四氢噻吩砜、四氢噻吩和四氢噻吩-3-醇-1，1-二氧化物的百分比交叉再活化少于5％。结果见下表1。
表1利用针对白消安-KLH(实施例7)的抗体与板涂层白消安-BSA缀合物(实施例5、衍生物7以及实施例6、衍生物11)的竞争性免疫测定的交叉反应性。
如从上表所看出的，本发明的抗体不与白消安阻断性代谢物反应。
权利要求
1.一种检测样品中白消安的免疫测定，其包括提供样品混合物，所述样品混合物包含与白消安选择性反应并且基本上不与四氢噻吩砜、四氢噻吩和四氢噻吩-3-醇-1，1-二氧化物交叉反应的抗体，以及载体与化合物的缀合物，所述化合物为下式的化合物 其中A为较低级的亚烷基；X′为功能性连接基团；Y为有机间隔基团；X为能够与多胺聚合物结合的末端官能团；p和z为0-1的独立整数；或下式的化合物 其中A′为较低级的亚烷基或较低级的亚链烯基；X′、Y、X和z如上所述或其混合物，促使样品中的白消安及所述缀合物与所述抗体结合并从而测量所述混合物中与所述抗体结合或未结合的所述缀合物量，借此可以确定样品中白消安的存在。
2.权利要求1的方法，其中所述样品是人的样品。
3.权利要求2的免疫测定，其中所述抗体由包括与化合物连接的免疫原性聚合物的免疫原产生，所述化合物为下式的化合物 其中A为较低级的亚烷基；X′为功能性连接基团；Y为有机间隔基团；X为能够与多胺聚合物结合的末端官能团；p和z为0-1的独立整数；或下式的化合物 其中A′为较低级的亚烷基或较低级的亚链烯基；X′、Y、X、p和z如上所述及其混合物。
4.权利要求2的免疫测定，其中所述抗体或所述缀合物与固体支持物附着。
5.权利要求4的免疫测定，其中所述固体支持物为微量滴定板。
6.权利要求4的免疫测定，其中所述固体支持物为纳米微粒。
7.权利要求1的免疫测定，其中所述化合物为 其中A、X′、Y、X、p和z如上所述。
8.权利要求7的免疫测定，其中所述X为 并且R3为氢或与其附着的氧链一起形成活性酯。
9.权利要求8的免疫测定，其中z为0而且p为1。
10.权利要求9的免疫测定，其中A为-(CH2)v-并且v为1或2。
11.权利要求10的免疫原，其中v为2。
12.权利要求1的免疫测定，其中所述化合物为 其中A′、X′、Y、X和z如上所述。
13.权利要求12的免疫测定，其中X为 并且R3为氢或与其附着的氧链一起形成活性酯。
14.权利要求13的免疫测定，其中z为0并且p为1。
15.权利要求14的免疫测定，其中A′为-CH＝CH-。
16.一种抗体，其与白消安选择性结合并且基本上不与四氢噻吩砜、四氢噻吩和四氢噻吩-3-醇-1，1-二氧化物结合。
17.权利要求16的抗体，其中所述抗体来源于小鼠、兔或大鼠。
18.权利要求16的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
19.权利要求17的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
20.权利要求16的抗体，其中所述抗体来源于多胺聚合物与化合物的免疫原，所述化合物选自下式的化合物 其中A为较低级的亚烷基；X′为功能性连接基团；Y为有机间隔基团；X为能够与多胺聚合物结合的末端官能团；p和z为0-1的独立整数；或下式的化合物 其中A′为较低级的亚烷基或较低级的亚链烯基；X′、Y、X、p和z如上所述或其混合物。
21.权利要求20的抗体，其中所述抗体来源于小鼠、兔或大鼠。
22.权利要求20的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
23.权利要求21的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
24.权利要求20的抗体，其中所述化合物为 其中A、X′、Y、X、p和z如上所述。
25.权利要求24的抗体，其中所述X为 并且R3为氢或与其附着的氧链一起形成活性酯。
26.权利要求25的抗体，其中z为0并且p为1。
27.权利要求26的抗体，其中A为-(CH2)v-并且v为1或2。
28.权利要求27的抗体，其中v为2。
29.权利要求20的抗体，其中所述化合物为 其中A′、X′、Y、X和z如上所述。
30.权利要求29的抗体，其中X为 并且R3为氢或与其附着的氧链一起形成活性酯。
31.一种化合物，其具有下式 其中A为较低级的亚烷基；X′为功能性连接基团；Y为有机间隔基团；X为能够与多胺聚合物结合的末端官能团；p和z为0-1的独立整数。
32.权利要求31的化合物，其中X为 -N＝C＝R4，或 其中R3为氢或与其附着的氧原子一起形成活性酯，并且R4为氧或硫。
33.权利要求32的化合物，其中X为 并且R3为氢。
34.权利要求33的化合物，其中X为 并且R3形成活性酯。
35.权利要求34的化合物，其中所形成的酯为较低级的烷基酯、亚氨酸酯或酰胺酯(amidoester)。
36.权利要求35的化合物，其中z为0并且p为1。
37.权利要求36的化合物，其中A为-(CH2)v-并且v为1或2。
38.权利要求37的化合物，其中v为2。
39.一种化合物，其具有下式 其中A为较低级的亚烷基或较低级的亚链烯基；X′为功能性连接基团；Y为有机间隔基团；X为能够与多胺聚合物结合的末端官能团；p和z为0-1的独立整数；
40.权利要求39的化合物，其中X为 -N＝C＝R4，或 其中R3为氢或与其附着的氧原子一起形成活性酯，并且R4为氧或硫。
41.权利要求40的化合物，其中X为 并且R3为氢。
42.权利要求40的化合物，其中X为 并且R3形成活性酯。
43.权利要求42的化合物，其中所形成的酯为较低级的烷基酯、亚氨酸酯或酰胺酯。
44.权利要求43的化合物，其中z为0并且p为1。
45.权利要求44的化合物，其中A′为-CH＝CH-。
46.一种载体与化合物的缀合物，其中所述化合物为下式的化合物 其中A为较低级的亚烷基；X′为功能性连接基团；Y为有机间隔基团；X为能够与多胺聚合物结合的末端官能团；p和z为0-1的独立整数；或下式的化合物 其中A′为较低级的亚烷基或较低级的亚链烯基；X′、Y、X和z如上所述。
47.权利要求46的缀合物，其中所述化合物为 其中A、X′、Y、X、p和z如上所述。
48.权利要求47的缀合物，其中z为0。
49.权利要求48的缀合物，其中X为 -N＝C＝R4， 或 其中R3为氢或与其附着的氧原子一起形成活性酯，并且R4为氧或硫。
50.权利要求49的缀合物，其中所述载体包含由 或 连接的一个或多个氨基基团，其中R4为氧或硫。
51.权利要求50的缀合物，其中A为-(CH2)v-并且v为1-3的整数。
52.权利要求51的缀合物，其中v为2。
53.权利要求46的缀合物，其中所述化合物为下式的化合物 其中A′、X′、Y、X和z如上所述。
54.权利要求53的缀合物，其中p为0。
55.权利要求54的缀合物，其中X为 -N＝C＝R4，或 其中R3为氢或与其附着的氧原子一起形成活性酯，并且R4为氧或硫。
56.权利要求55的缀合物，其中X为 并且R3如上所述。
57.权利要求56的缀合物，其中A′为-CH＝CH-。
58.一种包含与化合物连接的免疫原性多胺聚合物的免疫原，其中所述化合物为下式的化合物 其中A为较低级的亚烷基；X′为功能性连接基团；Y为有机间隔基团；X为能够与多胺聚合物结合的末端官能团；p和z为0-1的独立整数；或下式的化合物 其中A′为较低级的亚烷基或较低级的亚链烯基；X′、Y、X和z如上所述。
59.权利要求58的免疫原，其中所述免疫原性聚合物包含由 或 连接的一个或多个氨基基团，其中R4为氧或硫。
60.权利要求59的免疫原，其中所述化合物为下式的化合物 其中A′、X′、Y、X和z如上所述。
61.权利要求60的免疫原，其中p为0。
62.权利要求61的免疫原，其中所述免疫原性聚合物包含由 或 连接的一个或多个氨基基团，其中R4为氧或硫。
63.权利要求62的免疫原，其中A为-CH＝CH-。
64.一种测定患者样品中白消安存在的试剂盒，其包括在分开容器内的试剂，所述试剂之一为载体与化合物的缀合物，所述化合物选自下式的化合物 其中A为较低级的亚烷基；X′为功能性连接基团；Y为有机间隔基团；X为能够与多胺聚合物结合的末端官能团；p和z为0-1的独立整数；或下式的化合物 其中A′为较低级的烷基或较低级的亚链烯基；X′、Y、X和z如上所述或其混合物；以及包含基本上与白消安选择性反应并且基本上不与四氢噻吩砜、四氢噻吩和四氢噻吩-3-醇-1，1-二氧化物交叉反应的抗体的第二种容器。
65.权利要求64的试剂盒，其中所述缀合物以预定量存在于所述第一种容器中。
66.权利要求65的试剂盒，其中所述试剂盒用于确定所述样品中的白消安量。
全文摘要
来源于白消安的取代的衍生物的新型白消安缀合物以及新型白消安免疫原以及由这些白消安连接的免疫原产生的抗体在定量和监控生物学流体中白消安的免疫测定中有用。
文档编号G01N33/547GK101019025SQ200580030938
公开日2007年8月15日 申请日期2005年9月13日 优先权日2004年9月15日
发明者S·萨拉蒙, J·B·库尔特尼, 何蜀 申请人:萨拉达克斯生物医疗公司