专利名称：一种检测食物过敏原的仪器的制作方法
技术领域：
本发明涉及食物过敏原检测的方法和仪器，具体地说是一种采用亲合芯片毛细管电泳和区带毛细管电泳进行分离纯化，采用旋转扫描激光诱导荧光技术来定性和定量检测食品中常见的食物过敏原的方法和仪器。
背景技术：
在过敏性疾病中，食物过敏是其中一个重要部分。食物过敏是人们对食物产生的一种不良反应，属抗体对外源物质产生的一种变态反应。食物过敏的症状包括皮肤(荨麻疹，血管性水肿，湿疹)，呼吸系统(支气管哮喘，鼻炎)，肠胃系统(腹痛，腹泻)，严重的导致过敏性休克和死亡。国外的一些流行病学调查表明，有2.5％的成年人和6％-8％的儿童对某些食物产生过敏。欧洲ECRHS调查了15个国家的情况，食物过敏发生的概率为12％。我国北京、广州及胜利油田小范围调查表明居民食物过敏的发生率为3.4％-5％。故食物过敏在临床上是一种常见病和多发病，食物过敏严重影响患者及其家庭的生活质量。近20年来，食物过敏被WHO视为一种严重的公共卫生问题。
世界粮农组织(FAO)1995年报告，90％以上的食物过敏是由牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳水产品、花生、大豆、坚果类和小麦引起。其中牛奶和鸡蛋是婴幼儿最主要食物过敏原，鱼和甲壳类水产动物是成人最主要的食物过敏原之一。食物过敏原通常是蛋白或糖蛋白，分子范围为10～70kDa。尽管已有一些对症治疗方法，但对食物过敏唯一有效的方法仍然是严格避免接触(食入)过敏原。因此，食品中过敏原的检测将是最优先考虑的问题。
目前，对食品中过敏原的检测仅限于试剂盒，还未见专业化分析仪器。目前国际上承认的过敏原检测试剂盒主要是美国的Neogen公司和德国的r-Biopharm公司产品，单个试剂盒在国内的售价则高达3000～5000元。常见的过敏原分离检测方法有IEF、二维电泳、免疫测定(包括SDS-PAGE免疫印迹、火箭免疫电泳、ELISA、放射免疫测定)、PCR、SPR、凝胶过滤色谱、反相色谱、离子交换色谱、质谱等，但均未能集成化。
鉴于食物过敏原治疗尚无特效方法，严格避免食用含有过敏成分的食品是最有效的疗法，故在客观上要求食品加工业生产出不含过敏原的食物或标示出食物过敏原种类、成分及含量。预防食物过敏发生的安全保障体系应包括食品加工、检测、产品标示等过程。美国和欧洲一些发达国家规定食品中所有成分(尤其是过敏原成分)均需标示，并启动了食物过敏的专项研究，但目前仍未见集成化的食物过敏原快速检测仪的报道。
我国随着国民经济的迅速发展，人们生活水平不断提高，对食物安全也提出了更高的要求。尤其是近些年来因食物过敏道不断增多，引起了社会对食品安全的高度重视。但是我国目前食物安全检测仅重视食品中天然毒素、病原生物细菌(病毒和寄生虫)、农药残留、重金属及化学添加剂等的检测，而对食品安全中过敏问题的危害性未能引起高度重视，也谈不上建立食物过敏原的检测方法和建立食物过敏的安全保障体系。
食物过敏原的检测与食物过敏性风险评估、生产、管理以及产品的标示息息相关，是建立食品安全保障体系中的技术难点。食物过敏原的检测涉及定性和定量检测，其中定量检测更具有实际意义。由于食物成分的复杂性、传统的化学分析不能检测出食物过敏原，而现代生化和免疫学检测的技术(如ELISA、PCR、生物传感器、HPLC等)可用于食品过敏原的检测，但集成度不高，仪器体积较大，检测周期较长，对样品的需求也较高，方便性和可操作性也仍需解决，并且并行性较差，不能同时测定多种食物过敏原，仍存在许多不足之处。
本发明通过缓冲溶液提取分离出多种食物过敏原，并构建了相应的单克隆抗体。采用多通道并行芯片毛细管电泳为分离纯化手段，以旋转扫描激光诱导荧光为检测技术，建立起高效、特异、定量并能快速检测食品过敏原的方法，研制一套完整的食品过敏原的快速检测仪器。为进一步建立健全和完善我国食品安全中预防食物过敏发生的安全保障体系奠定理论基础。
本发明建立起高效、特异、定量并能快速检测食品过敏原的方法，以及通过该仪器的研制，不仅为食品安全中过敏原的快速检测，而且也为食品安全中毒素、农残及转基因食品安全性的检测开拓一条新思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种食物过敏原的快速检测仪器，这种检测仪具有灵敏度高，集成度高，快速，成本低，易于操作，能对食物过敏原进行定性和定量分析，为建立食物安全保障体系提供一种准确、快速的检测方法。
本发明提供的技术方案是通过缓冲液提取食物中的过敏原成分，通过芯片亲合毛细管电泳和毛细管区带电泳对食物过敏原进行分离、纯化，以旋转扫描激光诱导荧光技术进行检测，对常见食物中过敏原成份进行定性和定量检测。
上述食物过敏原检测仪主要包括毛细管电泳芯片，毛细管电泳系统，旋转扫描激光诱导荧光检测系统，检测和控制系统，以及相应的软件工作站。
上述毛细管电泳芯片为玻璃基质，分为上下两块，见附图2和附图3，下面一块为底片，其上刻蚀了多条并行毛细管电泳通道，上面一块为盖片，对应底片的位置钻有数个贯通孔，以高温方法将底片和盖片紧密结合在一起；底片上的毛细管电泳通道均用聚丙烯酰胺作涂层，并分为两段，其一键合食物过敏原的单克隆抗体，用作亲合毛细管电泳，其二用作毛细管区带电泳。
上述毛细管电泳系统包括四个压控高压电源，四个电极，半导体制冷片以及温度传感器等部分。
上述旋转扫描激光诱导荧光检测系统包括固体激光器，分光镜，光阑，光电倍增管(PMT)，2个高反射镜，2个带通滤光片，2个透镜，高速步进电机，步进电机的驱动器和控制器。两个高反射镜背对背粘贴到一起，并固定到步进电机的轴上。激光器发出的激光经过滤光片，透镜，分光镜，高反射镜，会聚到毛细管电泳芯片上的检测窗口，样品发射的荧光则原路经过高反射镜，分光镜，取其反射部分，经过透镜，光阑，滤光片，到达光电倍增管。分光镜起到了分离激发光和发射光的作用。高反射镜随着步进电机的旋转，可以在旋转一圈之内对检测窗口的所有通道扫描两次，起到了并行检测的作用。
上述检测和控制系统由模拟输入卡，模拟输出卡以及信号转换部件构成。模拟输入卡具有高速高分辨率的模数转换功能，并且带有多通道的数字输入输出口，可以对光电倍增管输出信号，高压输出检测，步进电机转速，以及毛细管电泳温度监控起到采集或监测作用；模拟输出卡具有高精度模拟输出，可以控制高压电源输出，步进电机转速，以及毛细管电泳芯片的温度。
上述软件工作站是与过敏原检测仪配套的工作站，采用Visual C++编写，充分利用了Windows平台的多任务操作特性。工作站分为5大部分仪器控制模块，数据采集模块，数据处理模块，谱图绘制模块和其它模块。
上述仪器控制模块包括对高压电源，步进电机，以及毛细管电泳芯片的温度等部件进行的自动化控制，提高了仪器的可操作性。
上述数据采集模块包括对光电倍增管输出，高压输出，电极转速，毛细管电泳芯片的温度进行实时性的监测，以及对海量数据的实时性保存。
上述数据处理模块是对将采集的数据进行的实时性的或非实时性的处理与分析，主要包括海量数据的实时转换，多通道数据实时分离，信号滤波，电泳峰的识别和积分处理，以及数据回归等统计学分析。
上述谱图绘制模块包括实时性的谱图绘制，静态谱图绘制，多谱图叠加和线性处理等部分。
上述其它模块主要包括软件界面，数据保存及读取，分析报告和打印模块，以及帮助模块等。
具体来说，以缓冲液提取食物样品，以FITC进行荧光标记后，加样于毛细管分离检测芯片道上样孔。此毛细管电泳芯片具有多通道并行的优势，通道数目可以到几十或更多。其分离通道又分为两段，其一为亲和毛细管电泳分离机制，其二为毛细管区带电泳分离机制。亲和毛细管电泳部分在不同通道上键合了不同的过敏原单抗或多抗，用以高效地结合所需检测的过敏原。毛细管区带电泳部分采用涂层空管，可以大大降低管壁对蛋白的吸收。样品经亲和毛细管电泳有效结合了不同的过敏原，再用毛细管区带电泳作进一步的分离。最后采用旋转扫描激光诱导荧光进行多通道快速并行检测，以光电倍增管(PMT)接收样品发射的荧光信号。光电倍增管所得数据通过模数转换卡保存于控制计算机内，通过其相应的软件工作站，将各通道数据分离并分别进行峰识别和积分处理，比较标准品的峰参数，得到各过敏原组份的定性定量信息。
本发明不仅食品安全中过敏原的快速检测，而且也为食品安全中毒素、农残及转基因食品安全性的检测开拓一条新思路。
附图1过敏原检测仪的原理图1芯片；2检测窗口；3程控高压电源；4激光器；5光电倍增管(PMT)；6步进电机；7步进电机驱动器；8步进电机控制器；9高反射镜；10分光镜；11透镜；12滤光片；13透镜；14光阑；15滤光片；16温度控制元件；17温度检测元件；18模拟输出卡；19模拟输入卡；20控制计算机和电泳工作站；21激光；22激发的荧光；23信号初级放大器；24分压器附图2毛细管电泳芯片(底片)设计图1亲合毛细管电泳通道区域；2毛细管区带电泳通道区域；3电泳缓冲液池；4样品池；5进样废液池；6电泳废液池；7芯片盖板的孔；8并行通道同步进样通道区域；9电泳检测窗口；(附红色标记表明盖片对应位置的孔)附图3毛细管电泳芯片(盖片)设计图3电泳缓冲液池；4样品池；5进样废液池；6电泳废液池；7芯片盖板的孔本发明可以通过以下方式实施具体实施方式
本发明的内容，通过以下的实施例作具体说明实施例1用生化方法对食物变应原的提取以花生为例进行说明取1克花生样品，放于-70℃冰箱冷冻10分钟，取出后用剪刀充分剪碎，并加入适量预冷乙醚-丙酮(1∶2)去脂。丙酮连续去脂48小时，期间换液5次(每8～10小时换液一次)，并放于通风厨下让其自然干燥。以上操作均在冰浴上进行。
脱脂后，对样品进行称重，并以一定的比例用碳酸氢盐-盐水提取液(Coca’s)浸泡样品。按1g样品20ml Coca’s液(w/v)的比例加入提取液。同时用柱塞式匀浆机对样品进行充分研磨破碎。将破碎好的样品用Coca’s液提取48hr。期间将样品充分搅拌，并放于4℃冰箱。
离心样品在4℃，15000转离心20分钟。离心后，吸取上清液，去沉淀。
实施例2毛细管电泳芯片的制备按照附图2和附图3的毛细管电泳芯片设计方案，以玻璃为芯片基质，分为两片大小相同的玻璃片底片(附图2)和盖片(附图3)，尺寸为60毫米×60毫米；底片按照附图2通过激光或化学方法刻蚀各通道，各通道宽度为20微米，深60微米总通道数目为8；盖片按照附图3，在标记3，4，5，6，7的位置开贯通孔；底片和盖片分别加工完成后，以高温方法使两者紧密结合在一起，制成毛细管电泳芯片；然后在电泳分离通道(附图1中的1和2)管壁上制造一层聚丙烯酰胺涂层，将不同食物过敏原的单克隆抗体键合到芯片中亲合毛细管电泳通道区域(如附图1的1)，以上样缓冲液冲洗多次，保存-20℃。
实施例3毛细管电泳系统按照附图1中所述搭建芯片毛细管电泳系统。如实施例1所述，制备用于食物过敏原检测的毛细管电泳芯片，用4根铂丝为电极，以4个电压线性可控的负高压电源为电泳的电压驱动，其电压电压可控范围为0至-10kV，输出功率为10kV/5mA；4个高压电源的地端连接在一起，其中两个高压端用于分离通道的电压驱动，分别通过电极接到电泳缓冲液池(附图2，3的标记3)和电泳废液池(附图2，3的标记6)，另外两个高压端通过电极接到样品池(附图2，3的标记4)和进样废液池(附图2，3的标记5)；4个高压电源的控制端由模拟输出卡(附图1的15)统一控制。
除此之外，温控部分也是毛细管电泳稳定运行的必要条件。温控部分除整机的温控外，主要集中在毛细管电泳芯片下面，为电泳通道提供稳定的运行温度。其升温降温均有一片或多片半导体制冷片来完成，半导体制冷片加上直流电压后，其两面可产生数十度的温差，固定一面为输出端，通过交换输入端的正负极，制冷和制热可以互换，并且具有相应速度快的特点。其电源端由模拟输出卡17并借助继电器来加以控制。温度检测则采用常用的温度传感器，如热电偶或热电阻，它具有温度相应范围宽，灵敏度较好，价格便宜等优点，其采集的信号经过模拟输入卡18转换为数字信号输入软件工作站，用以调节温度。
实施例4旋转扫描激光诱导荧光检测系统按照附图1所述搭建旋转扫描激光诱导荧光检测系统，采用473nm的固体激光器为激发源，产生的激发光18通过带通滤光片(470nm±20nm)11过滤其它的杂散光，再通过会聚透镜10，经过分光镜9(透反比为50∶50)，其透过部分到达双面高反射镜8(此反射镜由两块相同大小的高反射镜背面对这背面粘贴在一起，高反射波段为470～530nm)，反射镜8经由高速步进电机5(最高速率为3000rpm，步进电机由步进电机驱动器6提供驱动电流，而步进电机驱动器又由步进电机控制器7提供脉冲信号来驱使电极旋转，控制器7由模拟输出卡17通过一个电压控制脉冲发生器来控制；反射镜8的镜面平行于电机轴，电机轴则平行于芯片，且正位于芯片的检测窗口2上方)带动作高速旋转，以扫描方式将激发光会聚到芯片的检测窗口2上；待检测的样品已经用荧光素异硫腈酸脂(FITC)进行衍生，当会聚的激发光照射到样品，其衍生基团FITC受到激发而发射荧光21，其中一部分发射的荧光被高反射镜8按原路返回到分光镜9，此时我们取被反射的一半荧光，经由透镜10，光阑12和带通滤色片11(532nm±10nm)会聚到高灵敏度的光电倍增管(采用北京滨松光子技术股份有限公司产生的CR131型)4上。
具体光路再整体阐述如下从附图1中，可以看出，从激光器3发出的激发光18为蓝色，通过滤光片11，透镜10，分光镜9，取透过光，至高反射镜8，反射到芯片上，激发的荧光为红色，按照原路到高反射镜，反射到分光镜，取反射光，通过透镜12，光阑13，滤光片14，到达光电倍增管4。由此经由步进电机5带动双面高反射镜8(使步进电机5每旋转一圈可产生2次信号)，高速扫描(检测频率为100Hz)所有电泳通道，起到了快速并行分析的作用。
实施例5检测和控制系统如附图1，控制检测系统是过敏原检测仪硬件部分与软件工作站相联系的接口。检测系统包括模拟输入卡，模拟输出卡以及信号转换部件，模拟输入卡采用18位A/D，多通道并行采集速率为500kS/s，附有多路数字IO口，模拟输出卡采用16位高精度D/A。
检测系统负责光电倍增管，高压输出，步进电机转速以及温度传感器的信号输入，光电倍增管产生的模拟电流信号经信号初级放大器23放大并将电流信号转换为模拟电压信号再检测，高压输出检测则是经分压器24降低电压后再检测，温度检测是直接检测温度传感器的信号，电极转速检测是通过光电开关检测电极轴上的高反射镜9的突出标记，得到相应的数字信号，再通过模拟输入卡附带的数字输入口进行读取。
控制系统负责高压电源的输出控制，步进电机的转速控制，以及电泳芯片的温度控制。高压电源具有电压可控性能，可以直接用模拟输出卡的直流输出来控制；步进电机的转速依靠其控制器中的压控脉冲发生器来调节脉冲的频率，从而控制电极的转速；温度控制则借助继电器选择制冷或加热。
模拟输入卡和模拟输出卡经过控制计算机和过敏原检测仪配套的软件工作站17对仪器硬件进行检测和控制。
实施例6食物过敏原检测仪软件工作站与过敏原检测仪配套的软件工作站负责仪器控制，数据采集与分析等，采用Visual C++编写，充分利用了Windows平台的多任务操作特性。工作站分为5大部分仪器控制模块，数据采集模块，数据处理模块，谱图绘制模块和其它模块。
仪器控制模块包括对过敏原检测仪硬件中如高压电源，步进电机，以及温度控制部件进行自动化控制，提高了仪器的可操作性。
数据采集模块是获得信息的第一步，它对光电倍增管输出，高压输出，电极转速，以及电泳芯片的温度进行实时性的监测。由于采集的速率高，采集的信号也有多种，因此数据的及时保存与处理更显得重要。本模块含有自行开发的动态数据保存的模块，可以提高存取效率，有效降低了内存碎片，对于海量数据的存取均有实用性。
数据处理模块是对上一模块采集的数据进行的实时性的或非实时性的处理与分析。它主要包括海量数据的实时转换，多通道数据实时分离，信号滤波，电泳峰的识别和积分处理，以及数据回归等统计学分析。此模块设计考虑了海量数据的实时性处理问题，有效地提高了数据处理的效率，既保证能数据实时采集与初步处理，又保证了处理结果的精度。
谱图绘制模块是对数据的一个形象化的处理，使用户能更好地观察和连接所得的数据和结果。本模块包括实时性的谱图绘制，静态谱图绘制，多谱图叠加和线性处理等部分，为了使用户更分别地观察谱图，谱图绘制采用了一些灵活的方式，如可以调整坐标范围，背景、坐标轴、曲线、数据点的颜色、粗细和形状等，曲线的平移，多各谱图可以叠加和线性处理，极大地丰富了用户以不同条件下观察数据的可能。
其它模块主要包括软件界面，数据保存及读取，分析报告和打印模块，以及帮助模块。
权利要求
1.本发明涉及一种检测食物中过敏原的检测仪器。具体来说，用缓冲液提取食物样品，FITC进行荧光标记后，加样于毛细管分离检测芯片道上样孔。通过结合了不同食物的过敏原单抗或多抗的亲和毛细管电泳，分离需检测的过敏原。再用毛细管区带电泳作进一步的纯化。毛细管区带电泳部分采用涂层空管，可大大降低管壁对蛋白的吸收。最后采用旋转扫描激光诱导荧光进行多通道快速并行检测，以光电倍增管(PMT)接收样品发射的荧光信号。PMT所得数据通过模数转换卡保存于控制计算机内，通过其相应的软件工作站，将各通道数据分离并分别进行峰识别和积分处理，比较标准品的峰参数，得到各过敏原组份的定性定量信息。
2.根据权利要求1所述的检测仪器用于检测8类主要过敏性食物中的过敏原，这些食物包括花生、大豆、小麦、蛋、鱼类、贝壳类、坚果类、水果及蔬菜类。
3.根据权利要求1所述的检测仪器用于检测其他食物中的过敏原，即除了花生、大豆、小麦、蛋、鱼类、贝壳类、坚果类、水果及蔬菜类以外的过敏原。
4.根据权利要求1所述的检测仪器和检测方法用于食物中过敏原的评估。其特征在于用缓冲液提取食物样品后，以FITC进行荧光标记后，以结合了多种过敏原单抗或多抗的亲和毛细管电泳和毛细管区带电泳分离纯化食物过敏原。
5.根据权利要求1所述的检测仪器和检测方法用于食物中过敏原的评估。其特征在于采用旋转扫描激光诱导荧光进行多通道快速并行检测，以光电倍增管(PMT)接收样品发射的荧光信号。
6.根据权利要求1所述的检测仪器和检测方法用于食物中过敏原的评估。其特征在于通过软件工作站，将PMT接收的各通道数据分离，并分别进行峰识别和积分处理，比较标准品的峰参数，得到各过敏原组份的定性定量信息。
全文摘要
本发明涉及一种检测食物中过敏原的检测仪器。用于对常见的食物过敏原进行定性和定量检测。具体来说，用缓冲液提取食物样品，FITC进行荧光标记后，加样于毛细管分离检测芯片道上样孔。通过结合了不同食物过敏原单抗或多抗的亲和毛细管电泳，分离需检测的过敏原。再用毛细管区带电泳作进一步的纯化。毛细管区带电泳部分采用涂层空管，可大大降低管壁对蛋白的吸收。最后采用旋转扫描激光诱导荧光进行多通道快速并行检测，以光电倍增管(PMT)接收样品发射的荧光信号。PMT所得数据通过模数转换卡保存于控制计算机内，通过其相应的软件工作站，将各通道数据分离并分别进行峰识别和积分处理，比较标准品的峰参数，得到各过敏原组份的定性定量信息。
文档编号G01N33/533GK1844928SQ200610034440
公开日2006年10月11日 申请日期2006年3月21日 优先权日2006年3月21日
发明者刘志刚, 余晓, 吴海强 申请人:深圳大学