专利名称：一种分子印迹固相微萃取涂层的制备方法
技术领域：
本发明属于化学分析测试仪器领域，涉及到分子印迹固相微萃取涂层的制备方法。适用于生物、医药、环境样品和食品等复杂基体中印迹分子及与之结构相似的一类化合物的分离与富集。
背景技术：
复杂基体如生物、医药、环境样品和食品中痕量、超痕量物质分析要依赖高效和高选择性的样品前处理技术。色谱分析过程中，样品预处理通常是最耗时和不易自动化的步骤，也是目前公认的最为关键的步骤。但相对于仪器分析技术的发展，样品前处理技术的进展一直较缓慢。
1989年Belardi与Pawliszyn提出了固相微萃取(Solid-Phase Microextraction，SPME)技术，SPME是基于分析物在流动相以及固定在熔融二氧化硅纤维表面的高分子固定相之间两相分配的原理，实现对样品中的有机分子进行萃取和富集。然后可直接在联用仪器中解吸、进样及分析，使样品预处理过程大为简化，提高了分析速度及灵敏度。与传统的样品前处理技术如液液萃取、索氏提取、SPE相比，克服了需使用大量溶剂和样品、处理时间长、操作步骤多、易产生二次污染、不易在线联用等缺点，在包括环境、食品、生物以及药物等样品前处理方面得到了广泛应用。在SPME过程中，除了采样条件及分析物本身的性质之外，纤维涂层的材料是最关键的。但目前商品化的SPME萃取头主要由Suplco公司生产，涂层仅有聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)、聚丙稀酸酯(PA)、聚乙二醇/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)、碳分子筛/二乙烯基苯(CW/DVB)等少数几种。这些涂层的制备都是将高聚物通过高温加热等物理方法固定在石英纤维的表面，机械及热稳定性都比较差，在直接萃取的情况下，涂层极易脱落或断裂。并且涂层以非特异性吸附作用为主，选择性不高，在样品前处理时仍有大量化学、物理性质相近的基体物质同时被富集。近年来不断有文献报道，商品化SPME涂层在处理极性或碱性药物时会遇到较大的困难(Wu，J.and J.Pawliszyn.2001.J.Chromatogr.A 90937-52；Eisert，R.and J.Pawliszyn.1997.Anal.Chem.693140-3147)。虽然一些文献报道了新的SPME涂层的研制工作，如聚硅氧烷-富勒烯(Xiao，C.H.，S.Q.Han，Z.Y.Wang，J.Xing，and C.Y.Wu.2001.J.Chromatogr.A 927121-130)、冠醚(Zeng，Z.R.，W.L.Qiu，and Z.F.Huang.2001.Anal.Chem.732429-2436)、杯芳烃(Li，X.J.，Z.R.Zeng，S.Z.Gao，and H.B.Li.2004.J.Chromatogr.A 102315-25)等，选择性相对于商品化涂层有一定的提高，但主要是用于测定挥发或半挥发性的有机环境污染物，选择性仍不够强。涂渍方法除传统的物理涂敷法外，目前被广泛采用的还有溶胶-凝胶法，该方法制备的涂层具有较好的化学稳定性，但在涂渍过程中存在着重复性较差的问题。开发选择性更高、稳定性更好、用于萃取极性和非挥发性有机化合物的涂层材料将是今后一段时间SPME技术发展的一个重要方向。
分子印迹(Molecular Imprinting，MI)技术是将要分离的目标分子与功能单体通过共价或非共价作用进行预组装，与交联剂共聚制备得到聚合物。除去目标分子后，聚合物中形成与目标分子空间互补并具有预定的多重作用位点的“空穴”，对目标分子的空间结构具有“记忆”效应，能够高选择性识别复杂样品中的印迹分子。分子印迹聚合物(Molecularly ImprintedPolymer，MIP)制备简单，能够反复使用，机械强度较高，稳定性好，在色谱固定相、固相萃取材料、模拟酶催化、化学传感器、膜分离技术等领域均展现出良好的应用前景。MIP选择性高的特点使之非常适合作为SPME的涂层材料，Koster在这一方面做了试探性的研究工作(Koster，E.H.M，C.Crescenzi，W.D.Hoedt，K.Ensing，and G J.de.Jong.2001.Anal.Chem.733140-3145)。所制备的克伦特罗MIP固相微萃取涂层对β2-兴奋剂具有较高的选择性。但涂层厚度无法控制，涂渍方法重复性较差(RSD≈15％)，而且用该方法制备的SPME萃取头无法与液相色谱联用，实用性不强。
发明内容
针对上述SPME涂层材料在选择性、稳定性、重复性等方面的局限性，本发明的目的是通过化学键合作用及自由基共聚反应将目标分子MIP涂渍到石英纤维表面。同时，通过采用多次涂渍方法及优化聚合条件，实现MIP固相微萃取涂层厚度可控性，提高涂渍的重复性及涂层的稳定性。将MIP选择性高、稳定性好与SPME技术操作简便、易自动化的特点结合在一起，使SPME获得更高的选择性，能高效地从复杂样品中分离、富集目标分子及结构相似的一类化合物，清除基体干扰，从而降低检出限，提高分析的精度和准确性。
本发明通过以下技术方案实现(1)对石英纤维进行碱洗、酸洗、活化，然后用具有不饱和双键的硅烷化试剂进行硅烷化处理；(2)将模板分子与功能单体置于聚合溶剂中自组装；(3)在第(2)步的溶液中加入交联剂及引发剂，在无氧气的条件下，插入硅烷化石英纤维，热引发共聚反应；(4)聚合一定时间，在聚合溶液固化之前，取出石英纤维，老化；(5)在同一根石英纤维上重复以上(2)-(4)步至涂层厚度达到要求；(6)洗脱除去分子印迹聚合物涂层中模板分子。
分子印迹聚合物一般为高熔点的固相高分子聚合物，采用物理方法涂渍较难实现，并且同样存在脱落、断裂等问题。本发明采用具有不饱和双键的硅烷化试剂对石英纤维进行处理，石英纤维经过酸洗和碱洗后表面具有较多硅羟基，与硅烷化试剂发生硅烷化反应后将不饱和双键键合到石英纤维表面。将该石英纤维插入制备MIP的聚合溶液中，不饱和双键参与MIP的自由基共聚反应，从而将MIP通过化学键涂渍到石英纤维表面。克服了物理涂渍方法易脱落、断裂和溶胶-凝胶方法重复性差等缺点。
石英纤维的硅烷化处理，易出现由于碱洗、酸洗后石英纤维表面吸水导致硅羟基失活，硅烷化处理不完全，从而使MIP涂层产生均匀性差、覆盖率低、致密性差等问题。本发明采取对酸洗、碱洗后的石英纤维在150℃下进行活化脱水的方法，使涂层均匀性、覆盖率、致密性均得到完全改善。
MIP合成所采用的功能单体、交联剂、聚合溶剂以及各反应物之间的比例直接影响MIP涂层的形态、厚度和涂渍操作的可行性等关键问题。本发明采用甲基丙烯酸、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、甲苯分别为功能单体、交联剂和聚合溶剂；通过优化，选择模板分子、功能单体、交联剂三者的摩尔比为1∶4∶4，功能单体加交联剂的体积与所用聚合溶剂体积的比例为1∶6。制备的MIP涂层均匀、致密，表面为疏松多孔结构。有利于增加涂层比表面积，降低萃取及解吸的扩散阻力，提高涂层稳定性和涂渍操作的重复性。
SPME萃取头一般采用石英纤维制备，当通过共聚反应制备MIP涂层时，聚合后石英纤维与聚合溶液完全固化在一起无法拔出。如果将聚合物敲碎后取出石英纤维，涂层的均匀性和涂渍操作的重复性根本得不到保证，而且石英纤维易碎。本发明采用控制聚合时间的方法，在聚合到一定时间后，聚合溶液固化之前将石英纤维从中取出。即保证纤维不发生断裂，又可以提高涂层的均匀性和涂渍操作的重复性。此时MIP交联度不够高，涂层不牢固，必须将其置于无氧气条件下(例如在氮气保护下)和聚合温度条件下老化一段时间，以提高MIP的交联度。
涂渍MIP涂层时，由于石英纤维必须在聚合溶液固化之前取出，聚合时间受到限制，导致MIP涂层厚度较小。本发明采用多次涂渍的方法实现对厚度的控制，即石英纤维涂完1次后，按相同方法在其表面进行第2、3、……次MIP涂渍，直至厚度达到要求。由于分子印迹聚合物达不到完全交联，所以前次涂渍涂层的表面残留有不饱和双键，可参与下一次涂渍的共聚反应，相邻的涂层之间均以化学键合作用连接在一起，可保证涂层稳定性及涂渍重复性。涂层厚度与涂层次数之间呈良好线性关系，可通过涂层次数控制涂层厚度。
图1.扑草净分子印迹固相微萃取涂层制备过程示意2.扑草净分子印迹固相微萃取涂层的扫描电子显微镜照片(300倍，涂层涂渍次数为10)图3.扑草净分子印迹固相微萃取涂层的扫描电子显微镜照片(5000倍，涂层涂渍次数为10)图4.不同涂层SPME萃取头萃取扑草净液相色谱图(扑草净MIP及空白聚合物(NIP，除在合成过程中不添加模板分子以外，其余步骤和MIP完全相同)涂层萃取头萃取3mL 0.005g/mL扑草净苯标液；PDMS-DVB、PDMS、PA涂层萃取3mL 0.5g/mL扑草净苯标液；峰1为苯，峰2为扑草净。即使浓度增加100倍，三种商业涂层对扑草净的萃取能力仍远低于扑草净MIP涂层)
图5.扑草净MIP、空白聚合物涂层萃取头萃取0.005g/mL扑草净、六种结构类似的三嗪类除草剂及苯性能分析图具体实施方式
本实施例如以扑草净为例，对本发明进行详细地描述，但并不以此限定本发明的保护范围。
如图1所示，扑草净分子印迹固相微萃取涂层的制备方法如下(1)将石英纤维放入1.0mol/L NaOH碱洗液中室温浸泡1小时，取出，用蒸馏水冲洗三次；碱洗后的石英纤维随即放入1.0mol/L HCl酸洗液中浸泡1小时，取出，用蒸馏水冲洗干净，除去表面残留的HCl，放入培养皿中置于烘箱内150℃活化1小时。从烘箱中取出石英纤维，立即放入10％(V/V)3-甲基丙烯酰基-丙基-三甲氧基硅烷硅丙酮溶液中，硅烷化反应1小时后取出，以甲醇冲洗三次，氮气吹干。
(2)在磨口锥形瓶中分别加入19.44mL甲苯、0.4827g扑草净(2mmol)和0.68mL甲基丙烯酸功能单体(8mmol)，充分摇匀，室温放置12小时。
(3)往上述溶液中加入2.56mL三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯交联剂(8mmol)及25.6mg偶氮二异丁腈引发剂，充分摇匀。取试管，加入1.5mL以上聚合溶液，超声脱气。在试管中放入一根经硅烷化处理的石英纤维，通氮气除氧。试管用胶塞封口，置于氮吹仪的固体加热模块中60℃加热聚合。
(4)仔细观察溶液变化，1～3小时后，当聚合溶液接近固化时，打开胶塞，匀速拔出石英纤维，转移入空试管中，通氮除氧，用胶塞封口后继续在60℃下加热3～6小时。
(5)取出石英纤维，按照上述2～4步进行第二次涂渍。依此类推，从而制得反复涂层10次的扑草净MIP涂层石英纤维。
(6)将涂渍10次的扑草净MIP涂层石英纤维在试管中用5mL 10％(V/V)乙酸甲醇溶液反复浸泡，每次浸泡时间为1小时，以洗脱除去扑草净模板分子，直至浸泡液经液相色谱检测无扑草净分子。再次浸泡24小时后，用氮气吹干。
本实施例制备扑草净分子印迹固相微萃取涂层具有以下优点1.由于采用化学键合方法，通过优化条件的自由基共聚反应制备MIP涂层，并且石英纤维的取出通过聚合时间和聚合溶液固化程度进行控制，制备方法(如图1所示)具有较高重复性。同时制备10根扑草净MIP涂层SPME萃取头，每根萃取头重复涂渍10次，平均涂层厚度为25μm，精密度为2.9％。
2.所制备出的涂层均匀、致密，表面呈疏松多孔结构(如图2-3所示)。涂层具有良好的化学和机械稳定性能，以直接萃取方式使用100多次后，涂层没有任何断裂、剥落或腐蚀现象。
3.可通过涂层次数控制涂层的厚度，涂层厚度与涂层次数之间呈良好的线性关系，相关系数R为0.996。
4.利用本发明的方法所制备的扑草净MIP涂层，对除草剂扑草净具有很高的选择性萃取能力，可用于痕量扑草净的分离与富集。与之相比，商品化涂层如PDMS、PDMS-DVB、PA对痕量扑草净的萃取能力非常弱，如图4所示。
5.利用本发明所述方法制备的扑草净MIP涂层对结构与扑草净分子非常相似的其它三嗪类除草剂均具有很好的选择性萃取能力，对非结构相似物如苯等没有选择性萃取能力，如图5所示。可用于复杂样品中痕量三嗪类除草剂的分离与富集。
权利要求
1.一种分子印迹固相微萃取涂层的制备方法，按以下步骤进行(1)对石英纤维进行碱洗、酸洗、活化，然后用具有不饱和双键的硅烷化试剂进行硅烷化处理；(2)将模板分子与功能单体置于聚合溶剂中自组装；(3)在第(2)步的溶液中加入交联剂及引发剂，在无氧气的条件下，插入硅烷化石英纤维，热引发共聚反应；(4)聚合一定时间，在聚合溶液固化之前，取出石英纤维，老化；(5)在同一根石英纤维上重复以上(2)-(4)步至涂层厚度达到要求；(6)洗脱除去分子印迹聚合物涂层中模板分子。
2.如权利要求1所述的分子印迹固相微萃取涂层的制备方法，其特征在于所述的模板分子是扑草净。
3.如权利要求2所述的分子印迹固相微萃取涂层的制备方法，其特征在于功能单体为甲基丙烯酸，交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，聚合溶剂为甲苯。
4.如权利要求1所述的分子印迹固相微萃取涂层的制备方法，其特征在于所述的石英纤维在经过碱洗、酸洗后活化的温度为150℃，活化时间不少于1小时。
5.如权利要求1或2所述的分子印迹固相微萃取涂层的制备方法，其特征在于所述的具有不饱和双键的硅烷化试剂为3-甲基丙烯酰基-丙基-三甲氧基硅烷，硅烷化时间为1小时。
6.如权利要求2或3所述的分子印迹固相微萃取涂层的制备方法，其特征在于所述的模板分子、功能单体、交联剂三者的摩尔比为1∶4∶4。
7.如权利要求2或3所述的分子印迹固相微萃取涂层的制备方法，其特征在于所述的功能单体加交联剂的体积与所用聚合溶剂体积的比例为1∶6。
8.如权利要求1或2所述的分子印迹固相微萃取涂层的制备方法，其特征在于所述的石英纤维在共聚反应1～3小时后，当聚合溶液接近固化时从中取出，取出后置于60℃下老化3-6小时。
全文摘要
本发明公开了一种分子印迹固相微萃取涂层的制备方法。步骤如下石英纤维的碱洗、酸洗、活化、硅烷化处理；模板分子与功能单体置于溶剂中自组装；加入交联剂及引发剂，插入硅烷化石英纤维，热引发聚合；取出纤维，老化；重复以上涂渍步骤至涂层厚度达到要求；洗脱除去模板分子。与商品化涂层相比，用该方法制备的朴草净分子印迹固相微萃取涂层对三嗪类除草剂具有良好的分子识别性能。涂层均匀致密，为疏松多孔结构，长时间使用后无断裂、脱落现象。厚度可通过涂渍次数进行控制，重复性好。萃取头可与液相色谱联用，适用于环境样品、食品等复杂基体中三嗪类除草剂的分离与富集。
文档编号G01N30/00GK1843551SQ200610034220
公开日2006年10月11日 申请日期2006年3月13日 优先权日2006年3月13日
发明者李攻科, 胡小刚, 胡玉玲 申请人:中山大学