专利名称：一种钙质沉积物有机磷的提取及组成分析方法
技术领域：
本发明涉及对湖泊钙质沉积物磷的评价分析，特别是一种钙质沉积物有机磷提取及组 成分析方法，亦适合钙含量高的海洋和河流沉积物。
背景技术：
磷是湖泊发生富营养化的限制性因子。湖泊中的磷绝大部分蓄积于沉积物中。沉积物 磷在适当条件下可向水体大量释放，造成水质恶化和水体富营养化。沉积物磷的释放潜力 主要与磷在沉积物中的赋存形态有关。目前，关于无机态磷在沉积物中的形态及其活性的 分析和评价方法已相对成熟，而对有机磷的研究手段还非常缺乏。依靠传统的光度分析方 法仅能得到有机磷的总量信息。应用新方法定量获取沉积物中有机磷的组成信息，是评价 有机磷活性及其对水体磷贡献大小的关键。
对沉积物有机磷组成信息的获取一般需要两步完成1)将沉积物中的有机磷提取出 来；2)用仪器分析提取液中的有机磷组成。沉积物有机磷总量的提取方法多借鉴于土壤 学科。 一般选择强碱作为提取剂，其原理是在高OH—竞争条件下有机磷和氧化物之间产生
静电斥力，与有机磷结合的高价阳离子桥被低价Na+取代，促使有机磷从氧化物表面释放
出来。为提高沉积物有机磷的提取效率，研究者进一步向强碱溶液加入络合试剂或材料， 如树脂或乙二胺四乙酸，通过络合多价金属离子，促进沉积物有机磷的溶解。目前，广泛
使用NaOH与乙二胺四乙酸的混合溶液(NaOH+EDTA)作为沉积物有机磷的提取剂。 该提取剂在应用于钙含量低的沉积物时，有机磷的提取效果较为理想。然而，在应用于钙 含量高的沉积物时，由于在碱性条件下钙与磷发生沉淀，导致对沉积物有机磷的提取效率 异常偏低。
测定有机磷组成的方法有液相3IP核磁共振(31P-NMR)、软X射线荧光光谱、高效 液相色谱、酶解等技术。其中，31P-NMR技术因样品前处理简单、组分分辨完全等优点 而受到重视。该技术已被较多的应用到土壤领域，并逐渐推广到沉积物的分析。由于 31P-NMR是低敏感性技术，其分析效果依赖于前一步有机磷的提取效果。对于钙质沉积 物，因NaOH+EDTA提取剂对沉积物有机磷的提取效率偏低，"P-NMR分析效果并不理 想。尤其对于含量低的某些类型有机磷，通过"P-NMR技术获取其信息有较大的难度。 此外，提取液中顺磁性金属离子(主要是三价铁和锰)含量过高会使3IP-NMR分析时谱 线加宽，不同组分之间发生重叠，造成组分识别和量化困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种钙质沉积物有机磷提取及组成分析方法，本方法针对钙质沉 积物有机磷提取率低的问题，先使用乙二胺四乙酸溶液(pH=4.5)对沉积物进行冲洗， 再结合传统方法使用NaOH + EDTA将沉积物中的有机磷提取出来，通过"P核磁共振 (3IP-NMR)技术进一步分析提取液中有机磷的组成。该方法适用于金属元素 Ca/(Fe+Al)X).7的钙质沉积物。
本发明的上述目的通过如下技术方案实现 一种钙质沉积物有机磷提取及组成分析方 法，其特征是先采用偏酸性的乙二胺四乙酸溶液对沉积物进行冲洗并离心，再结合传统提
取方法用NaOH与乙二胺四乙酸的混合溶液(NaOH+EDTA)作为提取剂，对沉积物进行 振荡提取并离心，然后取部分NaOH+EDTA提取液，用光谱仪测定总磷，将剩余 NaOH+EDTA提取液进行浓縮，最后用31P核磁共振技术(31P-NMR)分析提取液中各类 型磷化合物的组成比例，通过计算进一步得到沉积物中有机磷的组成含量信息。
所说的钙质沉积物其金属元素钙与铁和铝含量之比大于0.7;所说偏酸性的乙二胺四乙 酸溶液其pH为4.5;所说光谱仪采用电感耦合等离子体发射光谱仪。
具体步骤如下
(1) 沉积物样品准备采集新鲜沉积物，先在超低温冰箱冷冻不少于4h，然后真空 干燥，最后样品经过研磨、过筛，室温密封保存；
(2) 冲洗将沉积物样品与偏酸性的乙二胺四乙酸溶液在离心管中混合振荡，然后离 心倒掉上层清液。
(3) 有机磷提取向离心管继续加入NaOH+EDTA的混合液，振荡、离心后，取一 小部分上层清液用仪器测定总磷；
(4) 浓縮将剩余提取液倒入旋转瓶，真空旋转蒸发浓縮，将浓縮液冷冻保存；
(5) 31P-NMR样品准备取出呈冰冻状态的浓縮样品，在室温下回温至液态，然后 离心去除沉淀，并向溶液中加入重水，进行"P-NMR分析；
(6) "P-NMR分析核磁共振仪为BRUKER AV400, 31P-NMR分析在161.98 MHz 下进行，采用BRUKER标准腔BBO探头，环境温度2(TC左右，单个样品扫描次数在 17000-26000之间，分析时间在12h至18 h之间，31P化学位移以85% H3P04为基准，组 成鉴别参考磷标样的化学位移，分别为膦酸20ppm、芳香族二酯7.4ppm、正磷酸6 7 ppm、 正磷酸单酯4 6ppm、磷脂l 3ppm、 DNA 0 ppm、焦磷酸-3.5 -4.5 ppm、多聚磷末 端磷—3 -4 ppm和多聚磷中间磷-17 -19 ppm;
(7) 计算通过面积积分得到，-NMR波谱中各类型磷化合物的组成比例，根据提 取液总磷计算得到各类型磷化合物的浓度，根据沉积物重量计算得到单位重量沉积物中有 机磷的组成含量。
本发明的优点及有益效果首先，通过偏酸性的乙二胺四乙酸溶液络合去除沉积物中 大部分铁锰等顺磁性金属离子，降低这些离子在NaOH+EDTA提取液中的含量，避免 "P-NMR分析时因上述离子过多而造成的谱线加宽、图谱质量下降的缺陷；其次，通过偏 酸性的乙二胺四乙酸溶液络合去除沉积物中的大部分钙离子，避免下一步NaOH+EDTA提 取时钙与磷产生沉淀，同时促使大量钙结合态有机磷变成弱结合态，并被NaOH+EDTA提 取出来。以上措施可显著增加沉积物有机磷的提取量，并使得"P-NMR的分析效果得到显 著改善。上述钙质沉积物有机磷提取及组成测定方法亦适用于钙含量高的海洋和河流沉积 物。
图1传统方法与本发明方法对沉积物总磷的提取率比较； 图2传统提取与本发明提取方法对沉积物有机磷提取率比较； 图3传统方法与本发明方法对沉积物磷的提取与31P-NMR分析后得到的各类型磷 化合物含量比较；
图4传统方法与本发明方法对沉积物磷的提取与31P-NMR分析后的核磁共振图谱 比较。
具体实施例方式
所需试剂
1. 50mM乙二胺四乙酸(EDTA):称取18.6g EDTA(Na盐)溶解到1.0升去离子水。
2. 0.25M NaOH+50mM EDTA混合液称取10g NaOH和18.6g EDTA(Na盐)溶解 到l.O升去离子水。
3. 重水(H202)
所需设备
1. 往复式振荡机
2. 离心机
3. 旋转蒸发仪
4. 水浴式真空泵
5. 电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES)
6. BrukerAV400核磁共振仪
操作步骤
1、 沉积物样品准备采集新鲜沉积物，在-8(TC超低温冰箱冷冻4h，然后放在冷冻干 燥机上真空干燥。干燥好的沉积物样品经过研磨、过筛(100目)，室温密封保存。
2、 冲洗称2.0g (干重)沉积物到100ml离心管，加入80mlEDTA (50mM)， 25°C 振荡30分钟后，10000 rpm离心20分钟，去除上层清夜。
3、 有机磷提取向离心管继续加入16 ml 0.25M NaOH+50mM EDTA提取剂，25°C 振荡16小时，10000 rpm离心20分钟后，保留溶液。取2ml提取液，采用ICP-AES分析 溶液中的总磷。
4、 浓縮剩余提取液放入100ml旋转瓶，在28'C旋转蒸发浓縮，同时采用水浴式真 空泵抽真空，提取液浓縮至lml，浓縮液放入-15'C冷冻保存。
5、 s'P-NMR样品准备取出呈冰冻状态的浓縮样品，在室温下回温至液态，10000 rpm 离心10分钟后，去除沉淀，向溶液中加入10%的重水，进行"P-NMR分析。
6、 "P-NMR分析核磁共振仪为BRUKER AV400, 31P-NMR分析在161.98 MHz下 进行，采用BRUKER标准腔5mm BBO探头，脉冲90°,延迟时间2秒，获取时间0.5 s， 环境温度20°C 。单个样品扫描次数在17000-26000之间，分析时间在12h至18 h之间。 31P化学位移以85% H3P04为基准，组成鉴别参考磷标样的化学位移，分别为膦酸
(20ppm)、芳香族二酯(7.4ppm)、正磷酸(6-7ppm)、正磷酸单酯(4-6ppm)、磷脂(l-3 ppm)、 DNA(0ppm)、焦磷酸(-3.5—4.5 ppm)、多聚磷末端磷(-3~-4 ppm)和多聚磷中间磷 (-I7 -19ppm)。
7、 计算通过面积积分得到"P-NMR波谱中各类型磷化合物的组成比例，根据提取 液总磷计算得到各类型磷化合物的浓度，根据沉积物重量计算得到单位重量沉积物中有机 磷的组成含量。
实施例选择甘肃沙湖、西大湖、青海省的青海湖、耳海及青藏高原无名湖等中国西
北部分湖泊沉积物，其沉积物性质均是Ca/(Fe+Al)X).7，按照该发明步骤对沉积物有机磷
进行提取，并用"P-NMR分析其有机磷含量和组成。同时按传统方法将每个沉积物样品 称量2g到100ml的离心管中，直接加入16m 0.25M NaOH+50mM EDTA提取剂，其余 按照该发明的步骤3-7对沉积物有机磷进行提取和测定。传统方法与本发明方法分析效果 比较如下
1、 本发明方法对钙质沉积物总磷、有机磷提取率明显高于传统提取。 本发明对沉积物总磷的提取率是传统方法提取率的1.2 2.6倍，沉积物有机磷的提取
率是传统提取的1.6-3.7倍，由此可见，不论针对沉积物总磷还是有机磷，该发明提取均 明显好于传统提取(图1和图2)。
2、 本发明方法使得31P-NMR中有机磷组成种类明显增加，且图谱质量亦高于传统提 取方法(图3和图4)。图4中，A为传统提取方法，B为本发明的提取方法，a，膦酸；
b,芳香族二酯；C,正磷酸；d单酯；e,磷脂；f, DNA; g,多聚磷末端磷；h,焦磷 酸；i,多聚磷中间磷。
采用本方法提取钙质沉积物的有机磷，通过31P-NMR分析可得到单酯、磷酯、芳香 族二酯、DNA、焦磷酸盐和多聚磷等多种类型有机磷化合物的信息。与本发明方法相比 较，采用传统提取方法，磷脂、芳香族二酯、DNA、焦磷酸盐和多聚磷等含量低的有机 磷信息有不同程度的削弱或消失。另外，传统方法中单个类型磷化合物的含量普遍低于本 发明方法，充分体现本发明方法对钙质沉积物有机磷提取和组成分析上的优势。此外，本 方法还可以用于钙含量高的海洋和河流沉积物。
权利要求
1、一种钙质沉积物有机磷提取及组成分析方法，其特征是先采用偏酸性的乙二胺四乙酸溶液对沉积物进行冲洗并离心，然后用NaOH与乙二胺四乙酸的混合溶液NaOH+EDTA作为提取剂提取沉积物有机磷，用光谱仪测定NaOH+EDTA提取液中的总磷；将提取液进行浓缩后，用31P核磁共振技术31P-NMR分析提取液中各类型磷化合物的组成比例，通过计算进一步得到沉积物中有机磷的组成含量信息。
2、 根据权利要求1所述钙质沉积物有机磷提取及组成分析方法，其特征是所说的钙质 沉积物其金属元素钙与铁和铝含量之比大于0.7;所说偏酸性的乙二胺四乙酸溶液其pH 为4.5;所说光谱仪为电感耦合等离子体发射光谱仪。
3、 根据权利要求1或2所述钙质沉积物有机磷提取及组成分析方法，其具体步骤如下(1) 沉积物样品准备采集新鲜沉积物，先在超低温冰箱冷冻不少于4h，然后真空 干燥，最后样品经过研磨、过筛，室温密封保存；(2) 冲洗将沉积物样品与偏酸性的乙二胺四乙酸溶液在离心管中混合振荡，然后离 心去掉上层溶液。(3) 有机磷提取向离心管继续加入NaOH+EDTA提取剂，接着振荡、离心，取一 小部分上层溶液用仪器测定总磷；(4) 浓縮将剩余提取液倒入旋转瓶，经真空旋转蒸发浓縮，最后将浓缩液冷冻保存；(5) 31P-NMR分析样品准备取出呈冰冻状态的浓缩样品，在室温下回温至液态， 离心去除沉淀，向溶液中加入重水后，进行"P-NMR分析；(6) "P-NMR分析核磁共振仪为BRUKER AV400, 31P-NMR分析在161.98 MHz 下进行，采用BRUKER标准腔BBO探头,环境温度2(TC左右，单个样品扫描次数在 17000-26000之间，分析时间在12h至18 h之间，31P化学位移以85% H3P04为基准，组 成鉴别参考磷标样的化学位移，分别为膦酸20ppm、芳香族二酯7.4卯m、正磷酸6 7 ppm、 正磷酸单酯4 6ppm、磷脂l 3ppm、 DNA 0 ppm、焦磷酸-3.5 -4.5 ppm、多聚磷末 端磷-3 -4 111和多聚磷中间磷-17 -19 111;(7) 计算通过面积积分得到"P-NMR波谱中各类型磷化合物的组成比例，根据提 取液的总磷浓度计算得到各类型磷化合物的浓度，根据沉积物重量计算得到单位重量沉积 物中有机磷的组成含量。
全文摘要
一种钙质沉积物有机磷提取及组成分析方法，其特征是先采用偏酸性的乙二胺四乙酸溶液对沉积物进行冲洗并离心，再结合传统提取方法NaOH加乙二胺四乙酸混合溶液(NaOH+EDTA)对沉积物进行振荡提取并离心，然后取部分NaOH+EDTA提取液用光谱仪测定总磷，将剩余提取液进行浓缩，最后用<sup>31</sup>P核磁共振技术(<sup>31</sup>P-NMR)分析提取液中有机磷的组成。
文档编号G01N21/71GK101339133SQ20081002190
公开日2009年1月7日 申请日期2008年8月18日 优先权日2008年8月18日
发明者丁士明, 韬 刘, 白秀玲, 范成新 申请人:中国科学院南京地理与湖泊研究所