专利名称：一种环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶联免疫检测试剂盒，尤其涉及一种环丙沙星的化学发光酶联免疫 检测试剂盒。
背景技术：
环丙沙星(CIP)为合成的第三代喹诺酮类抗菌药物，具广谱抗菌活性，杀菌效果 好，几乎对所有细菌的抗菌活性均较诺氟沙星及依诺沙星强2 4倍，环丙沙星被广泛 应用于泌尿及呼吸道系统的感染。然而，它的过度使用也对生物及环境造成了严重的污 染。因此，检测特别是快速、简单、灵敏检测环丙沙星变得越来越重要。
目前，检测环丙沙星的方法主要有微生物法、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱 法(HPLC)、色/质联用分析法(LC-MS)、液/质联用分析法(LC-MS/MS)。微生物法的缺陷 是费时而且缺乏特异性。薄层色谱法的缺陷是操作过程复杂，时间长;操作人员需 要经过专业培训；影响分析的干扰因素较多，结果重复性差。薄层色谱法、高效液相色 谱法、色/质连用分析法、液/质联用分析法这些理化方法的缺陷是仪器设备昂贵，样品 前处理复杂，费时，费力，不易普及，检测费用高。鉴于此，建立一种有效、快速、简 单、灵敏的检测环丙沙星的方法具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种检测环丙沙星的化学发光酶联免疫 检测试剂盒。
本发明所述的环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的 酶标板和设在盒体内试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有包被抗原即环丙沙星 与载体蛋白的偶联物；所述试剂包括环丙沙星的多克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化 酶标记的羊抗兔的抗体、环丙沙星标准液、浓縮洗涤液、发光液。
其中所述包被抗原浓度为5vg/mL。
其中所述偶联物的载体蛋白为分子量范围是6.7 KDa 6.8 KDa的牛血清蛋白或 卵清蛋白。
其中所述环丙沙星的多克隆抗体是由环丙沙星与载体蛋白的偶联物作为免疫原免 疫动物制备得到；所述环丙沙星的多克隆抗体的工作浓度优选1:8000。
其中所述辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体的工作浓度优选1:1000。 其中所述环丙沙星标准液浓度分别为0. lng/mL、 0. 2ng/mL、 0. 5ng/mL、 lng/mL 2ng/mL、 5ng/mL。
其中所述浓縮洗涤液为含有体积分数0. 05%吐温-20的pH7. 5、 0. lmol/L磷酸盐 缓冲液。
其中所述发光液是O. 01M鲁米诺与0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基 甲烷溶液(pH=8.8)和3/10000 (体积比)&02的混合液。所述鲁米诺为发光底 物，对甲苯酚为发光增强剂。
本发明的环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒使用时将标准品或样品和抗体
混合后加入酶标板中，标准品或样品中的抗原和酶标板上的包被抗原一起竞争性的与溶 液中的抗体结合，洗涤去除游离的抗原以及抗原抗体复合物，与酶标板上包被抗原结合 的抗体再与酶标二抗结合，结合的酶标记物催化底物发光，加入发光液后用化学发光免 疫分析仪测量发光值，根据底物被酶催化产生的发光强度进行定性或定量分析。
本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与酶催化的高度灵敏性结合起来， 利用酶催化底物的化学发光反应检测产物浓度。
其中涉及的发光反应式为
ooo—
本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与
传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级。可在动物性食品(如奶、动物
组织、尿样)中环丙沙星残留检测中发挥重要作用。
图1为本发明的包被抗原的紫外图谱。 图2为本发明环丙沙星抗体的抑制率曲线。 图3为本发明的工作曲线。
具体实施例方式
实施例l、免疫原、包被抗原的及抗体的制备 (1)免疫原的合成
将环丙沙星与牛血清蛋白(BSA)采用EDC法进行偶联得到免疫原。具体包括以下
步骤
A，分别称取环丙沙星20. 0 mg (54. 4 wmol)，水溶性碳二亚胺(EDC) 104. 2 mg (544 #mol)， N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 31.3 mg (272wmol)依次溶于5 mL DMF中，避光、 室温磁力搅拌反应24小时；
B，将123.3 mg (1.8 /imol) BSA (分子量范围为6. 7 KDa 6. 8 KDa)溶于10 mL 磷酸盐缓冲溶液(PBS) (O.OIM， pH 7.4)中;
C，将"步骤A的产物"缓慢加入到"步骤B的产物"中，室温磁力搅拌反应3小 时；反应完毕后，将反应液转移到半透膜中，在0-4 °C用PBS(0.01M， pH7.4)透析3 天，其间每4-6小时换一次透析液；随后用高纯水透析3天，其间每4-6小时换一
次透析液；透析完毕，用冷冻干燥机冻干，得白色絮状固体即为免疫原(环丙沙星与牛 血清蛋白的偶联物)，-20 °C保存，备用。
(2) 包被抗原的制备方法同免疫原，不同之处在于所用蛋白为卵清蛋白(OVA)。
(3) 环丙沙星多克隆抗体的制备 采用新西兰大白兔作为免疫动物，以环丙沙星与牛血清蛋白的偶联物为免疫原，
首次免疫剂量为500ug/mL，首免时将免疫原溶于入等体积的生理盐水和弗氏完全佐剂制 成乳化剂，颈背部多点注射，以后免疫取剂量减半的免疫原溶于等体积的生理盐水和弗 氏不完全佐剂混合乳化，首免与二免间隔20天，以后每隔两周免疫一次共免疫五次，最 后一次不加佐剂。最后一次免疫7d以后心脏采血，离心得抗血清，得到多克隆抗体。
实施例2、 CL-ELISA检测方法的建立 2.1抗体与包被抗原浓度的优选(方阵)
纵向用每种包被抗原按40. 0;/g/mL、 20. Owg/mL、 10. Owg/tnL、 5. 0//g/mL、 2.5 wg/mL、 1.25//g/mL、 0. 625wg/mL、 0. 3125wg/mL的系列稀释度包被酶标板，100 w L/孔，0-4 。C放置过夜，用洗涤液洗板三次，每次拍干；250wL/孔封闭液封闭，室温 放置3小时，洗板三次，每次拍干；加入100 wL/孔一系列稀释的抗体(1:100至 1:1024000)，室温放置2小时，洗板三次，每次拍干；加入100 ^L/孔的1: IOOO的辣 根过氧化酶标记的羊抗兔抗体，室温放置l小时，洗板三次，每次拍千；加入100^L/
孔的发光液，测定发光值。以发光值随包被抗原的浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度 和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。
2.2抗体灵敏度的测定
根据上述对抗体及包被抗原浓度的优选实验，申请人选择并确定抗体浓度为 1:8000，包被抗原浓度为5 w g/mL进行抗体的灵敏度的测定
1) 包被用0. 05M pH9. 6的碳酸盐缓冲液将环丙沙星的包被抗原配成5 g/mL的溶 液，每个聚苯乙烯板的反应孔中加100;/L， 4t:过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，300wL/孔，每次5分钟，拍干。(此 步简称洗涤，下同)。
2) 封闭用封闭液封闭上述已包被的酶标板，250wL/孔，室温孵育2-4小时，然 后洗涤。
3) 加样加稀释抗体(1:4000) 50^L/孔与不同浓度的药物50;/L/孔于上述巳封 闭的反应孔中，室温2-4小时，然后洗涤。
4) 加酶标抗体于各反应孔中，加入新鲜稀释辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体
(1:1000) 100;/L/孔,1. 5小时，洗涤。
5) 发光于各反应孔中加入临时配制的发光液100 ^L/孔，立即用化学发光免疫 分析仪检测。
6) 检测结果以抑制率计算％抑制率=%8/80， B是不同浓度的药物作为竞争者的 发光值，Bo是不加药的发光值。计算50 %抑制率时药物的浓度即为该抗体的
灵敏度。
实施例3、检测环丙沙星的化学发光酶联免疫试剂
(1) 检测环丙沙星的化学发光酶联免疫试剂盒的组成
a、 包被有包被抗原(环丙沙星与载体蛋白的偶联物)的固相载体(酶标板)；
b、 环丙沙星标准溶液6瓶，浓度分别为O. lng/mL、 0. 2ng/mL、 0. 5ng/mL、 lng/mL、 2ng/mL、 5ng/ml^
c、 环丙沙星抗体工作液(工作浓度为1:8000);
d、 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体工作液(工作浓度为1:1000);
e、 浓縮磷酸盐缓冲溶液NaCl 80. 0g，KH2P04 2. 0g, Na2HP04. 12H202 29 . 0g， KCl 2. 0g,加 双蒸水至1000mL， pH7. 5;
f、 浓縮洗涤液NaCl 80. 0g， KH2P042. 0g， Na異.12H20229. 0g， KCl 2. Og， tween-20 0. 5mL 加双蒸水至lOOOmL;
g、 发光液0.01M鲁米诺+0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液 (pH8.8) + 3/10000 (体积比)^02。
(2) 酶标板的制备
用包被液将包被抗原稀释成5yg/mL，每孔加入100iiL， 4。C过夜，倾去包被液，每 孔加入250 y L洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔加入封闭液250 y L， 37'C孵育lh，倾去孔 内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。
实施例4、检测环丙沙星的化学发光酶联免疫试剂盒的应用 4. 1试剂的配制
1) 样品稀释液将试剂盒中提供的浓縮磷酸盐缓冲溶液用蒸馏水稀释10倍后使用。
2) 洗涤液将试剂盒中提供的浓縮洗涤液用蒸馏水稀释10倍后使用。
3) 发光液0.01M鲁米诺+0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲垸溶液 (pH8.8) + 3/10000 (体积比)H202 。
4.2样品前处理
(1) 牛奶首先将购买的纯牛奶样品在4 'C、 10000转/分钟条件下，离心15分钟， 去掉脂肪层；将脱脂的牛奶用洗涤液稀释成I:IO，得到待测样品。
(2) 猪尿样将猪尿样品在4'C， 10000 g离心15分钟，去掉沉淀，将剩余的猪尿用 洗涤液稀释成1: 10。得到待测样品。
(3) 动物组织取样品与4 mL 0. 1 M的盐酸混合，并且放在一起用超生波提取20 min， 然后10000 g离心15min，取上清液用10MNaOH调pH至9. 5±0. 5，旋涡振荡5min， 然后10000 g离心15 min。取上清液加5 mL异丁醇振荡2 min，混合物室温下静止 15 min，然后3000 g离心10 min，分出有机相，水相再用异丁醇(每次10 mL)萃 取两次，三次萃取的有机相合并在一起，50-60 。C 水浴减压蒸干，残余物用洗涤液重 新溶解配成l: IO的溶液，得到待测样品。
4. 3检测步骤
1) 加样向酶标板微孔中加入环丙沙星系列标准浓度溶液或样品溶液50nL，然后加入 环丙沙星抗体工作液50uL，室温(25°C)恒温孵育2.5h;
2) 洗涤倾出孔中液体，每孔加入洗涤液250uL，洗涤3次，拍干；
3) 加酶标二抗每孔加入酶标二抗工作液100 y L，室温恒温孵育lh;
4) 倾出孔中液体，每孔加入洗涤液250uL，洗涤3次，拍干；
5) 加发光液每孔加入发光液100lxL;
6) 检测用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度。 4. 4结果判断
所获得的标准品和样品发光值的平均值除以第一个标准(0标准)的发光值再乘以 100,以抑制率为纵坐标，环丙沙星浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓 度可以从标准曲线上读出。
%抑制率=%标准品发光值(或样品)/0标准品发光值。
实施例5试剂盒精密度和准确度试验
取O. 1， 0.2， 0.5， 1， 2， 5 ppb的环丙沙星标样，添加到牛奶样品中，来检测环 丙沙星回收率。每个浓度的批间变异系数都以不同的5天的5个重复数据进行计算， 批内变异系数以同一天的5次重复数据计算。根据制定的标准曲线的线性方程进行回 收率的定量计算。结果见下表。
__ _^_
添加浓度检测次数检测结果回收率变异系数检测次数检测结果回收率变异系数
(ppb)n(PPb)(%)(%)n(PPb)(%)(%)
0.150.1111215.450.11075.9
0.250.14707.050.2733.5
0.550.45906.650.58420.2
151.121116.6519117.8
251.628012.25211116.1
554.098118.455787.9
从上述测定结果看，变异系数低于21%，回收率在70-112%之间。表明本试剂盒有 很好的重复性和准确度。
权利要求
1.一种环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有包被抗原即环丙沙星与载体蛋白的偶联物；所述试剂包括环丙沙星的多克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体、环丙沙星标准液、浓缩洗涤液、发光液。
2、 根据权利要求1所述环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所 述包被抗原浓度为5 A g/mL。
3、 根据权利要求1所述环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所 述偶联物的载体蛋白为分子量范围是6.7 KDa 6.8 KDa的牛血清蛋白或卵清蛋白。
4、 根据权利要求1所述环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所 述环丙沙星的多克隆抗体是由环丙沙星与载体蛋白的偶联物作为免疫原免疫动物制备 得到；其中所述环丙沙星的多克隆抗体的工作浓度为1:8000。
5、 根据权利要求1所述环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所 述辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体的工作浓度为1:1000。
6、 根据权利要求1所述环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所 述环丙沙星标准液浓度分别为0. lng/mL、 0. 2ng/mL、 0. 5ng/mL、 lng/mL 2ng/mL、 5ng/mL。
7、 根据权利要求1所述环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所 述浓縮洗涤液为含有体积分数0. 05%吐温-20的pH7. 5、 0. lmol/L磷酸盐缓冲液。
8、 根据权利要求1所述环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所 述发光液是0.01M鲁米诺与0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲垸溶液和 体积比为3/10000 HA的混合液。
9、 根据权利要求1所述环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所 述三(羟甲基)氨基甲烷溶液的pH=8.8。
全文摘要
本发明公开了一种环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有包被抗原即环丙沙星与载体蛋白的偶联物；所述试剂包括环丙沙星的多克隆抗体、酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体、环丙沙星标准液、浓缩洗涤液、发光液。本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级。可在动物性食品(如奶、动物组织、尿样)中环丙沙星残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/543GK101368953SQ20081014008
公开日2009年2月18日 申请日期2008年9月24日 优先权日2008年9月24日
发明者锴 丁, 伟 刘, 刘中秋, 尹伟伟, 李伟华, 王亚宾, 郗日沫 申请人:山东大学