扫描成像装置的制作方法

专利名称：扫描成像装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及在相对于目标基板调整焦点的同时对该基板进行成像以进行检测的 扫描成像装置。更具体而言，本发明涉及通过向配置在基板的流路(flow channel)中的检 测目标照射激发光(excitation light)来检测从检测目标发射的光的扫描成像装置。
背景技术：
在基板中形成微流路、使样品DNA和试剂(reagent)流入其中以产生生物化学反 应的微TAS技术已被用于并且正在被用于各种技术领域，并且，其有用性和优点是公知的。使用用于检测微流路中的双链DNA的量的嵌入剂(intercalator)型荧光标记的 技术也是已知的。通过该技术，双链DNA被加热到约50°C 90°C，并且，通过观察荧光强度 的变化，确定双链DNA分离成单链DNA的温度以获知DNA的类型。但是，微流路是非常小的，并且其截面显示它的边短至几微米到几百微米。当在改 变流路的温度的同时观察微流路中的荧光强度时，基板由于温度改变而翘曲，并且流路移 位。特别是当基板由塑料材料制成时，基板变形并且流路移位程度大。另外，当检测来自流 路中的荧光标记的微弱的荧光时，应优选避免基板材料的自体荧光(auto-fluorescence) 的影响。出于这种目的，优选地，成像装置的成像区域被最小化，以仅拾取来自荧光标记的 荧光，而不接收任何自体荧光。可通过升高成像光学系统的NA以减小焦点深度的技术、基 于共焦成像的原理或光分割(sectioning)的原理检测光以减小成像深度的技术、或一些 其它类似的技术实现这一点。但是，当通过这些技术减小成像深度时，除非流路被对准以使 得成像深度精确地位于流路内，否则，不能精确地检测荧光。另外，可出现这样一种问题， 即，因为由基板的变形、流路的制造误差、定位误差等导致流路面部分地从扫描面偏移，所 以不能精确地观察荧光。作为用于解决这些问题的措施，可以设想提供具有自动聚焦机构的成像装置。日 本专利申请公开No. 2001-242081公开了在实时的基础上操作的自动聚焦机构。该装置被 安装在结合到DNA芯片(chip)的探针的用于检测荧光标记的装置上，以通过象限光电二极 管(quadrant photodiode)接收从DNA芯片的表面反射的激发光，并且，通过观察被象限光 电二极管的四个元件接收的光的量的差异确定焦点位置在目标前面还是在目标后面。然 后，调整透镜位置以使芯片表面恒定地保持焦点对准(in focus)。日本专利No. 3551860公开了一种具有成像系统的装置，所述成像系统是通过使 用一维传感器(多通道光电倍增管)形成的并设置有AF(自动聚焦)机构。日本专利申请 公开No. 2006-322707公开了用于通过象限光电二极管检测流路的上壁和下壁并且以Z字 型方式在它们之间扫描的方法。在日本专利申请公开No. 2001-242081中公开的装置是双重扫描系统的装置。 更具体而言，在检测目标上形成激发光的斑点，并且，将产生的荧光引入诸如光电倍增管 (PMT)的光量检测元件中，以在成像目标上偏移光斑的相对位置的同时获取关于成像目标 的整个表面的信息。当成像目标为了扫描以二维的方式被驱动时，由于扫描操作耗时并且装置体积大，因此该系统是不利的。另外，移动在内部包含液体的流路基板是不现实的，原 因在于会出现气泡并且液体会漏出。上面引用的专利文献还公开了相对于固定成像目标驱 动包含被用于投影激发光并会聚荧光的物镜的光学头的方法。虽然如果与移动成像目标相 比该方法可通过小的驱动单元驱动光学头以更加迅速地扫描，但是，驱动单元的使用是其 前提，使得装置不可避免地大，并且不能避免成像操作耗时的问题。并且，要求使用AF(自 动聚焦)专用的传感器。另外，由于需要在扫描操作时和物镜一起驱动用于沿光轴方向驱 动物镜的音圈马达，因此用于扫描的光学头不可避免地重，并且扫描操作是耗时的。在日本专利No. 3551860中公开的装置具有成像系统和焦点检测光学系统，并且 适于仅关于单一斑点调整焦点。焦点在扫描操作中被固定。因此，不能在对线进行扫描的 同时在实时的基础上调整焦点以适应流路的位置偏移。在日本专利申请公开No. 2006-322707中公开的扫描方法是被应用于双重扫描扫 描仪的方法。由于使用它的扫描操作是耗时的，因此它不是有效率的。

发明内容
因此，本发明的目的是，提供适于在调整焦点的同时通过扫描获取图像的装置。更 具体而言，本发明的目的是，提供如果检测目标是具有变形或倾斜的流路的基板也可优异 地通过单一扫描操作拾取检测目标的图像的扫描成像装置。为了实现以上的目的，根据本发明的扫描成像装置包括用于至少将用于聚焦的斑点光(spot light)照射到用于检测的目标基板上的照 射单元；具有用于接收来自用于检测的目标基板中的检测目标的光和从用于检测的目标 基板反射的斑点光的传感器阵列的光学系统；和用于驱动光学系统以至少沿主扫描方向扫描用于检测的目标基板的扫描单元，其中，斑点光被照射到用于检测的目标基板中的与检测目标不同的位置上，并且，从用于检测的目标基板反射的斑点光被接收以读出从中获取聚焦信号和检测信 号的信号。在本发明的另一方面中，提供一种扫描成像装置，该扫描成像装置包括斑点光投影系统，所述斑点光投影系统用于分别在基板上的不同的位置处照射用 于激发的第一斑点光和用于聚焦的两个第二斑点光，所述第一斑点光将被照射到配置于在 基板中形成的流路中的检测目标上，所述两个第二斑点光将被照射到流路上，并且所述斑 点光投影系统用于至少沿流路扫描第一斑点光和第二斑点光；成像系统，所述成像系统用于使被第一斑点光激发的从检测目标发射的光、作为 流路的顶面处的反射的结果由第二斑点光中的一个产生的第一反射光、和作为流路的底面 处的反射的结果由第二斑点光中的另一个产生的第二反射光成像；和焦点位置调整系统，所述焦点位置调整系统用于沿流路的深度方向调整第一斑点 光和第二斑点光的焦点位置，其中，焦点位置调整系统适于根据通过比较第一反射光的强度和第二反射光的强 度确定的流路的深度方向的第一斑点光和第二斑点光的焦点位置的偏离方向和偏离量操 作。
因此，根据本发明，可通过传感器阵列获取焦点位置上的光的信号和焦点检测信 号，并由此可获取适当的扫描图像。另外，本发明提供即使检测目标是变形或倾斜的流路也可通过单一扫描操作使检 测目标成像的扫描成像装置。参照附图阅读示例性实施例的以下的描述，本发明的其它特征将变得清晰。


图1是根据本发明的扫描成像装置的实施例的示意性框图，该框图示出其配置。图2是沿图1中的箭头A的方向观察的图1所示的斑点光投影部、成像部、基板等 的示意性透视图。图3是相对于微流路的斑点光的主扫描方向的示意图。图4是从各激光束源发射的斑点光在微流路中的位置关系的示意图。图5是微流路的顶面和底面处的从各激光束源发射的激光束的反射的示意图。图6是线传感器的光接收部上的反射图像的位置的示意图。图7是示出当如图6所示的那样由线传感器的光接收部接收反射图像时来自图6 的线传感器的像素的输出的示图。图8是基板和在其中形成的微流路从图5所示的位置向更接近斑点光投影部和成 像部的位置移动距离4d的状态的示意图。图9是图8所示的状态中的线传感器的光接收部上的反射图像的位置的示意图。图10是示出当如图9所示的那样由线传感器的光接收部接收反射图像时来自线 传感器的像素的输出的示图。图11是基板和在其中形成的微流路从图5所示的位置向远离斑点光投影部和成 像部的位置移动距离4e的状态的示意图。图12是图11所示的状态中的线传感器的光接收部上的反射图像的位置的示意 图。图13是示出当如图12所示的那样由线传感器的光接收部接收反射图像时来自线 传感器的像素的输出的示图。图14是图1所示的线传感器的配置的示意图。图15是投影到微流路中的斑点光的位置的示意图。图16A、图16B和图16C是示出当斑点光如图15所示的那样被投影到微流路中时 从线传感器读出的信号的波形的示图。图17是示出沿其布置方向布置在线传感器中的像素的位置(横轴)和来自各像 素的信号的强度(纵轴)之间的关系的示图。图18是表示来自线传感器的各像素的输出的示图。图19是线传感器的像素的电荷的蓄积状态和从像素读出电荷的操作的示意图。图20是可沿主扫描方向以及沿基板的厚度方向偏转斑点光的扫描部的示意性透 视图。图21是通过图20所示的扫描部相对于基板的流路调整斑点光的焦点的操作的示 意图。
图22是示出基板的材料的折射率和在基板的流路中流动的流体的折射率与基板 的温度之间的关系的示图。图23是示出由图中的纵轴表示的单一主扫描操作中的两个反射图像的强度P和 由横轴表示的时间T的关系的示图。
具体实施例方式现在，将在下面描述根据本发明的扫描成像装置的实施例。本实施例的装置的主 要检测目标是微流路中的双链DNA的量、与DNA芯片的探针结合的目标DNA的量。换句话 说，本实施例的装置的主要目的是，通过利用光学特性根据生物化学反应的有无而改变的 现象，检测目标物质的有无。可对于装置使用的目标物质还包括蛋白质、配位体(Iigands) 和微生物。可用于观察光学特性改变的现象的方法包括使诸如荧光物质的标记物质、化学 发光物质或染料与目标物质或特定地捕获目标物质的探针耦合并检测它们之间的反应的 有无的方法。(A)装置配置图1是根据本发明的扫描成像装置的实施例的示意性框图，该框图示出其配置。 图2是沿图1中的箭头A的方向观察的图1所示的斑点光投影部、成像部、基板等的示意性 透视图。本实施例的扫描成像装置包括布置于箱体14内的斑点光投影部101和成像部 102、支撑形成多个微流路5、6和7的基板4的温度受调块8、以及温度调节部9。本实施例 的扫描成像装置还包括用于沿图1所示的方向15a驱动箱体14的驱动部15，具有存储器 17、CPU 18和A/D转换部19的控制电路16，以及用于控制温度调节部9的温度的温度调节 控制部10。斑点光投影部101是用于将用于聚焦的斑点光照射到用于检测的目标基板上的 照射手段。斑点光投影部101具有用于发射用于激发添加到微流路5 7中的检测目标的 荧光标记的488nm的波长的激发激光束的激光束源1和用于发射532nm的波长的焦点检测 激光束的激光束源21和22。因此，从激光束源1照射的第一斑点光la(参见图4)具有第 一波长(488nm)，而分别从激光束源21和22照射的两个第二斑点光21a和22a (参见图4) 中的每一个具有第二波长(532nm)。斑点光投影部101还具有通过使用用于扫描这种激光 束的扫描反射镜形成的扫描部2和用于将激光束的扫描位置变换到与扫描部2的偏转角度 成比例的位置的f θ透镜3。照射到基板上的斑点光通过f θ透镜3被转换成准直光。另外，成像部102具有作为聚焦光学系统的聚焦元件阵列(例如，Selfoc透镜阵 列商品名称，可从Nippon Sheet Glass Co. ,Ltd.得到)11、荧光过滤器12和作为传感器 阵列的线传感器13。荧光过滤器12具有阻挡用于激发的第一波长(488nm)的光而透过从 被第一波长光激发的荧光标记发射的荧光(波长为500nm 530nm)和第二波长(532nm) 的光的特性。因此，通过这些元件形成具有传感器阵列的光学系统，所述传感器阵列用于接 收来自用于检测的目标基板的流路中的检测目标的光和从用于检测的目标基板反射的斑 点光。通过上述的配置，为了聚焦而照射并被流路反射的斑点光可通过传感器阵列与来自 检测目标的光一起被接收。反射的用于聚焦的斑点光可与来自检测目标的荧光分开，使得 可分离地读出通过接收来自用于检测的目标基板的光获得的信号，以根据所述信号获取聚
7焦信号和检测信号。用于聚焦的斑点光适于获得关于与焦点位置不同的位置的信息。优选地，形成两 个不同的斑点光，并且，光学系统被布置成能够获取关于来自流路的顶面的反射光和来自 流路的底面的反射光的信息。然后，可以容易地以下面描述的方式将焦点位置限定到流路 的顶面和底面之间的位置。这里，应当注意，如果焦点位置可被限定为距用于聚焦的斑点光的反射位置的位 移量，那么可以仅形成单一的斑点光。如果情况如此，那么焦点可例如被限定到距流路的底 面不低于2 μ m且不高于10 μ m的位置。基板4具有与多种类型的不同的试剂对应的微流路5、6和7，并且，通过缓冲溶液 相互分开的多种类型的目标DNA和荧光标记被放入微流路5、6和7中。荧光标记是在被纳 入双链DNA的两个链中时被激发以发射荧光的嵌入剂类型(例如，SYBR Greenl 商品名称， 可从Molecular Probe得到)。这种荧光标记的激发波长介于470nm和490nm之间并适于 发射介于500nm和530nm之间的波长的荧光。通过液体传输手段(未示出)，液体在流路中 移动。基板4在其底面上被温度受调块8覆盖，该温度受调块8通过温度调节部9被加热 和冷却。温度调节部9的温度被温度调节控制部10控制。包含斑点光投影部101和成像部102的箱体14适于通过使用步进马达或超声马 达所形成的驱动部15被驱动为沿与扫描部2的主扫描方向2a(参见图2)垂直的副扫描方 向15a移动。本实施例的扫描成像装置在被驱动以沿扫描部2的主扫描方向2a扫描并且 沿箱体14 (S卩，斑点光投影部101和成像部102)的副扫描方向15a移动时可拾取流路5 7中的任一个中的荧光标记的荧光图像。从各激光束源21和22发射的532nm的波长的焦点检测激光束透过荧光过滤器 12。扫描部2使得从光源21和22发射的激光束像从激光束源1发射的激光束那样扫描。 来自流路5 7中的任一个的顶面的激光束的反射光和来自其底面的激光束的反射光通过 聚焦元件阵列11被引向线传感器13。形成聚焦元件阵列11的元件是通过使用渐变折射率(grated index)型材料制备 的光学元件。它们在透镜组内产生一次成像目标的图像，然后在像面上形成成像目标的正 立图像。聚焦元件阵列11是通过在直线上布置这些透镜制备的部件，并且可在像面上形成 具有大的面积的成像目标的正立图像。控制整个扫描成像装置的控制电路16具有存储器17、CPU 18和A/D转换部19，并 且用于控制扫描部2的操作和线传感器13的操作。它还用于控制温度调节控制部10和驱 动部15。来自线传感器13的输出在控制电路16的控制下被传送到A/D转换部19，并且， 通过A/D转换部19的A/D转换的结果被发送到存储器17。在被用于控制该装置的控制电路16所使用的区域以外的区域中，存储器17具有 用于扫描操作中的主扫描的存储器区域。用于主扫描的存储器区域充当用于存储线传感器 13的数据的多个线存储器。线存储器的部分区域被确保用于存储在斑点光通过像素中的一 个的时间和它下一次通过该像素的时间之间的时间段由线传感器13在所有像素上获得的 数据。以下，线存储器的以上的部分区域将被称为时隙数据线存储器。线存储器的另一区 域还被确保用于存储从存储在存储器的以上的部分区域中的数据获得的值。以下，线存储 器的后面的区域将被称为合成数据线存储器。
为了存储主扫描和副扫描的组合的二维数据，另外的线存储器也被确保作为用于 存储与多次的主扫描对应的合成数据线存储器的数据的区域。可通过使用电流镜(galvano-mirror)、MEMS反射镜、微反射镜阵列、多面镜等形 成本实施例的装置的扫描部2。可通过使用聚焦元件阵列、微透镜阵列或普通的聚焦光学 系统形成本实施例的装置的聚焦光学系统。可通过使用线型CCD传感器、具有多个线的面 型CCD传感器、线型CMOS传感器或具有多个线的面型CMOS传感器形成本实施例的装置的 传感器阵列。〔B〕检测现在，将参照图1和图2在下面描述通过上述的扫描成像装置拾取在基板4中形 成的流路5 7中的任一个中的荧光标记的图像(荧光检测)的方法。注意，除了将被照射到焦点位置上的激发光不是必需的以外，荧光检测方法以外 的任何方法在原理上是相同的。从激光束源1发射的激光束被扫描部2反射并被f θ透镜3会聚以形成具有约 IOum的直径的第一斑点光la。扫描部2是可关于包括激光束的反射点并且相互正交的两 个旋转轴自由旋转的微反射镜器件。它操作为通过以第一旋转轴2b为中心的角度振荡进 行主扫描，并且，通过以第二旋转轴2c为中心的角度调整进行聚焦调整。被扫描部2反射 的激光束沿主扫描方向2a以每秒约十次的速度往复振荡。然后，作为结果，如图3所示，使得斑点光扫描，以沿与流路5、6和7基本上平行的 方向2301每秒进行约十个来回。虽然希望扫描是恒定速度扫描，但是，实际上难以将扫描 速度维持在恒定的水平，并且扫描引起不同的速度。因此，扫描可以是表现正弦波形的非恒 定扫描。当斑点光通过光学传感器(未示出)时，检测用于开始斑点光的扫描的基准位置。扫描部2的光束反射点与f θ透镜3的焦点位置一致。因此，激光束变成由于f θ 透镜3的折射而离开与由扫描部2产生的偏转角度成比例的距离并且与光轴平行地前进的 会聚光束。以斑点光的投影位置和线传感器13的光接收部相互共轭(conjugated)的方式 布置聚焦元件阵列11和线传感器13。通过该配置，只有照明光通量通过的区域变为被照明 区域，使得光束宽度变成成像深度，以使得能够实现高度精确的成像(荧光检测)，而不受 自体荧光的影响。因此，当流路5 7中的任一个与成像光路和照明光路的交点一致时，从 任何合适的流路5、6或7中的荧光标记发射的荧光通过聚焦元件阵列11被引向线传感器 13的光接收部。当扫描部2的扫描循环结束时，包含斑点光投影部101和成像部102的箱体14被 驱动部15驱动以沿关于主扫描方向2a垂直的副扫描方向15a移动。换句话说，扫描部2 用于主扫描，并且，驱动部15用于副扫描。因此，通过主扫描和副扫描的组合拾取由图3中 的虚线表示的成像范围2302、2303和2304中的任一个中的荧光的图像。由于可使得副扫 描跳过使流路5 7分开的间隙，因此，当如图3所示的那样沿与流路5 7的纵向平行的 方向实现主扫描时，可以有效地进行扫描操作。由于在本实施例中使用诸如聚焦元件阵列 11的小的光学部分，因此可以在短时间内进行这种跳过。〔C〕焦点检测如上所述，激光束源21和22是分别发射532nm的波长的激光束的光源。该波长的 光束透过荧光过滤器12。与上述的来自激光束源1的激光束类似，从激光束源21和22发
9射的激光束被扫描部2反射，并且，通过f θ透镜3会聚成10 μ m的直径的第二斑点光21a 和22a。此时，激光束被投影到与扫描部2的反射面上的激发斑点光Ia —致但如图4所示 与基板4的流路5 7形成处的面上的激发斑点光Ia不同的位置。图4是微流路6中的 从各激光束源1、21和22发射的斑点光la、2Ia和22a的位置关系的示意图。在图4中，虚 线的箭头30表示斑点光Ia的扫描的轨迹，并且，斑点光21a和22a沿斑点光Ia的扫描方 向以及沿与该扫描方向垂直的方向彼此相反地位移并被投影。图5示意性地示出分别从激光束源1、21和22发射的激光束如何被微流路的顶面 和底面反射。在来自作为激发光源的激光束源1的激发光的投影光轴Ib和从微流路6中的被 激发的荧光标记发射的荧光的成像光轴13b的交点位于微流路6中的对焦状态下，光轴Ib 和13b显示下述的关系。即，来自激光束源1的激发光的投影光轴Ib和入射到线传感器13 的光接收部的光的成像光轴13b在微流路6的流路顶面6a和流路底面6b之间的位置处相 交。换句话说，线传感器13仅接收从微流路6的内部发射的荧光。激发光直到到达流路5 7以及通过流路5 7之后一直激发基板4的材料，并 且，基板4也发射自体荧光。但是，当从像素观察时，在远离与成像光轴13b的交点的位置 处发射的自体荧光被投影到沿与线传感器13的像素的布置的方向垂直的方向位移的位置 上，使得基板4的自体荧光决不作为信号被线传感器13接收。因此，线传感器13仅检测从 作为线传感器13的检测对象的微流路6的内部发射的荧光。因此，线传感器13以良好的 S/N比检测荧光。在分别从激光束源21和22照射的两个斑点光21a和22a之中，从激光束源21照 射的斑点光21a沿光轴21b被投影到基板4的顶面4a上的关于激发光的投影光轴Ib的偏 心位置上。然后它向流路顶面6a行进。由于基板4的材料的折射率和流路6中的流体的 折射率相互不同，因此沿光轴21b照射的斑点光21a在流路顶面6a处被部分反射。被流路 顶面6a反射的斑点光21a的第一反射光透过荧光过滤器12并且通过聚焦元件阵列11被 引向线传感器13。如图6所示，在流路顶面6a上形成的从激光束源21发射的斑点光21a 的反射图像21c以部分落在线传感器13上的程度沿与线传感器13的光接收部13a的像素 的布置方向垂直的方向偏心。类似地，从激光束源22发射的另一斑点光22a也如图5所示的那样沿光轴22b行 进，并在光轴21b的相反侧被投影到关于光轴Ib偏心的位置。斑点光22a正如沿光轴21b 行进的斑点光21a那样部分地被流路顶面6a反射，斑点光22a的剩余部分透过微流路6并 到达流路底面6b。由于基板4的材料的折射率和流路6中的流体的折射率彼此不同，因此， 斑点光22a也在流路底面6b处部分地被反射。作为被流路底面6b反射的斑点光22a的一 部分的第二反射光透过荧光过滤器12并且通过聚焦元件阵列11投影到线传感器13上。如 图6所示，通过流路底面6b形成的斑点光22a的反射图像22c在反射图像21c的相反侧被 引向相对于光接收部13a偏心的位置。此时，反射图像22c以部分落在其上面的程度被投 影到相对于线传感器13的光接收部13a偏心的位置。并且，反射图像22c被投影到相对于 线传感器13的走向偏心的位置，使得它不落在通过来自激光束源21的斑点光21a形成的 反射图像21c和来自激光束源1的激发光的反射图像Ic上。沿光轴21b行进的斑点光21a的流路底面6b处的反射图像和沿光轴22b行进的斑点光22a的流路顶面6a处的反射图像被投影到比反射图像21c和22c远离线传感器13 的光接收部13a的各位置，使得这些反射图像决不作为信号被线传感器13识别。图7是示出当如图6所示的那样由线传感器13的光接收部13a接收反射图像lc、 21c和22c时来自图6的线传感器的像素的输出P的示图。在图7中，附图标记ld、21d和 22d分别表示反射图像lc、21c和22c的输出P。如上所述，当激发光的投影光轴Ib和成像 光轴13b在流路中相交时，如图7中的附图标记21d和22d表示的那样，反射图像21c和 22c的焦点位置处的线传感器13的光接收区域13a的像素的输出P基本上彼此相等。图8是基板4和在其中形成的微流路6从图5所示的位置向更接近斑点光投影部 101和成像部102的位置移动距离4d的状态的示意图。当微流路6相对于斑点光投影部101和成像部102 (参见图1)表现图8所示的位 置关系时，从激光束源21发射并沿光轴21b行进的光束在流路顶面6a上的接近成像光轴 13b的位置701处被反射。从激光束源22发射并沿光轴22b行进的光束在流路底面6b上 的远离成像光轴13b的位置702处被反射。然后，作为结果，通过分别沿这些光轴21b和 22b行进的光束形成的反射图像21c和22c表现图9所示的相对于线传感器13的光接收部 13a的位置关系。换句话说，虽然通过来自激光束源21的光束形成的反射图像21c在接近 线传感器13的光接收部13a的位置处聚焦，但是，通过来自激光束源22的光束形成的反射 图像22c在远离光接收部13a的位置处聚焦。这样，当微流路6的位置接近斑点光投影部 和成像部时，反射图像21c的焦点位置处的来自线传感器13的光接收部13a的像素的输出 21d比反射图像22c的焦点位置处的像素的输出22d强(参见图10)。图11是基板4和在其中形成的微流路6从图5所示的位置向远离斑点光投影部 101和成像部102的位置移动距离4e的状态的示意图。当微流路6相对于斑点光投影部101和成像部102 (参见图1)表现图11所示的 位置关系时，从激光束源21发射并沿光轴21b行进的光束在流路顶面6a上的远离成像光 轴13b的位置1001处被反射。从激光束源22发射并沿光轴22b行进的光束在流路底面6b 上的接近成像光轴13b的位置1002处被反射。然后，作为结果，通过分别沿这些光轴21b 和22b行进的光束形成的反射图像21c和22c表现图12所示的相对于线传感器13的光接 收部13a的位置关系。换句话说，虽然通过来自激光束源21的光束形成的反射图像21c在 远离线传感器13的光接收部13a的位置处聚焦，但是，通过来自激光束源22的光束形成的 反射图像22c在接近光接收部13a的位置处聚焦。这样，当微流路6的位置远离斑点光投 影部和成像部时，反射图像21c的焦点位置处的来自线传感器13的光接收部13a的像素的 输出21d比反射图像22c的焦点位置处的像素的输出22d弱(参见图13)。从以上看出，斑点光投影部101和成像部102(参见图1)与微流路5 7之间的 距离被保持，使得通过线传感器13的光接收部13a检测的两个反射图像21c和22c的强度 基本上相等。换句话说，当以这种方式保持以上的距离时，来自激光束源1的激发光的投影 光轴Ib和成像光轴13b的交点位于流路5 7中的一个中，线传感器13可恒定地捕获从 流路5 7中的相应的一个中的荧光标记发射的荧光。(D)线传感器控制图14是图1所示的线传感器的配置的示意图。如图14所示，线传感器13的光接 收部13a由作为诸如光电二极管的光电转换元件的多个像素cl、c2、c3、...形成，并且具有蓄积作为光电转换的结果产生的电荷的功能。线传感器13另外具有用于根据电荷读取 指示信号接收蓄积在光接收部13a中的电荷的CCD 13b和用于根据CCD传送指示信号以像 素的布置的次序依次将CXD 13b的像素的蓄积的电荷转换成电压值的放大器13c。CXD 13b 根据电荷读取指示信号接收在光接收部13a中蓄积的电荷。随后，通过用于根据CCD传送 指示信号以CCD 13b的像素的布置的次序依次将蓄积的电荷转换成电压值的放大器13c， 在CCD 13b中蓄积的电荷被依次输出到线传感器13的外面。图14还示出反射图像lc、21c和22c实际上如何投影到线传感器13的光接收部 13&的像素(1、(32、(33、...上。反射图像lc、21c和22c根据扫描部2的扫描操作沿像素的 布置方向移动。现在，将在下面描述从线传感器13读取信号的操作。虽然反射图像lc、21c和22c 通过扫描被发送到光接收部13a，但是，控制电路16(参见图1)重复蓄积线传感器13的像 素13a的电荷的操作和读取电荷的操作。例如，如果反射图像以每秒10个往复的速度被扫 描，那么扫描一条线花费的时间为50msec。为了以10 μ m的节矩对20mm长的流路的图像采 样，以采样频率=l/50msec/10 μ m * 20mm = 40kHz从线传感器13读出信号。此时的蓄积 时间为25 μ sec。图15是投影到微流路6中的斑点光的位置的示意图。多个检测目标601、603、605 和607被布置在流路6中，使得缓冲溶液602、604和606插入它们之间。当时间从Tl前进 到T2并然后到T3时，响应扫描部2的上述的扫描运动，三个斑点光沿图15所示的向右的 方向沿流路6移动。图16A、图16B和图16C示出此时从线传感器13读出的信号的波形。在图16A、图 16B和图16C中的每一个中，横轴表示线传感器13的像素的布置的方向的位置，纵轴表示来 自各像素的信号的强度。图16A所示的时间Tl处的信号波形表现三个峰值1501、1502和 1503。在这三个峰值中，包含左峰值1501和右峰值1503的两个峰值表示用于焦点检测的 反射图像21c和22c的强度，而中心的峰值1502表示通过激发光形成的反射图像Ic的来 自流路6的内部的荧光的强度。由于激发斑点光Ia照射检测目标601，因此在时间Tl获 得高强度的荧光。如图16B中的时间T2处的信号波形所示，由于激发斑点光Ia在时间T2 照射检测目标601和缓冲溶液602之间的点，因此检测的荧光的强度在时间T2处比在时间 Tl处弱。因此，时间T2的中心峰值1505比时间Tl的中心峰值1502低。但是，注意，时间 T2的左峰值1504和右峰值1506的强度变化不明显，原因是它们分别表示来自流路顶面和 流路底面的反射图像的强度。如图16C中的时间T3处的信号波形所示，由于激发斑点光Ia 在时间T3照射缓冲溶液602，因此检测的荧光的强度(中心峰值1508的高度)在时间T3 处比在时间T2处更弱。图17是示出沿其布置方向布置在线传感器13中的像素的位置(横轴)和来自各 像素的信号的强度(纵轴)之间的关系的示图。图17中的暗圈表示从表示信号的强度的实 际波形获得的值。暗圈的位置与表示荧光的强度的峰值1502、1505和1508 (图16A、图16B 和图16C)的位置对应。虽然峰值在图16A、图16B和图16C中被表示为曲线的峰值，但它们 实际上代表图18所示的线传感器的相应的像素的峰值输出。因此，可通过使用为荧光的强 度的峰值的约20%的阈值并找到波形的重心或面积中心，确定峰值中的每一个的位置。暗 圈中的每一个的高度代表通过添加构成峰值1502的波形的像素的输出获得的值。然后，画
12出以这种方式确定的暗圈的坐标，以获得图17中的T1、T2和Τ3。还从实际的波形获得图17 中的其它的暗圈。这样，以4MHz的速度读取线传感器13的所有像素的电荷。因此，通过单 一主扫描操作获得2000组数据，每组表示图16A、图16B和图16C中的任一个所示的波形。如上面指出的那样，难以将扫描部2的扫描速度维持在恒定的水平。换句话说，斑 点光的每单位时间的移动距离根据扫描速度改变。图17示出扫描速度逐渐增加、使得随着 斑点光前进沿水平方向分开暗圈的间隔逐渐增加的情况。由于要求以按恒定的距离间隔获 得的信息来形成图像，因此，需要通过计算确定由图17中的空心圆表示的恒定距离间隔的 强度数据。更具体而言，将暗圈中的每一个的坐标定义为X，并且，定义用于确定X处的强度 的近似多项式Y = F⑴。然后，依次通过以恒定距离间隔布置的点的坐标代替X以确定这 些坐标的强度。通过使用以这种方式获得的强度数据形成的图像在位置上是高度可靠的， 并且不受扫描速度误差和畸变的影响。另外，所有的获得的强度数据基于恒定的蓄积时间 并由此是高度可靠的。可通过检测作为聚焦信号的焦点检测斑点光的两个峰值的强度并在实时的基础 上比较它们，检测散焦方向(斑点光投影部和成像部是接近还是远离流路)。注意，不管通 过激发光的斑点光产生的荧光的强度如何，都对于两个焦点检测斑点光的信号获得恒定的 强度。因此，如果代表由激发光的斑点光产生的荧光的强度的中心峰值的强度低，那么可 通过使用这些信号确定中心峰值的位置。由于中心峰值的位置位于两个焦点检测斑点光之 间，因此可从两个焦点检测斑点光的位置确定它。因此，由于可以按上述的方式从通过使用 两个焦点检测斑点光获得的强度信号精确确定信号强度的峰值位置并由此确定焦点位置， 因此可以拾取精确的图像。上述的方法在扫描斑点光的同时以规则的时间间隔从线传感器13的所有像素读 取信号，并且将它们记录于存储器中。因此，需要对于A/D转换部19(参见图1)和其它的 部件使用表现高的处理速度的部件，并且需要大容量存储器17 (参见图1)。但是，如果A/D 转换部不表现高的处理速度，那么可替代性进行这样的布置，即，为了用具有小容量的存储 器扫描斑点光，斑点光的大致的位置被事先存储在存储器中，以仅取出位于它们周围的像 素的信号。与上述的方法类似，这种布置也可获取图像信息。由于斑点光的位置仅由扫描部2 (参见图1等)的角度确定，因此可以通过检测扫 描部2的角度并且仅读取关于与斑点光的位置对应的像素的信息，降低信号读取速度以减 少将被处理的数据的量。图19是线传感器的像素的电荷的蓄积状态和从线传感器的像素读出电荷的操作
的示意图。在图19中，垂直列出依次在线传感器中布置的像素cl、c2.....c20、...，而时
间的前进在水平方向上由t表示。本实施例的线传感器13是CMOS传感器，并且可在外部 控制读取其像素中的每一个的蓄积的电荷的定时。因此，检测扫描部2的主扫描角度，并 且，与扫描部2的检测角度同步地以开关的方式依次读出电荷蓄积像素的电荷。具体而言， 如图19中的“CH”所示，首先，分别在与斑点光的位置对应的像素cl、c5和c9中蓄积电荷。 然后，从这些像素读出的电荷在它们被存储到存储器17中之前在A/D转换部19处经受A/ D转换。同时，开始分别于下面的像素c2、c6和ClO中蓄积电荷的操作。然后，电荷在它们 被存储在存储器17中之前被读出并在A/D转换部19处经受A/D转换。这样，以上述的方 式检测焦点检测斑点光21c和22c的强度。CPU 18通过依次从存储器17读出数据并比较两个斑点光21c和22c的强度，检测散焦方向，并且进行必要的校正。由于电荷的蓄积的持 续时间如上面指出的那样改变，因此优选检测持续时间以校正斑点光Ic的荧光的强度。如上所述，控制电路16比较第一反射光和第二反射光(反射图像21c和22c)的 强度，并且确定微流路的深度方向的斑点光la、21a和22a中的每一个的偏离方向和偏离 量。然后，如下所述，响应偏离方向和偏离量操作焦点位置调整系统以调整斑点光la、21a 和22a中的每一个的焦点位置。(E)焦点校正可通过将在后面描述的焦点位置调整机构调整关于基板4中的微流路5 7中的 任一个从斑点光投影部101照射的斑点光中的每一个的焦点位置。首先，可以设置用于驱动如图1所示的那样布置于箱体14中的斑点光投影部101 和成像部102的垂直驱动机构(未示出)，以沿与基板4垂直的方向(沿微流路的深度方 向)移动它们。然后，可通过驱动斑点光投影部101和成像部102垂直移动，以使得两个焦 点检测反射图像21c和22c的强度相等，而校正焦点。但是，注意，图1所示的斑点光投影 部101和成像部102可相当重。从而，可能需要大的垂直驱动机构来驱动它们迅速移动。还可通过借助于垂直驱动机构(未示出)或驱动部15仅驱动斑点光投影部101 以相对于基板4垂直或水平移动来校正焦点。通过该配置，由于只需要驱动斑点光投影部 101移动，因此可减少驱动机构的负载以使得能够迅速校正焦点。其次，可以设置用于沿主扫描方向扫描斑点光并且同时沿基板4的深度方向偏转 斑点光的手段，其中所述主扫描方向的走向沿着基板4的流路5 7的纵向。当使用这种 手段时，可以在不驱动大的垂直驱动机构的情况下迅速进行焦点校正的操作。图20是扫描部的示意性透视图，所述扫描部能够沿主扫描方向(第一方向)以及 在走向与流路的顶面和底面平行的面上沿与第一方向垂直的第二方向偏转斑点光，所述主 扫描方向(第一方向)的走向沿着流路的纵向。图20所示的扫描部2具有通过第一轴1502 和1503被框架构件1504可旋转支撑的反射镜部1501。另外，框架构件1504通过第二旋转 轴1505和1506被另一框架构件(图20中未示出)可旋转支撑，其中第二旋转轴1505和 1506与第一轴1502和1503正交。反射镜部1501通过已知的驱动手段在控制下被驱动，以 在绕第一轴1502和1503的旋转的方向(sense)上摆动，从而进行斑点光的主扫描。支撑 反射镜部1501的框架构件1504通过已知的驱动手段被驱动，以在控制下绕第二轴1505和 1506旋转，以沿基板4的深度方向偏转斑点光。因此，当通过上述的焦点检测信号(反射图像21c和22c)沿流路的垂直方向(深 度方向)检测散焦情形时，如图21所示，为了焦点控制，扫描部2在角度上被控制和被驱 动，以转向从主扫描方向倾斜90°的方向。例如，如果流路6如图11所示的那样与光学系 统分开距离4e，那么，在沿光轴21b和22b行进的斑点光之中，如图12所示，反射图像21c 位于远离光接收部13a的位置，而反射图像22c位于接近光接收部13a的位置。然后，如图 21所示，通过沿与主扫描方向垂直的方向旋转扫描部2而进行调整，如附图标记21e和22e 所示，从光束源21和22发射的光束向下偏转。因此，作为结果，可以在关于线传感器13的 光接收部13a等距的位置处形成光束21e和22e的两个反射图像。在该条件下，沿通过从 激发光源1发射的光束形成的光轴Ie行进的光束在流路顶面6a和流路底面6b之间的中 间位置处与成像光轴13b相交，使得线传感器13可有效地捕获来自流路6的荧光图像。
当在扫描激光斑点光的同时在实时的基础上进行焦点校正控制操作时，即使流路 5 7由于流路5 7的部分上的变形或制造误差从通过成像深度形成的成像面位移，也可 有效地拾取流路中的任一个中的荧光标记的荧光图像。在上述的例子中只有激发光的投影位置为了焦点校正被偏移，使得可出现荧光检 测面从成像元件阵列11的焦面(focal plane)偏移并且在线传感器13上没有适当地形成 反射图像的担心。但是，这种聚焦元件阵列的焦点深度一般为200 μ m 300 μ m,并且，反射 图像的观察值不受几十μm的位移的影响。〔F〕温度测量现在，将在下面讨论通过上述的扫描成像装置在拾取荧光图像的同时测量流路中 的液体的温度的方法。如上面指出的那样，加热或冷却流路中的检测目标并且同时基于获取的关于荧光 的强度的变化的信息检查目标的技术是公知的。对于这种技术来说，掌握整个成像区域上 的检测目标的温度是重要的。与荧光的强度一起对检测目标的温度进行精确的检测是特别 重要的，但是，目前还没有提出可测量检测目标的温度并且还检测荧光的扫描仪。可以设想测量基板的表面的温度以估计流路中的温度的技术。但是，基板的表面 的温度易于受环境的影响并由此不能被精确地测量。简言之，如果能够与荧光一起测量不 停地改变的流路中的温度，那么可以提高检测荧光的强度的精度。通过基板的材料的折射率和在流路内流动的流体的折射率，确定流路的顶面和底 面的反射率。如图22所示，在流路内流动的流体的折射率随温度改变。因此，可从被流路 的顶面和底面反射的光的强度确定流路内的液体的温度。如图22所示，对于40°C的水和石英，折射率分别为1. 332和1. 4609，而对于50°C 的水和石英，折射率分别为1.3317和1.4610，并且，对于60°C的水和石英，折射率分别为 1.3312和1.4611。因此，如果入射到流路的光的入射角度为30°C，那么反射率在40°C时 为0. 403%，在50°C时为0. 407%并且在60°C时为0. 411 %。换句话说，当温度从40°C变为 50°C时，关于温度变化的反射光的强度的变化比率为0. 407/0. 403 = 1. 01，并且，当温度从 50°C变为60°C时，关于温度变化的反射光的强度的变化比率为0. 411/0. 407 = 1. 01。简言 之，当温度变化10°C时，反射光的强度变化约1%。控制电路16的存储器17存储基板4的 温度和在其流路中流动的液体的温度与这些温度下的流路(流路顶面6a和流路底面6b) 和液体的界面处的光的反射率的相互关系。图23是横轴表示时间T并且纵轴表示主扫描循环中的反射图像21c和22c的强 度P的示图。附图标记21f和22f表示当在流路的顶面和底面处反射从焦点检测激光束源 21和22发射的激光束时形成的各反射图像的强度，而虚线1801表示其平均值。虽然强度 21f和22f会由于散焦而单独地波动，但是，只要温度恒定，如果反射图像21c和22c的位置 偏移，它们也恒定地相等。但是，如上所述，当流路中的液体的温度变化并且反射率由于折 射率的变化而改变时，平均强度1801改变。在由图23中的附图标记1802表示的区域中，平 均强度高。这表示，在该区域中以及在该区域附近，反射率升高，由此，基板和液体之间的折 射率的差异增加。然后，可以看出，液体的折射率被降低了，由此液体的温度被升高了。还 可通过平滑地连接两个强度22f和21f相等的点(诸如由附图标记1802、1803、1804等表 示的点)，获得平均强度1801的示图。
控制电路16的CPU 18从平均强度1801相对于从焦点检测激光束源21和22发射 的激光束(第二斑点光)的强度的比率确定流路顶面和流路底面处的光的反射率。注意， 关于从激光束源21和22发射的激光束的强度的信息被输入到控制电路16。然后，控制电 路16的CPU 18可通过使用获得的反射率、从存储在存储器17中的反射率和液体温度的相 关关系确定流路中的液体的温度。控制电路16的CPU18可事先存储由于散焦导致的两个 反射光束的强度的平均值的偏移的趋势，并且基于获得的值和所述趋势通过计算确定液体 的温度。因此，通过上述的方法，能够在扫描荧光以检测流路中的检测目标时检测液体的 温度。从而，不再需要给装置设置用于检测流路中的液体的温度的专用布置，使得可以在不 使用大的装置的情况下精确地检查检测目标。〔G〕其它虽然在上面描述了使用从传感器阵列选择的线传感器作为光检测手段，但是，可 替代性通过使用通过二维布置图像拾取元件形成的面传感器进行光检测(成像)操作。通 过布置多个线传感器形成面传感器，并且，可通过使用面传感器的特定的线借助于面传感 器和检测光进行上述的光检测操作。扫描成像装置具有作为控制手段的包含存储器17、CPU 18和A/D转换部19的控 制电路16，并且，控制电路16与上述的扫描成像装置连接。但是，控制电路16可被操作为 存储器17、CPU 18和A/D转换部19的外部计算机(未示出)代替，并且，所述计算机可与 扫描成像装置连接。从而，通过这种布置，外部计算机操作为控制手段。在以上的描述中，向检测目标添加荧光标记作为光发射标记并且检测从荧光标记 发射的荧光。但是，可被用作光发射标记的标记决不限于这种荧光标记。例如，可替代性地 向检测目标添加适于发射磷光的标记，以检测从光发射标记发射的磷光。本发明不限于上述的实施例，并且，在本发明的精神和范围内，可以进行各种变化 和修改。因此，为了向公众通知本发明的范围，提出以下的权利要求。本申请要求在2008年4月2日提交的日本专利申请No. 2008-096145的权益，在 此通过引用并入其全部内容。
权利要求
一种扫描成像装置，包括照射单元，所述照射单元用于至少将用于聚焦的斑点光照射到用于检测的目标基板上；光学系统，所述光学系统具有传感器阵列，所述传感器阵列用于接收来自用于检测的目标基板中的检测目标的光和从用于检测的目标基板反射的斑点光；和扫描单元，所述扫描单元用于驱动所述光学系统，以至少沿主扫描方向扫描用于检测的目标基板，其中，所述斑点光被照射到用于检测的目标基板中的与检测目标不同的位置上，以及，其中，从用于检测的目标基板反射的斑点光被接收以读出从中获取聚焦信号和检测信号的信号。
2.根据权利要求1的装置，其中，所述照射单元适于将激发斑点光和两个聚焦斑点光照射到用于检测的目标基板 上的相互不同的相应的位置。
3.根据权利要求1或2的装置，其中，所述照射单元适于将准直的斑点光照射到用于检测的目标基板，并且所述装置 通过检测被所述传感器阵列接收的从用于检测的目标基板反射的准直斑点光来获取聚焦信号。
4.根据权利要求2的装置，其中，所述扫描单元是反射镜，所述反射镜适于为了所述斑点光的与传感器阵列平行 的主扫描和为了通过沿与主扫描垂直的方向的偏转而进行的焦点调整，在控制下沿两个方 向偏转光。
5.根据权利要求2的装置，其中，所述传感器阵列是通过在线上布置图像拾取元件以能够进行寻址读出而形成的 线传感器，以及，其中，所述装置还包括控制单元，所述控制单元用于读出和存储来自与斑点对应的位 置处的图像拾取元件的输出。
6.一种扫描成像装置，包括斑点光投影系统，所述斑点光投影系统用于将来自用于发射第一波长的光束的光源的 光束和用于发射第二波长的光束的光源的光束引向成像目标、以及在将被扫描单元扫描的 成像目标上的不同的位置处形成至少两个斑点光；成像光学系统，所述成像光学系统用于通过适于阻挡第一波长的光束并透过第二波长 的光束的荧光过滤器在与扫描方向平行地布置的传感器阵列上形成所述斑点光的相应的 图像；和运算单元，所述运算单元用于基于通过第二波长的光束形成的图像的强度，通过计算 确定流路中的液体的温度。
7.一种扫描成像装置，包括斑点光投影系统，所述斑点光投影系统用于照射用于激发的第一斑点光和用于聚焦的 两个第二斑点光，所述用于激发的第一斑点光将被照射到检测目标上，所述检测目标被布置 于在基板中形成的流路中，所述用于聚焦的两个第二斑点光将分别在基板上的不同位置处被照射到流路上，以及所述斑点光投影系统用于至少沿流路扫描第一斑点光和第二斑点光；成像系统，所述成像系统用于使从被第一斑点光激发的检测目标发射的光、作为流路 的顶面处的反射的结果由第二斑点光中的一个产生的第一反射光、以及作为流路的底面处 的反射的结果由第二斑点光中的另一个产生的第二反射光成像；和焦点位置调整系统，所述焦点位置调整系统用于沿流路的深度方向调整第一斑点光和 第二斑点光的焦点位置，其中，所述焦点位置调整系统适于根据第一斑点光和第二斑点光的焦点位置沿流路的 深度方向的偏离方向和偏离量操作，所述偏离方向和偏离量是通过比较第一反射光的强度 和第二反射光的强度确定的。
8.根据权利要求7的装置，其中，所述斑点光投影系统具有扫描单元，所述扫描单元用于沿两个方向偏转第一斑 点光和第二斑点光，所述两个方向包括走向沿流路的第一方向和在与流路的顶面和底面平 行的面上与第一方向正交的第二方向，以及，其中，通过借助于所述扫描单元沿第二方向偏转第一斑点光和第二斑点光，调整焦点 位置。
9.根据权利要求7的装置，其中，所述焦点位置调整系统由驱动机构构成，所述驱动机构用于沿流路的深度方向 至少驱动斑点光投影系统和成像系统之中的斑点光投影系统。
10.根据权利要求7 9中的任一项的装置，
11.根据权利要求7 10中的任一项的装置，其中，第一斑点光具有第一波长，并且，第二斑点光具有与第一波长不同的第二波长， 并且，所述成像系统具有适于阻挡第一波长的光束、并且透过从检测目标发射的与第一波长 不同的波长的光束和第二波长的光束的过滤器。
12.根据权利要求7 11中的任一项的装置，其中，所述装置与控制单元连接，所述控制单元比较第一反射光的强度和第二反射光 的强度，以确定第一斑点光和第二斑点光的焦点位置沿流路的深度方向的偏离方向和偏离 量，并通过根据所述偏离方向和偏离量操作焦点位置调整系统来调整焦点位置。
13.根据权利要求12的装置，其中，所述控制单元适于基于第一反射光的强度和第二反射光的强度确定流路中的液 体的温度。
14.根据权利要求13的装置，其中，所述控制单元存储液体的温度和流路的顶面和底面处的光的反射率的相关关 系，以及，其中，所述控制单元从通过成像系统成像的第一反射光和第二反射光的平均强度相对 于从斑点光投影系统照射的第二斑点光的强度的比率确定反射率，然后根据所述相关关系 确定液体的温度。
全文摘要
扫描成像装置具有将用于激发的第一斑点光和用于焦点检测的两个第二斑点光照射到基板4的流路上的斑点光投影部101和用于拾取当被第一斑点光激发时从流路中的检测目标发射的光的图像的成像部102。第二斑点光中的一个在流路的顶面处被反射，并且，第二斑点光中的另一个在流路的底面处被反射，以及，焦点位置调整机构，用于沿流路的深度方向调整第一斑点光和第二斑点光中的每一个的焦点位置，使得通过比较在流路处反射的第二斑点光中的一个和另一个的强度来确定的流路的深度方向的第一斑点光和第二斑点光的焦点位置的偏离量。
文档编号G01N21/64GK101981437SQ20098011093
公开日2011年2月23日 申请日期2009年4月2日 优先权日2008年4月2日
发明者松本和浩 申请人:佳能株式会社