专利名称：微量黄体生成素检测方法
技术领域：
本发明涉及一种微量黄体生成素检测方法。
背景技术：
黄体生成素(LH)是垂体前叶细胞分泌的一种蛋白质激素。男性的黄体生成素刺 激睾丸细胞产生睾酮，女性的黄体生成素刺激排卵并维持黄体的存在。黄体分泌孕酮。目 前黄体生成素的检测主要是通过酶联免疫法、放射免疫法和化学发光法。这些方法都是直 接或间接的检测黄体生成素本身，但是由于实际样品中黄体生成素的浓度低，测定结果的 准确率也低。因此有必要建立一种更加敏感的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供另一种微量黄体生成素检测方法。以实现 能准确检测极低 浓度微量黄体生成素的目的。本发明的技术技术方案是通过受检者血清样品中的LH刺激睾丸间质细胞产生 睾酮刺激动物的睾丸间质细胞产生睾酮，通过测定睾酮反算出黄体生成素(LH)的水平， 从而达到准确检测极低浓度LH的目的。本发明的方法包括以下步骤
(一)无黄体生成素血清的制备
将硅橡胶管塞满雌二醇结晶，皮下植入豚鼠背部4-6周用以抑制动物黄体生成素的分 泌，收集50毫升血清，加入10-20mg的活性炭，在室温下吸附12小时，用滤纸过滤除去甾体 激素，滤液存于-30°C冰箱中保存；
(二)睾丸间质细胞的准备
取动物睾丸2个去包膜，将2个睾丸放于6. 2ml 199培养液中，再加入胶原酶III和分 离酶II，使培养液中胶原酶III的最终浓度为0. 28mg/ml ；分离酶II的最终浓度为0. 14 μ / ml ；在37°C孵育20分钟，所得悬浮液用等量培养液稀释，过滤后加入聚蔗糖，使其浓度为 13g/100mL，在离心力为1500g下离心10分钟，将含睾丸间质细胞的沉淀加入到3_4mL199 培养液中，再加入l_2mL磷酸盐缓冲液稀释，再进行重悬，然后，加入3-异丁甲基黄嘌 呤、牛血清蛋白和胎牛血清，加入量是3_异丁甲基黄嘌呤为0. 125mMol ；牛血清蛋白为 0. 5g/100mL ；胎牛血清为总体积的2% ；用台酚蓝排除法做活细胞计算；
(三)受检者血清样品中黄体生成素的分析
(A)血清样品中的黄体生成素刺激睾丸间质细胞产生睾酮
取100 μ 1上述睾丸间质细胞悬液加入受检者血清50 μ 1 ；或者50 μ 1磷酸盐缓冲液稀 释过的黄体生成素标准品(其中含有与受检者标本等量但无黄体生成素的血清)，在37°c， 用5% CO2和95%02孵育4小时后，加入1. 5ml含0. 01g/100mL硫柳汞明胶磷酸盐缓冲液以 终止反应；
(B)睾酮的检测将上述血清样品及标准品按照现有睾酮检测试剂盒或其它方法进行睾酮的检测并在标准曲线上，查出待测样本中睾酮的浓度； (四)黄体生成素浓度的推算
将睾酮的检测结果在黄体生成素标准曲线上反算，查出待测样本中黄体生成素浓度。本发明的优点通过采用受检者血清刺激动物的睾丸间质细胞产生睾酮，通过测定 睾酮反算出黄体生成素(LH)的水平，可以检测极低浓度LH ；其方法灵敏度大大提高；经实 验本发明的方法比现有睾丸细胞法比放免法敏感100倍，比化学发光法敏感1000倍。
具体实施例方式实施例本实验以豚鼠睾丸间质细胞生物检测法为例
(一)无LH血清的制备
将0. 25cm (内径0. 062英寸，外径0. 095英寸)的硅橡胶管塞满雌二醇结晶(西格玛公 司，圣路易斯，密苏里州，美国)，皮下植入豚鼠背部4-6周用以抑制动物LH的分泌；收集50 毫升血清，加入10-20mg的活性炭，在室温下吸附12小时，用滤纸过滤，除去甾体激素，滤液 存于-30°C冰箱中保存；
(二)豚鼠睾丸间质细胞的准备
取体重为550-700g的豚鼠睾丸2个，去包膜；在199培养液(西格玛公司，圣路易斯，密 苏里州，美国，6. 2ml/2个睾丸)加入胶原酶III和分离酶II，使培养液中胶原酶III的最终 浓度为0. 28mg/ml ；分离酶II的最终浓度为0. 14 μ/ml ；在37°C孵育20分钟，所得悬浮液 用等量培养液稀释，过滤后加入聚蔗糖，使其终浓度为13g/100mL，在离心力为1500g下离 心10分钟，将含睾丸间质细胞的沉淀加入到3-4mL199培养液中，再加入l_2mL磷酸盐缓 冲液稀释，再进行重悬，然后，加入3-异丁甲基黄嘌呤、牛血清蛋白和胎牛血清。其终浓 度分别是3_异丁甲基黄嘌呤为0. 125mMol ；牛血清蛋白为0. 5g/100mL ；胎牛血清为总体 积的2% ；用台酚蓝排除法做活细胞计算；
(三)血清样品LH分析
A,血清样品中的LH刺激睾丸间质细胞产生睾酮
(A)血清样品中的黄体生成素刺激睾丸间质细胞产生睾酮
取100 μ 1上述睾丸间质细胞悬液加受检者血清50 μ 1 ；或者50 μ 1磷酸盐缓冲液稀释 过的黄体生成素标准品(其中含有与受检者标本等量但无黄体生成素的血清)，在37°C，用 5% CO2和95%02孵育4小时后，加入1. 5ml含0. 01g/100mL硫柳汞明胶磷酸盐缓冲液以终
止反应。(B)睾酮的检测
本实施例是以西域 公司睾酮检测试剂盒进行检测。按说明书操作，方法如下 1)准备
(1).测试前将试剂盒组分置于室温(18-25°c)平衡30分钟，测试后立即放回2-8°C保
存；
(2).如果洗液尚未溶解，溶于500ml蒸馏水中。2)反应
(1).取出所需要的板条；
(2).分别向孔中加入100μ1标准品、质控血清或标本；(3).每孔中加入25μ 1酶结合物。震动10-20秒混勻；
(4).37°C孵育60分钟；
(5).扣除孔中液体，并用洗液洗涤5次；
(6).在干净的纸巾或毛巾上拍干，尽量去除残留的水分。3)显色
(1).每孔各加入1滴显色底物A和B，置于室温(18-25°c)避光显色15分钟；
(2).每孔加入1滴终止液，轻轻震动几次混勻；
(3).在30分钟内，以630nm作为参考波长，测量450nm处的吸光度(A450)。4)计算
(1)分别计算出各标准品、质控及病人标本的Β/Β0%； B=标准品、标本OD值
BO=标准品” 0”点OD值
(2)标准品浓度(ng/ml)为横坐标，Β/Β0%为纵坐标，在对数坐标纸上绘制标准曲线；
(3)在睾酮标准曲线上查出待测标本浓度；
(4)每次实验均需带标准品，计算结果时按本次实验的标准曲线反算。(四)LH浓度的推算
将上述结果在LH标准曲线上反算，查出待测标本LH浓度。结果评价
将LH标准品(西格玛公司，圣路易斯，密苏里州，美国)从0. lng/ml进行系列稀释为 0. 0lng/ml,0. 001ng/ml、0. 0001ng/ml、0. 00001ng/ml、0. 000001ng/ml，然后分别用放免法、
化学发光法以及睾丸细胞法进行检测。每一稀释浓度进行三次检测。实验重复5次。结果 列于表1
权利要求
一种微量黄体生成素检测方法，其特征在于，包括以下步骤(一) 无黄体生成素血清的制备将硅橡胶管塞满雌二醇结晶，皮下植入豚鼠背部4 6周用以抑制动物黄体生成素的分泌，收集50毫升血清，加入10 20mg的活性炭，在室温下吸附12小时，用滤纸过滤除去甾体激素，滤液存于 30℃冰箱中保存；(二)睾丸间质细胞的准备取动物睾丸2个去包膜，将2个睾丸放于6.2ml 199培养液中，再加入胶原酶III和分离酶II，使培养液中胶原酶III的最终浓度为0.28mg/ml；分离酶II的最终浓度为0.14μ/ml；在37℃孵育20分钟，所得悬浮液用等量培养液稀释，过滤后加入聚蔗糖，使其浓度为13g/100mL，离心分离；将含睾丸间质细胞的沉淀加入到3 4mL199培养液中,再加入1 2mL磷酸盐缓冲液稀释,再进行重悬；然后，加入3 异丁甲基黄嘌呤、牛血清蛋白和胎牛血清，加入量是3 异丁甲基黄嘌呤为0.125mMol；牛血清蛋白为0.5g/100mL；胎牛血清为总体积的2%；用台酚蓝排除法做活细胞计算；(三)受检者血清样品中黄体生成素的分析(A)血清样品中的黄体生成素刺激睾丸间质细胞产生睾酮取100μl上述睾丸间质细胞悬液加入受检者血清50μl；或者50μl磷酸盐缓冲液稀释过的黄体生成素标准品(其中含有与受检者标本等量但无黄体生成素的血清)，在37℃，用5% CO2 和95%O2孵育4小时后，加入1.5ml含0.01g/100mL硫柳汞明胶磷酸盐缓冲液以终止反应；(B)睾酮的检测将上述血清样品及标准品按照现有睾酮检测试剂盒或其它方法进行睾酮的检测并在标准曲线上，查出待测样本中睾酮的浓度；(四)黄体生成素浓度的推算将睾酮的检测结果在黄体生成素标准曲线上反算，查出待测样本中黄体生成素浓度。
全文摘要
本发明公开了一种微量黄体生成素检测方法。包括(1)无黄体生成素血清的制备(2)睾丸间质细胞的准备(3)受检者血清样品中黄体生成素的分析(4)将睾酮的检测结果在黄体生成素标准曲线上反算，查出待测样本中黄体生成素浓度。可以检测极低浓度LH；本发明的方法灵敏度大大提高；比现有睾丸细胞法比放免法敏感100倍，比化学发光法敏感1000倍。
文档编号G01N33/74GK101937003SQ20101028098
公开日2011年1月5日 申请日期2010年9月14日 优先权日2010年9月14日
发明者田韵, 高常青, 高永晴 申请人:高常青;高永晴;田韵