专利名称：一种基于纳米技术的微量蛋白质检测方法
技术领域：
一种基于纳米技术的微量蛋白质检测方法，属于分析生物化学技术领域。
背景技术：
测量微量的蛋白质在疾病诊断和生物医学研究中是必不可少的。但目前所用的测 定方法有灵敏度和线性范围差的缺点。例如，前列腺特异性抗原(PSA)是一种由hKLK3基 因编码的，由前列腺上皮细胞分泌的单链糖蛋白，具有糜蛋白酶活性，分子量大约34000g/ mol。PSA作为生物标志物，被广泛应用于疾病的筛选、诊断及治疗后的监测。但在人体血清 中PSA的含量极低。因此，对检测方法的检测限和灵敏度提出了较高的要求。免疫酶联吸附实验是目前广泛应用于临床检测的免疫分析方法，具有很高的特异 性。免疫酶联吸附实验的工作原理基于抗原或抗体的固定以及抗原或抗体的酶标记。将抗 原或抗体吸附于固相载体表面，结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性； 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，这种酶标记的抗原或抗体既保留其免疫 学活性，又保留酶的活性。由酶的催化效率很高，间接放大了免疫反应的结果，使测定方法 达到很高的灵敏度。目前，常用辣根过氧化物酶标记抗体，辣根过氧化物酶不仅能催化化学发光，而且 能在一定条件下，催化biotin-tyramide生成大量的biotin活化分子结合到抗原抗体结合 部位附近的蛋白质的氨基酸残基上，产生大量的biotin沉积。该技术被称为酪胺信号放 大。如果利用biotin标记的DNA修饰的金纳米颗粒与链酶亲和素修饰的金纳米颗粒发生 的聚集现象应用于该实验，可实现对信号的进一步放大。本方法通过免疫酶联吸附实验实现检测方法的特异性，通过酪胺信号放大技术及 金纳米颗粒聚集现象实现信号的放大，在蛋白质测定中达到了极低检测限、高灵敏度和较 宽检测范围的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于免疫酶联吸附技术，酪胺信号放大技术及金纳米颗 粒聚集现象检测微量PSA等蛋白质，这种方法具有较宽的线性范围、极低的检测限以及较 高的精密度。本发明的技术方案一种基于免疫酶联吸附技术，酪胺信号放大技术及金纳米颗 粒聚集现象检测微量PSA或其它蛋白质的方法，其特征是步骤为(1)在固相上利用双抗体 夹心法捕捉待测蛋白质；(2)利用酪胺信号放大技术在抗原抗体结合部位产生大量生物素 沉积；(3)金纳米颗粒在生物素沉积部位相互聚集及银染实验；(4)扫描及数据分析。(1)在固相上利用双抗体夹心法捕捉蛋白质利用免疫酶联吸附方法捕捉PSA等 蛋白质并使之结合上有辣根过氧化物酶活性的抗体；例如，将PSA单克隆抗体稀释成一定浓度的溶液，各取1 μ L点于环氧基基片上，置 于温箱中，37°C抽真空过夜后，将基片取出，在反应池中加入10%的BSA溶液封闭，室温封闭5h后，用PBST溶液清洗。然后在基片上粘贴围栏，用兔血清稀释PSA标准品，将其浓度 依次稀释为 5fg/ μ L，2. 5fg/ μ L，125ag/ μ L，6. 25ag/ μ L 和 330. 5zg/ μ L，各取 20 μ L 将一 系列浓度的PBS溶解的PSA标准品加入到围栏内，于4°C孵育过夜。孵育过夜后，将基片取 出，用PBST溶液清洗，之后，加入PBS稀释的PSA另一种具有辣根过氧化物酶活性的单克隆 抗体，孵育一段时间后，用PBST溶液清洗。 (2)利用酪胺信号放大技术在抗原抗体结合部位产生大量生物素沉积加入 biotin-tyramide溶液，在抗原抗体结合部位产生大量生物素沉积；
在基片上加入biotin-tyramide溶液，对照组不加入biotin-tyramide溶液，反应 一段时间后用PBST溶液清洗。(3)金纳米颗粒在生物素沉积部位相互聚集及银染实验不同生物分子修饰的金 纳米颗粒在生物素沉积部位相互聚集并使用银染方法进一步放大信号；利用巯基与金纳米颗粒的相互作用，将biotin标记的DNA修饰到金纳米颗粒表 面，利用蛋白质与金纳米颗粒的静电吸附作用将链霉亲和素修饰到金纳米颗粒表面，从而 制备出两种不同生物分子修饰的金纳米颗粒。在放置有基片的反应池中加入一定量的链 霉亲和素修饰的金纳米颗粒(SA-AuNP)，孵育一段时间。PBST清洗后，再向反应池中加入一 定量的biotin标记的DNA修饰的金纳米颗粒(biotin-DNA-AuNP)，孵育一段时间。之后用 PBST清洗，重复上述金纳米颗粒孵育过程，孵育结束后对基片进行银染。将银染试剂A液 和B液混合，加入到放置有基片的反应槽中，浸泡一段时间，取出，清洗后，加入一定浓度的 硫代硫酸钠溶液，浸泡2min，清洗后，烘干。(4)扫描及数据分析；将芯片烘干后，置于扫描仪上扫描，图像结果使用ImageJ分析其灰度值，然后用 Origin软件进行数据分析。
图1金纳米颗粒的电子显微镜照片。图2金纳米颗粒的紫外可见吸光光谱图。图3AuNP，biotin-DNA-AuNP及SA-AuNP的紫外可见吸光光谱图。图4基片反相图片。图5基片上抗原质量与灰度值之间的线性关系标准曲线。
具体实施例方式其特征是步骤为(1)在固相上利用双抗体夹心法捕捉PSA或其它待测蛋白质样 品；(2)利用酪胺信号放大技术在抗原抗体结合部位产生大量生物素沉积；(3)金纳米颗粒 在生物素沉积部位相互聚集及银染实验；(4)扫描及数据分析。(1)在固相上利用双抗体夹心法捕捉PSA或其它待测蛋白质样品利用免疫酶联 吸附方法捕捉PSA并使之结合上有辣根过氧化物酶活性的抗体；将PSA单克隆抗体稀释成一定浓度的溶液，各取1 μ L点于环氧基基片上，置于温 箱中，37°C抽真空过夜后，将基片取出，在反应池中加入10%的BSA溶液封闭，室温封闭5h 后，用PBST溶液清洗。然后在基片上粘贴围栏，用兔血清稀释PSA标准品，将其浓度依次稀释为 5fg/ μ L，2. 5fg/ μ L，125ag/ μ L，6. 25ag/ μ L 和 330. 5zg/ μ L，各取 20 μ L 将一系列浓 度的PBS溶解的PSA标准品加入到围栏内，于4°C孵育过夜。孵育过夜后，将基片取出，用 PBST溶液清洗，之后，加入PBS稀释的PSA另一种具有辣根过氧化物酶活性的单克隆抗体， 孵育一段时间后，用PBST溶液清洗。(2)利用酪胺信号放大技术在抗原抗体结合部位产生大量生物素沉积加入 biotin-tyramide溶液，在抗原抗体结合部位产生大量生物素沉积；在基片上加入biotin-tyramide溶液，对照组不加入biotin-tyramide溶液，反应 一段时间后用PBST溶液清洗。(3)金纳米颗粒在生物素沉积部位相互聚集及银染实验不同生物分子修饰的金 纳米颗粒在生物素沉积部位相互聚集并使用银染方法进一步放大信号；利用巯基与金纳米颗粒的相互作用，将biotin标记的DNA修饰到金纳米颗粒表 面，利用蛋白质与金纳米颗粒的静电吸附作用将链霉亲和素修饰到金纳米颗粒表面，从而 制备出两种不同生物分子修饰的金纳米颗粒。在放置有基片的反应池中加入一定量的链 霉亲和素修饰的金纳米颗粒(SA-AuNP)，孵育一段时间。PBST清洗后，再向反应池中加入一 定量的biotin标记的DNA修饰的金纳米颗粒(biotin-DNA-AuNP)，孵育一段时间。之后用 PBST清洗，重复上述金纳米颗粒孵育过程，孵育结束后对基片进行银染。将银染试剂A液 和B液混合，加入到放置有基片的反应槽中，浸泡一段时间，取出，清洗后，加入一定浓度的 硫代硫酸钠溶液，浸泡2min，清洗后，烘干。(4)扫描及数据分析；将芯片烘干后，置于扫描仪上扫描，图像结果使用ImageJ分析其灰度值，然后用 Origin软件进行数据分析。
权利要求
一种基于纳米技术的微量蛋白质检测方法一种基于纳米技术的微量蛋白质检测方法，其特征是步骤为(1)在固相上利用双抗体夹心法捕捉待测蛋白质；(2)利用酪胺信号放大技术在抗原抗体结合部位产生大量生物素沉积；(3)金纳米颗粒在生物素沉积部位相互聚集及银染实验；(4)扫描及数据分析。(1)在固相上利用双抗体夹心法捕捉PSA或其它目标蛋白质利用免疫酶联吸附方法捕捉PSA等蛋白质并使之结合上有辣根过氧化物酶活性的抗体；例如，将PSA单克隆抗体稀释成一定浓度的溶液，各取1μL点于环氧基基片上，置于温箱中，37℃抽真空过夜后，将基片取出，在反应池中加入10％的BSA溶液封闭，室温封闭5h后，用PBST溶液清洗。然后在基片上粘贴围栏，用兔血清稀释PSA标准品，将其浓度依次稀释为5fg/μL，2.5fg/μL，125ag/μL，6.25ag/μL和330.5zg/μL，各取20μL将一系列浓度的PBS溶解的PSA标准品加入到围栏内，于4℃孵育过夜。孵育过夜后，将基片取出，用PBST溶液清洗，之后，加入PBS稀释的PSA另一种具有辣根过氧化物酶活性的单克隆抗体，孵育一段时间后，用PBST溶液清洗。(2)利用酪胺信号放大技术在抗原抗体结合部位产生大量生物素沉积加入biotin tyramide溶液，在抗原抗体结合部位产生大量生物素沉积；在基片上加入biotin tyramide溶液，对照组不加入biotin tyramide溶液，反应一段时间后用PBST溶液清洗。(3)金纳米颗粒在生物素沉积部位相互聚集及银染实验不同生物分子修饰的金纳米颗粒在生物素沉积部位相互聚集并使用银染方法进一步放大信号；利用巯基与金纳米颗粒的相互作用，将biotin标记的DNA修饰到金纳米颗粒表面，利用蛋白质与金纳米颗粒的静电吸附作用将链霉亲和素修饰到金纳米颗粒表面，从而制备出两种不同生物分子修饰的金纳米颗粒。在放置有基片的反应池中加入一定量的链霉亲和素修饰的金纳米颗粒(SA AuNP)，孵育一段时间。PBST清洗后，再向反应池中加入一定量的biotin标记的DNA修饰的金纳米颗粒(biotin DNA AuNP)，孵育一段时间。之后用PBST清洗，重复上述金纳米颗粒孵育过程，孵育结束后对基片进行银染。将银染试剂A液和B液混合，加入到放置有基片的反应槽中，浸泡一段时间，取出，清洗后，加入一定浓度的硫代硫酸钠溶液，浸泡2min，清洗后，烘干。(4)扫描及数据分析；将芯片烘干后，置于扫描仪上扫描，图像结果使用ImageJ分析其灰度值，然后用Origin软件进行数据分析。
全文摘要
一种基于纳米技术的微量蛋白质检测方法将免疫酶联吸附技术、酪胺信号放大技术以及修饰有不同生物分子的金纳米颗粒发生聚集现象三者结合起来，建立了一种用于检测微量前列腺特异性抗原(PSA)等蛋白质的实验方法。本方法将针对待测蛋白质(如PSA)的一种抗体固定于基片表面，捕捉样品中的待测蛋白质后，孵育待测蛋白质(如PSA)的另一种带有辣根过氧化物酶(HRP)活性的抗体。HRP在一定条件下，催化biotin-tyramide产生生物素沉积。利用生物素标记的DNA修饰的金纳米颗粒与链酶亲和素修饰的金纳米颗粒发生聚集的现象，进一步放大信号，再经过银染。最后，使用软件对实验结果进行数据分析。该方法具有极低的检测限和较宽的检测范围，能够在成分复杂的兔血清中实现对抗原的检测，具有重要的应用前景。
文档编号G01N33/577GK101943703SQ201010210949
公开日2011年1月12日 申请日期2010年6月28日 优先权日2010年6月28日
发明者张玉祥, 沈海滢 申请人:首都医科大学