专利名称：软骨藻酸的酶联免疫试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物检测技术领域的检测试剂盒及其检测方法，具体是一种 贝类样品中软骨藻酸的酶联免疫试剂盒及其检测方法。
背景技术：
软骨藻酸(Domoic Acid, DA)是赤潮毒素的一种，由于其中毒后的特征症状为丧 失记忆，所以又称失去记忆性贝毒。DA最早是从一种大型红藻——树枝软骨藻分离所得。 分子式为C15H21NO6，分子量为311. 34，纯品为白色固体粉末，熔点为223 224°C，可溶于水 (8mg/mL)，微溶于甲醇(0. 6mg/mL)，在紫外光谱区的最大吸收波长为242nm。DA主要由海洋 硅藻产生，通过食物链被海洋生物所富集，不仅具有相当的生态风险，更是威胁到了人类健 康。有研究表明海狮食用被DA污染的鱼类会出现早产、流产等生殖障碍。也有研究表明在 低剂量DA的暴露下，仔鼠的学习及记忆能力产生了永久性损伤。1987年在加拿大爱德华王 子岛发生食用被DA污染的紫贻贝的集体中毒事件引起了人们的普遍关注，中毒者产生呕 吐、腹泻，部分人员出现了记忆混乱、记忆丧失、方向辨别障碍，甚至死亡。因此各国相继制 定了 20μ g/g贝肉的水产品标准。我国目前并未有相关的检测标准。目前为止对于DA的分析已经建立了多种方法，用于常规检测的主要是小白鼠生 物检测法、高效液相色谱(HPLC)检测法及免疫检测法。小白鼠生物法由于检测限达不到要 求，正在被逐步淘汰，但由于其操作方法简单，设备要求低仍被一些国家所使用，而高效液 相色谱法以其低检测限，高灵敏度受到各国的青睐，已成为不少国家的标准方法。但是高效 液相色谱法对仪器及技术人员的要求高，并且不适用于大量样品的检测。而免疫学方法，正 好结合了上述两种方法的优点，仪器操作简单、检测限较低，适用于基层部门的常规检测。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种软骨藻酸的酶联免疫试剂盒及 其检测方法，使得本发明满足对样品的前处理要求低，还可以减少试剂盒的操作步骤；对仪 器设备要求低、试剂保存时间长、自动化程度高、无污染等优点。本发明涉及一种软骨藻酸的酶联免疫试剂盒，包括包含软骨藻酸特异性抗体、包 被了软骨藻酸抗原的酶标板、酶标二抗、软骨藻酸标准溶液、包被缓冲液、封闭液、洗涤液、 抗体稀释液、显色剂与终止液；所述的酶标板采用96或40孔酶标板，包被有能与抗软骨藻酸抗体特异结合的软 骨藻酸抗原，并封闭微孔表面未吸附软骨藻酸抗原的位点。所述软骨藻酸特异性抗体为兔抗软骨藻酸多克隆抗体。所述软骨藻酸抗原是采用碳二亚胺法、活泼酯法或混合酸酐法将软骨藻酸小分子 半抗原与载体蛋白进行偶联得到。所述酶标记二抗是辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体。所述包被缓冲液为0. 05-0. lmol/L, pH9. 6的碳酸盐缓冲液。
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所述封闭液为1-3%的聚乙烯醇溶液。所述洗涤液为含0. 05-5%吐温-20的磷酸盐缓冲液。所述抗体稀释液为含4-10%的聚乙二醇溶液。所述显色液为由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化氢，显色剂B为四甲
基联苯胺。所述终止液为l-5mol/L的硫酸溶液。本发明涉及上述试剂盒用于贝类样品中软骨藻酸的检测方法，包括以下步骤①样品前处理②用上述试剂盒对样品进行检测，向包被有软骨藻酸抗原的酶标板孔中加入标准 品或样品溶液和抗体稀释液；③温育后洗涤拍干，再加入酶标二抗；④进一步温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；⑤分析检测结果。本发明试剂盒的检测原理为将软骨藻酸包被抗原吸附于固相载体上，加入系列标 准品或样品溶液和软骨藻酸特异性多克隆抗体稀释液，待测样品中的软骨藻酸和预包被的 抗原竞争结合特异性抗体，加入酶标二抗进行酶活性放大作用，显色后终止。样品吸光度值 与其残留物软骨藻酸的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样品中软骨藻酸的浓度范 围。本发明的检测软骨藻酸的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或 定量检测贝类样品中软骨藻酸的含量；对样品的前处理要求低。采用高特异性的软骨藻酸 多克隆抗体，主要试剂以工作液的形式提供，可以减少试剂盒的操作步骤，为使用者节省时 间并降低因操作步骤冗繁而造成的误差，本发明具有特异性高、灵敏度高、精确度高和准确 度高等特点，对仪器设备要求低、试剂保存时间长、自动化程度高、无污染等优点，适用于大 批量样品筛选的定性、定量检测，可在贝类食品的快速检测中发挥重要作用。
图1软骨藻酸标准曲线。
具体实施例方式以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前 提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的 条件。实施例1试剂盒组分的制备1. 1软骨藻酸人工抗原的合成取Img软骨藻酸(DA)溶于少量溶剂(二甲基亚砜水=1 9)中，加入0. 8mg N-羟基琥珀酰亚胺(20mg/mL，临用现配)、1.2mg水溶性碳二亚胺(10mg/mL，临用现配)及 少量0. lmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7. 0)，混合均勻后置于25°C培养箱内反应2h。随后转移
4至4°C冰箱内，放置过夜。第二天加入2mg钥孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)，补 加少量0. lmol/L磷酸盐缓冲液，混合均勻后置于25°C培养箱内反应3h。将混合液置入超 滤管内管，4500rpm离心15min后，适量稀释，分装后保存于_20°C。1. 2软骨藻酸特异性多克隆抗体的制备将上述软骨藻酸-KLH偶联物用生理盐水稀释成lmg/ml溶液备用。选用4只体重1.8_2kg健康雌性新西兰大白兔。将偶联物与等量弗氏完全佐剂 通过注射器混合成油包水的乳浊液，按lmg/kg体重的量首次免疫，采取颈背部皮下多点注 射。每隔两周加强免疫一次，用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，剂量及方法同首次免 疫。从第三次免疫开始，每次免疫后7天，耳缘静脉取血1ml，进行抗体效价检测，当抗体效 价不再升高时，不加佐剂进行最后一次(第9次)免疫，7天后心脏放血，室温静置30min 后，37°C温育lh，使血液凝固，后4°C过夜，4000r/min离心15分钟，除去血块，血清部分辛 酸-硫酸铵法进行纯化透析，即得多克隆抗体，分装后，冰冻保存。1. 3酶标板的准备用包被缓冲液(0. 05-0. lmol/L, pH9. 6的碳酸盐缓冲液)将软骨藻酸和牛血清白 蛋白(BSA)的偶联物DA-BSA稀释成lug/ml，96孔板每孔包被100μ 1，4°C过夜。倒出孔内液 体，用洗涤液振荡洗涤3次，每次3min，拍干。每孔加200μ1封闭液(1%聚乙烯醇溶液)， 37°C封闭2h。倒出孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。实施例2检测软骨藻酸酶联免疫试剂盒的组建组建检测软骨藻酸的酶联免疫试剂盒，使其包含下列组分(1)包被了软骨藻酸与牛血清白蛋白(BSA)偶联物的酶标板；(2)浓度为8. 4ug/L的软骨藻酸特异性多克隆抗体工作液；(3)辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体； (4)软骨藻酸标准品溶液，浓度分别为Ong/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、 100ng/mL、500ng/mL、1 μ g/mL、10 μ g/mL ；(5)包被缓冲液为0. 05mol/L, pH9. 6的碳酸盐缓冲液；(6)封闭液为的聚乙烯醇溶液；(7)洗涤液为含0. 05 %吐温-20的磷酸盐缓冲液；(8)抗体稀释液为含4%的聚乙二醇溶液；(9)底物显色液由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化氢，显色剂B为四
甲基联苯胺；(10)反应终止液为lmol/L的硫酸溶液。实施例3贝类样品中软骨藻酸的检测3. 1样品前处理取生鲜带壳或冷冻后在室温下半解冻的样品，用刀切开闭壳肌取出贝肉，将可食 部分与中肠腺分离，放在网孔细小的金属网上浙水5min。取5g样品，加入IOmL勻浆液 (50%甲醇水溶液)，勻浆后，漩涡振荡lmin，超声提取5min ；4000rpm离心20min。移出上 清液至25mL容量瓶，剩余残渣再加入勻浆液5mL，重复提取两次，上清液均移至25mL容量瓶 内，蒸馏水定容。0. 22 μ m滤膜过滤。
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3. 2用试剂盒进行检测向软骨藻酸半抗原与卵血清蛋白(BSA)偶联物包被的酶标板微孔中加入50 μ 1用 4%聚乙二醇的抗体稀释液稀释的多克隆抗体，同时，每孔再加入待测样品50 μ 1，每块板同 时做标线，37°C温育lh。洗涤3次，用吸水纸拍干。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗 工作液100μ 1，37°C温育lh，洗涤5次，拍干。每孔加新鲜配制的底物显色液100 μ 1，显色 IOmin后每孔加终止液50 μ 1。轻轻震荡混勻，用酶标仪测定每孔的吸光度值。3. 3结果分析计算百分吸光度值，绘制标准曲线；所获得的每个浓度标准溶液或样品吸光度值的平均值(A)除以第一个标准(0标 准)的吸光度值(A0)再乘以100%，即抑制率。抑制率(%) = (Α/Α0Χ 100% )公式中A为标准溶液或者样本溶液的平均吸光度值，A0为Ong/mL标准溶液的平 均吸光度值。以软骨藻酸标准系列浓度的对数作为横坐标、以抑制率为纵坐标，绘制标准曲 线，校正曲线在0. 01 10 μ g/mL有良好的线性，相对应每一个样品中软骨藻酸的浓度可以 从标准曲线上读出。实施例4试剂盒灵敏度测定利用软骨藻酸标准品溶液进行反应，根据实验结果绘制标准曲线(图1)，由图1可 得直线方程为Y = 109. 40-15. 45X，抑制率(Α/Α0)与软骨藻酸的对数值在浓度为0. 01 10 μ g/mL范围内呈显著的线性关系，相关系数为R2 = 0. 9682，以抑制率为90%时的浓度作 为最低检测限，可得最低检测限约为18ng/mL。实施例5回收率实验取3个浓度的软骨藻酸标样，添加到样品中，每个浓度设6个重复，进行测定。试剂盒回收率的结果如下，红心贝为95. 2 101. 3%，扇贝为49. 6 84. 7%，文 蛤为47. 2 65%实施例5试剂盒保存期实验试剂盒保存条件为2_8°C，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零添加)、 50%抑制浓度、软骨藻酸添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会 有非正常保存条件出现，将试剂盒在37°C保存条件下放置两周，进行加速老化实验，结果表 明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20°C冰 箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在 2-8°C保存12个月以上。
权利要求
一种检测贝类样品中软骨藻酸的酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括包含软骨藻酸特异性抗体、包被了软骨藻酸抗原的酶标板、酶标二抗、软骨藻酸标准溶液、包被缓冲液、封闭液、洗涤液、抗体稀释液、显色剂与终止液；所述酶标板采用96或40孔酶标板，包被有能与抗软骨藻酸抗体特异结合的软骨藻酸抗原，并封闭微孔表面未吸附软骨藻酸抗原的位点。
2.根据权利要求1所述的检测软骨藻酸的酶联免疫试剂盒，其特征是，所述软骨藻酸 特异性抗体为兔抗软骨藻酸多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的检测软骨藻酸的酶联免疫试剂盒，其特征是，所述软骨藻酸 抗原是采用碳二亚胺法、活泼酯法或混合酸酐法将软骨藻酸小分子半抗原与载体蛋白进行 偶联得到。
4.根据权利要求1所述的检测软骨藻酸的酶联免疫试剂盒，其特征是，所述酶标记二 抗是辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体。
5.根据权利要求1所述的检测软骨藻酸的酶联免疫试剂盒，其特征是，所述包被缓冲 液为0. 05-0. lmol/L, ρΗ9· 6的碳酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的检测软骨藻酸的酶联免疫试剂盒，其特征是，所述封闭液为 1-3%的聚乙烯醇溶液。
7.根据权利要求1所述的检测软骨藻酸的酶联免疫试剂盒，其特征是，所述洗涤液为 含0. 05-5%吐温-20的磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求1所述的检测软骨藻酸的酶联免疫试剂盒，其特征是，所述抗体稀释 液为含4-10%的聚乙二醇溶液。
9.根据权利要求1所述的检测软骨藻酸的酶联免疫试剂盒，其特征是，所述显色液为 由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化氢，显色剂B为四甲基联苯胺。
10.一种根据权利要求1所述的试剂盒检测贝类样品中软骨藻酸的方法，其特征在于， 包括以下步骤①样品前处理；②用上述试剂盒对样品进行检测，向包被有软骨藻酸抗原的酶标板孔中加入标准品或 样品溶液和抗体稀释液；③温育后洗涤拍干，再加入酶标二抗；④进一步温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；⑤分析检测结果。
全文摘要
一种生物检测技术领域的检测软骨藻酸的酶联免疫试剂盒。试剂盒包括包含软骨藻酸特异性抗体、包被了软骨藻酸抗原的酶标板、酶标二抗、软骨藻酸标准溶液、包被缓冲液、封闭液、洗涤液、抗体稀释液、显色剂与终止液；检测方法为用试剂盒对经过前处理的样品进行检测；向包被有软骨藻酸抗原的酶标板孔中加入标准品或样品溶液和抗体稀释液；温育后洗涤拍干，再加入酶标二抗；进一步温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；分析检测结果。本发明具有特异性高、灵敏度高、精确度高和准确度高等特点，对仪器设备要求低、试剂保存时间长、自动化程度高、无污染等优点。
文档编号G01N33/543GK101949923SQ20101028345
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月16日 优先权日2010年9月16日
发明者刘元嫄, 程金平, 高利利 申请人:上海交通大学