检测t-2毒素的酶联免疫试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测T-2毒素的酶联免疫试剂盒，它含有：包被有T-2毒素偶联抗原的酶标板，T-2毒素标准品溶液，浓缩酶结合物，酶结合物工作液，底物显色液，终止液。本发明还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测样本中T-2毒素的方法，它包括：首先进行样本前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于检测饲料（原料、配合料和浓缩料）样本中T-2毒素的残留量，其操作简便、成本低、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。
【专利说明】检测T-2毒素的酶联免疫试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测T-2毒素的酶联免疫试剂盒，其适用于饲料(原料、配合料、浓缩料)中T-2毒素测定。
技术背景
[0002]T-2毒素(T-2 toxin)是镰刀菌所产生的单端孢霉烯族毒素中毒性最强的一种，能导致动物产生中毒反应的次级代谢物质，它广泛分布于自然界，常在被污染的田间作物和库存谷物中发现。无论饲料中T-2毒素的含量是高水平还是低水平均会导致动物采食量下降、增重缓慢、免疫系统损伤等。研究表明，T-2毒素对人和动物表现出基因毒性、免疫毒性、血液毒性等多种毒性，并可致多种细胞凋亡。1973年联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)在日内瓦召开的联席会议上，把T-2毒素同黄曲霉毒素一样作为自然存在的最危险的食品污染源。
[0003]T-2毒素的测定方法主要有薄层色谱法(TCL)、气相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、放射性免疫检测法、酶联免疫法等，TLC法是最早最常用的检测方法之一，具有操作简单、费用低廉、分离效果好、分离速度快等优点，是一种常见的检测方法，但是还存在样品提纯繁琐、定量不够精确、成本较高等缺点，而且同时TLC法涉及到一个可视化颜色定量的问题，还是不如气相色谱和液相色谱方便、准确。气相色谱和液相色谱分析方法需要对T-2毒素进行衍生化处理；液相色谱-质谱联用灵敏度较高，不需要进行衍生化处理，因而液相色谱-质谱联用是检测T-2毒素比较理想的方法。目前报道比较多的方法为单极质谱选择离子技术(SIM)。然而，对于复杂基质样品(如谷物)，采用多级串联质谱技术可以更为有效地去除基质的干扰，保证痕量物质分析的准确性。TCL法、色谱法等有的太复杂，有的缺乏灵敏度，有的价格昂贵，不适于常规毒素分析。免疫学检测因其灵敏、快速、简单，而被用于T-2毒素的测定。应用于T-2毒素测定的免疫学方法主要有放射免疫法、酶联免疫吸附法及免疫荧光法等。由于放射性同位素储存、使用不便，近年来非放射性标记应用较多。酶联免疫吸附法(ELISA)以其灵敏度高、特异性好、操作简便、成本低等优点已被我国于1992年定为检测标准，ELISA法作为一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大量样品的快速筛选。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种用于T-2毒素含量测定的酶联免疫试剂盒，其操作简单，适合现场大批量样品的筛选。
[0005]本发明试剂盒，它包括:
[0006]( I)包被有T-2毒素偶联抗原的酶标板；
[0007](2) T-2毒素标准品溶液；
[0008](3)浓缩酶结合物；
[0009](4)酶结合物稀释液；[0010](5)底物显色液；
[0011](6)终止液。
[0012]所述T-2毒素偶联抗原为T-2毒素半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白可为卵清蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白。
[0013]所述T-2毒素半抗原的结构如下:
[0014]
【权利要求】
1.一种检测T-2毒素的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于包括有: (1)包被有T-2毒素偶联抗原的酶标板； (2)T-2毒素标准品溶液； (3)浓缩酶结合物； (4)酶结合物稀释液； (5)底物显色液； (6)终止液。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述T-2毒素偶联抗原是由T-2毒素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述T-2毒素半抗原结构如下:
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述T-2毒素半抗原的制备方法主要包括如下步骤: 24mg T-2毒素、30mg邻苯二甲酸酐和0.1ml吡啶在2ml DMSO中的混合液，在80°C下搅拌反应15小时，蒸除溶剂，柱层析纯化得到邻苯二甲酸单T-2毒素酯。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的浓缩酶结合物为酶标记的T-2毒素单克隆抗体。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述浓缩酶结合物的标记酶为辣根过氧化物酶；酶结合物是采用过碘酸钠法将标记酶与抗体偶联得到。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述的终止液为f2mol/L的硫酸或盐酸溶液，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，底物液A液为过氧化脲溶液，底物液B液为四甲基联苯胺溶液。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所用包被缓冲液为ρΗ9.(T9.6,0.2mol/L碳酸盐缓冲液，所用封闭液为PH7.2~?.4,0.lmol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。
8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的酶结合物稀释液为PH7.1~?.4，含0.05%~0.1%牛血清白蛋白，0.lmol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。
9.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述T-2毒素标准品溶液浓度分别为O μ g/L、I μ g/L、3 μ g/L、9 μ g/L、27 μ g/L、81 μ g/L。
10.一种检测样品中T-2毒素含量的方法，主要步骤包括:1)将待测样品进行前处理；2)用权利要求1-9任一项所述的酶联免疫试剂盒进行检测；3)分析检测 结果。
【文档编号】G01N33/577GK103575885SQ201210250807
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年7月19日 优先权日:2012年7月19日
【发明者】何方洋, 万宇平, 罗晓琴, 冯静, 郝士元, 齐向武, 聂雯莹, 马腊腊 申请人:北京勤邦生物技术有限公司