专利名称：纳米氧化铜模拟酶及其作为过氧化物模拟酶测定过氧化氢的方法
技术领域：
本发明涉及纳米氧化铜及其作为过氧化物模拟酶测定过氧化氢的方法，属于分 析化学技术领域。
背景技术：
酶是高效的生物催化剂，生物体内几乎所有的反应都有酶的参与。酶法分析在 临床诊断、生物、食品、化学、环境等领域都有广泛的应用。酶催化反应因其具有高 效、专一、条件温和等特点而备受关注。然而天然酶来源有限，提纯困难，价格昂贵， 而且为了保持其活性要求实验条件和操作环境都较为苛刻，使其应用受到了极大的限 制，因此模拟酶的开发及应用研究越来越受到人们的关注。已报道的模拟酶主要有过氧化物模拟酶，细胞色素P450模拟酶，丝氨酸蛋白酶 模拟酶，磷酸二酯酶模拟酶，加双氧酶模拟酶，核酸酶模拟酶等。由于过氧化物酶可以 高效地催化氧化过氧化氢，而过氧化氢又是生物反应中一种重要的中间物质，所以对过 氧化氢以及相关生化物质的精确测定具有重要的意义。过氧化物模拟酶所涉及的物质包 括四氧化三铁纳米粒子，血红蛋白，氯化血红素，金属卟啉，金属酞菁等。其中，纳米 颗粒模拟酶具有制备简单、经济、快捷、耐高温和耐酸碱、性质稳定等诸多优势，在模 拟生物酶方面显示出极其诱人的应用前景。本发明基于纳米氧化铜的模拟过氧化物酶特性，提供了一种比色检测过氧化氢 的新方法。
发明内容
本发明的目的在于基于纳米氧化铜的模拟过氧化物酶特性，提供了一种纳米氧 化铜模拟酶以及纳米氧化铜作为过氧化物模拟酶比色测定过氧化氢的新方法。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案(一 )纳米氧化铜模拟酶的制备取硝酸铜溶液和冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾，快速 加入氢氧化钠溶液，加完后，继续搅拌5分钟，得到黑色氧化铜沉淀。将反应得到的黑 色氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤，减压干燥，即得纳米氧化铜粉体(图1-3分别为所 制备的纳米氧化铜的透射电镜、XRD和紫外-可见吸收光谱图))。将纳米氧化铜粉体分 散于二次蒸馏水中得到棕色纳米氧化铜模拟酶溶液(见图4所示)。( 二)纳米氧化铜模拟酶特性取二次蒸馏水置于超级恒温水槽中37°C温浴20min，再依次分别加入过氧化氢 溶液，纳米氧化铜模拟酶溶液，3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐溶液，摇勻，37°C 反应IOmin后，取出。以二次蒸馏水为空白，在400-800nm波长范围内测定吸收光谱。从图5比色图和图6数据可以看到，纳米氧化铜可催化过氧化氢氧化过氧化物酶底物3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐的反应，具有优良的模拟过氧化物酶特性。(三)纳米氧化铜作为过氧化物模拟酶测定过氧化氢分别37°C预热反应试剂(酚溶液、4-氨基安替比林溶液、pH 6.0Tris-HCl缓冲 液)20分钟后，在同一离心管中加入上述的酚溶液，4-氨基安替比林溶液，Tris-HCl缓 冲液，过氧化氢溶液，纳米氧化铜模拟酶溶液，混勻后37°C恒温反应20分钟，用紫外可 见分光光度计测定最大吸收波长处的吸光度。利用本发明的比色方法对过氧化氢检测的表征如图7和图8所示。从图7数据可以看出，该方法对于过氧化氢有很好的比色响应。从图8数据可以看出，该方法对于过氧化氢的检出限为0.02mmOl/L，线性范围 是 0.1 至Ij lmmol/L。由上述技术方案可知，本发明所述的纳米氧化铜具有过氧化物酶的功能，可催 化过氧化氢氧化过氧化物酶底物，是一种新型的过氧化物酶的模拟酶，可用于过氧化氢 的比色检测。本发明的有益效果是本发明所述的纳米氧化铜其直径为5 Snm的纳米氧化 铜，为单斜晶系的CuO，空间群为C2/c，所制备的纳米氧化铜的典型紫外-可见吸收光 谱最大吸收峰位于280nm处，具有过氧化物酶的功能，可催化过氧化氢氧化过氧化物酶 底物，是一种新型的过氧化物酶的模拟酶，对于过氧化氢有很好的比色响应，可用于过 氧化氢的比色检测。对于过氧化氢的检出限为0.02mmOl/L，线性范围是0.1到lmmol/ L。纳米氧化铜过氧化物模拟酶的制备工艺简单，粒径小，水中的分散稳定性好，催化能 力强。
图1为本发明的纳米氧化铜模拟酶的透射电镜图。图2为本发明的纳米氧化铜模拟酶的XRD图。图3为本发明的纳米氧化铜模拟酶的紫外-可见吸收光谱图。图4为本发明的0.4mg/ml纳米氧化铜模拟酶水溶液。图5为本发明的纳米氧化铜模拟酶在37°C时对过氧化氢氧化3，3’，5，5’ -四 甲基联苯胺盐酸盐反应的催化活性图。图中的比色照片为反应后拍摄而得。图中左侧为 含有纳米氧化铜模拟酶(颜色深的)，右侧为不含纳米氧化铜模拟酶(颜色浅的)。图6为本发明的纳米氧化铜模拟酶催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’ -四甲基联 苯胺盐酸盐的反应产物的吸收光谱图。图中a为含有纳米氧化铜模拟酶，b为不含纳米 氧化铜模拟酶。图7为本发明的纳米氧化铜模拟酶以苯酚和4-氨基安替比林为底物测定过氧化 氢的吸收光谱图。图中a为含有纳米氧化铜模拟酶，b为不含纳米氧化铜模拟酶。图8为本发明的纳米氧化铜模拟酶以苯酚和4-氨基安替比林为底物测定过氧化 氢的浓度与吸光度关系图。
具体实施例方式下述实施例的％指重量百分比。
实施例1 纳米氧化铜模拟酶的制备步骤如下(1)取0.02mol/L的硝酸铜溶液150ml和0.5ml冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈 瓶中，搅拌加热至沸腾；(2)快速加入0.04g/ml的氢氧化钠溶液10ml，加完后，继续搅拌5分钟，得到 黑色氧化铜沉淀；(3)将反应得到的黑色氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤三次，减压干燥，即得 直径为6nm的纳米氧化铜粉体(图1为本发明制备的纳米氧化铜的透射电镜图)，产率为 25%。纳米氧化铜的XRD表征结果如图2所示，从图中可以看出，产物的所有衍射峰均 可标定为单斜晶系的CuO，空间群为C2/c，与标准图谱JCPDS 45-0937相吻合。图3为 所制备纳米氧化铜的典型紫外_可见吸收光谱，最大吸收峰位于280nm附近。(4)将纳米氧化铜粉体分散于二次蒸馏水中得到棕色纳米氧化铜模拟酶溶液，见 图4所示。实施例2 纳米氧化铜模拟酶特性表征步骤如下(1)取3.9ml的二次蒸馏水置于超级恒温水槽中于37°C温浴20min ；(2)依次分别加入30%过氧化氢溶液850 μ L，实施例1制得的0.4mg/ml纳米氧 化铜模拟酶溶液50 μ L，5.5mg/ml 3, 3，，5，5，-四甲基联苯胺盐酸盐溶液200 μ L， 摇勻，37°C反应IOmin后，取出；(3)以二次蒸馏水为空白，在400-800nm波长范围内测定吸收光谱。测试结果见图5、图6所示，从图5、图6数据可以看到，纳米氧化铜可催化过 氧化氢氧化过氧化物酶底物3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐的反应，具有优良的 模拟过氧化物酶特性。实施例3 纳米氧化铜作为过氧化物模拟酶测定过氧化氢的步骤如下(1)分别于37°C预热反应试剂(6mmol/L的苯酚溶液、6mmol/L的4-氨基安替 比林溶液、pH 6.OTris-HCl缓冲液)20分钟；(2)在同一离心管中依次加入上述的苯酚溶液2.0ml，4_氨基安替比林溶液 790 μ 1，Tris-HCl缓冲液960 μ 1，以及不同浓度的过氧化氢溶液300 μ 1，实施例1制得 的0.2mg/ml纳米氧化铜模拟酶溶液50 μ 1，混勻后37°C恒温反应20分钟；所述的不同浓 度的过氧化氢溶液的浓度分别为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.Ommol/ L ；(3)用紫外可见分光光度计测定最大吸收波长505nm处的吸光度。实施例4 纳米氧化铜作为过氧化物模拟酶测定过氧化氢的步骤如下(1)分别37°C预热反应试剂(6mmol/L的2，4_二氯苯酚溶液、6mmol/L的4-氨 基安替比林溶液、pH 6.0Tris-HCl缓冲液)20分钟；(2)在同一离心管中依次加入上述的2，4-二氯苯酚溶液2.0ml，4_氨基安替比 林溶液790 μ 1，TriS-HCl缓冲液960 μ 1，以及不同浓度的过氧化氢溶液300 μ 1，实施例1制得的0.2mg/ml纳米氧化铜模拟酶溶液50μ1，混勻后37°C恒温反应20分钟；所述 的不同浓度的过氧化氢溶液的浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、 1.0mmol/L ；(3)用紫外可见分光光度计测定最大吸收波长506nm处的吸光度。实施例5 纳米氧化铜作为过氧化物模拟酶测定过氧化氢的步骤如下(1)分别37°C预热反应试剂(6mmol/L的2，6_二氯苯酚溶液、6mmol/L的4-氨 基安替比林溶液、pH 6.0Tris-HCl缓冲液)20分钟；(2)在同一离心管中依次加入上述的2，6-二氯苯酚溶液2.0ml，4_氨基安替比 林溶液790 μ 1，TriS-HCl缓冲液960 μ 1，以及不同浓度的过氧化氢溶液300 μ 1，实施例 1制得的0.2mg/ml纳米氧化铜模拟酶溶液50μ1，混勻后37°C恒温反应20分钟；所述 的不同浓度的过氧化氢溶液的浓度分别为0.1、03、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、 l.Ommol/L ；(3)用紫外可见分光光度计测定最大吸收波长518nm处的吸光度。实施例6 纳米氧化铜作为过氧化物模拟酶测定过氧化氢的步骤如下(1)分别37°C预热反应试剂(6_ol/L的α -萘酚溶液、6mmol/L的4_氨基安 替比林溶液、pH 6.0Tris-HCl缓冲液)20分钟；(2)在同一离心管中依次加入上述的α-萘酚溶液2.0ml，4_氨基安替比林溶 液790 μ 1，TriS-HCl缓冲液960 μ 1，不同浓度的过氧化氢溶液300 μ 1，实施例1制得的 0.2mg/ml纳米氧化铜模拟酶溶液50 μ 1，混勻后37°C恒温反应20分钟；所述的不同浓 度的过氧化氢溶液的浓度分别为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.Ommol/ L ；(3)用紫外可见分光光度计测定最大吸收波长512nm处的吸光度。实施例3-实施例7是利用比色方法对过氧化氢检测的表征，其测试结果如图7 和图8所示。从图7数据可以看出，该方法对于过氧化氢有很好的比色响应。从图8数据可以看出，该方法对于过氧化氢的检出限为0.02mmOl/L，线性范围 是 0.1 至Ij lmmol/L。
权利要求
1.一种由下述步骤制备而成的纳米氧化铜模拟酶1)取硝酸铜溶液和冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾，快速加 入氢氧化钠溶液，继续搅拌5分钟，得到黑色氧化铜沉淀；2)将反应得到的黑色氧化铜 沉淀离心，用无水乙醇洗涤，减压干燥，即得直径为5 Snm的纳米氧化铜粉体，纳米 氧化铜为单斜晶系的CuO，空间群为C2/c，所制备的纳米氧化铜的典型紫外-可见吸收 光谱最大吸收峰位于280nm处；3)将纳米氧化铜粉体分散于二次蒸馏水中得到棕色纳米 氧化铜模拟酶溶液。
2.权利要求1所述的纳米氧化铜模拟酶，其特征为所述的纳米氧化铜模拟酶为具有过 氧化物酶的催化功能的过氧化物模拟酶。
3.权利要求1或2所述的纳米氧化铜模拟酶，其特征为作为催化过氧化氢氧化3， 3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐的反应的过氧化物酶的模拟酶的应用。
4.权利要求1或2所述的纳米氧化铜模拟酶，其特征为作为催化过氧化氢氧化2， 2’ -联氨-双(3-乙基苯并赛唑啉-6-磺酸)-二胺盐的反应的过氧化物酶的模拟酶的应 用。
5.权利要求1或2所述的纳米氧化铜模拟酶比色测定过氧化氢的方法，包括如下步骤1)取酚溶液、4-氨基安替比林溶液和pH6.0Tris-HCl缓冲液，分别预热；2)在一离 心管中依次加入上述预热的酚溶液，4-氨基安替比林溶液，Tris-HCl缓冲液，以及过氧 化氢溶液和纳米氧化铜模拟酶溶液，混勻后恒温反应，反应后用紫外可见分光光度计测 定最大吸收波长处的吸光度，显示纳米氧化铜模拟酶具有显著的过氧化物酶特性，对过 氧化氢具有很好的比色响应。
6.根据权利要求5所述的纳米氧化铜模拟酶比色测定过氧化氢的方法，其特征在于 纳米氧化铜模拟酶比色测定过氧化氢的检出限为0.02mmOl/L，线性范围是0.1到lmmol/ L。
7.根据权利要求5或6所述的纳米氧化铜模拟酶比色测定过氧化氢的方法，其特征在 于所使用的酚可为苯酚、2，4-二氯苯酚、2，6-二氯苯酚或α-萘酚。
8.根据权利要求5或7所述的纳米氧化铜模拟酶比色测定过氧化氢的方法，其特征在 于预热是在37°C下预热20分钟；所述的恒温反应温度为37°C，时间为20分钟。
全文摘要
本发明公开了一种纳米氧化铜模拟酶及其作为过氧化物模拟酶测定过氧化氢的方法。纳米氧化铜模拟酶的直径为5～8nm的纳米氧化铜粉体，纳米氧化铜为单斜晶系的CuO，空间群为C2/c，所制备的纳米氧化铜的典型紫外-可见吸收光谱最大吸收峰位于280nm处。纳米氧化铜模拟酶是通过化学沉淀法得到纳米氧化铜模拟酶。该纳米氧化铜模拟酶具有类似过氧化物酶的催化特性。将纳米氧化铜模拟酶用于4-氨基安替比林-酚体系，可实现过氧化氢的比色检测。对于过氧化氢的检出限为0.02mmol/L，线性范围是0.1到1mmol/L。
文档编号G01N21/31GK102020308SQ20101051969
公开日2011年4月20日 申请日期2010年10月25日 优先权日2010年10月25日
发明者刘爱林, 李光文, 林新华, 陈伟 申请人:福建医科大学