专利名称：新荧光染料及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及荧光染料，更具体地说，涉及紫外线可激发的荧光染料组合物、化合物和共轭物，以及它们的使用和制造方法。
背景技术：
荧光染料被广泛用于标记、检测、和/或定量样品中的组分。用于这样的检测和/ 或定量的多种方法包括荧光显微术、荧光免疫测定、细胞的流式细胞计数分析、以及多种其他应用。一般来讲，对于利用荧光染料作为检测工具的许多应用，有必要将荧光染料共轭于配体比如蛋白质、抗体、酶、核苷酸、核酸、以及其他生物学和非生物学分子来制备被染料标记的配体。被染料标记的配体是重要的可赋予特异性用于随后的生物化学反应的试剂，在所述生物化学反应中，荧光染料可提供一种用于检测和/或定量该反应的方法。荧光染料的选择在采用多重、多色分析的应用、以及多种其他应用中特别重要，比如该分析是荧光显微术、荧光免疫测定、流式细胞术。显著地，某些检测应用需要紫外线可激发的具有特定激发范围的荧光团。具体地说，需要这样一种荧光染料其在多色流式细胞仪中能够被405nm紫色激光有效地激发。用于这些应用的标靶染料实质上应该具有下述特征1)在405nm附近其激发光谱有最大值，幻有强的可光谱分辨的发射最大值，幻有大的斯托克斯频移 (Stokes' shift)，优选至少50nm，以及4)荧光染料有通过反应基团偶联于生物分子的能力。迄今为止，一直缺乏一种紫外线可激发的荧光团，其能够被共轭于不同的配体从而提供被染料标记的试剂，所述试剂具有可光学和电子学分离的荧光光谱特性。本发明的荧光染料在结构上类似于萤火虫荧光素化合物。这些化合物此前已经用作化学发光试剂，借由该试剂通过荧光素的氧化催化而产生光。荧光素是荧光素酶这种酶的底物，其在荧光素酶存在的条件下被氧化从而产生氧化荧光素和能量，该能量以光的形式被释放。对于这些类型的测定，荧光素酶-荧光素反应为用于众多物质的简单、快速、敏感的测定法提供了基础(Karicka, LJ. , Analytical Biochemistry, 175，14-21 (1988))。虽然这些以萤火虫荧光素的结构为基础的化学发光染料已经获得广泛应用，但这样的使用并不能证明具有类似于萤火虫荧光素结构的化合物有如下能力具有在特定部分的紫外光谱内可激发的荧光染料的功能。这样的紫外线可激发的荧光染料特别有利于大范围的应用，这些应用包括，但不限于，利用多重、多色荧光分析的那些应用。
发明内容
本发明涉及新颖的紫外线可激发的大体以萤火虫荧光素结构为基础的荧光染料、 包含该荧光染料的组合物、该荧光染料的中间体、和它们的使用方法。在一个方面，提供具有下述通式(I)的荧光染料的组合物
权利要求
1. 一种荧光染料，具有如下通式
2.如权利要求1所述的荧光染料，其特征在于，所述连接基团包含具有1-50个选自C、 N、0、S、P和卤素原子的非氢原子的共价键，并且所述连接基团由单键、双键、三键、或芳香碳-碳键、碳-氧键、碳-硫键、碳-氮键、以及氮-氮键的任何组合所组成；以及其中RG包含选自下组的反应基团羧酸、羧酸的活化酯、酸酐、酰基氯、酰叠氮、酰卤、 醛、氯甲酸酯、胺、羟基、胼、异氰酸酯、异硫氰酸酯、磺酰卤、甲苯磺酰基、马来酰亚胺、N-羟基-琥珀酰亚胺酯、氮丙啶、亚胺、以及二硫基团。
3.如权利要求1或2所述的荧光染料，其特征在于，所述连接基团包含如下通式R1C (O)R2，其中，R1是化学键或者附接于所述染料上的C1,亚甲基(CH2)n ；C(O)是羰基； R2是OH或者将羰基附接至反应基团RG上的化学键；或者R1C (0) A1R3C (0) R2，其中R1是化学键或者C1,亚甲基；C (0)是羰基或者是NH、S，或者是0 ；民是烯基(CH2)IK具有至少一个不饱和键的五元环或六元环、或C1,亚甲基(CH2)n 与五元环或六元环的组合出2是OH或者将末端羰基附接至反应基团RG上的化学键。
4.如权利要求1至3中任一项所述的荧光染料，其特征在于，RG包含羧酸、羧酸的琥珀酰亚胺酯、酰胼、胺、异硫氰酸酯、或马来酰亚胺。
5.如权利要求1所述的荧光染料，具有下述通式
6.如权利要求1所述的荧光染料，具有下述通式
7.如权利要求1所述的荧光染料，具有下述通式
8.如权利要求1所述的荧光染料，具有下述通式
9.如权利要求1所述的荧光染料，具有下述通式
10.如权利要求1所述的荧光染料，具有下述通式
11.如权利要求1所述的荧光染料，具有下述通式
12.如权利要求1所述的荧光染料，具有下述通式
13.如权利要求1所述的荧光染料，其能以大约340nm至大约450nm的波长激发。
14.一种染料-共轭物，具有如下通式
15.如权利要求14所述的染料-共轭物，其特征在于，所述共轭分子是肽或蛋白质。
16.如权利要求14或15所述的染料-共轭物，其特征在于，所述共轭分子是抗体、或抗体片段。
17.—种检测样品中特异性结合配对中的互补成员的方法，包括a)将所述样品与如权利要求14至16中任一项所述的可特异性地结合于所述互补成员的染料-共轭物相混合；以及b)检测由所述混合物形成的复合物，以便检测出所述互补成员。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述互补成员是蛋白质或肽。
19.如权利要求17或18所述的方法，其特征在于，所述互补成员存在于细菌、病毒或者动物细胞上。
20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其特征在于，所述复合物通过其荧光响应而被检测。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述荧光响应通过使用流式细胞仪、荧光计、荧光显微镜、或荧光板阅读器来检测。
22.如权利要求20或21所述的方法，其特征在于，还包括将所述荧光响应从具有可检测的不同光学特性的第二荧光团的荧光响应中区分开来。
23.如权利要求20至22中任一项所述的方法，其特征在于，还包括基于所述荧光响应，将所述复合物与其他样品组分分离开来。
24.一种化合物，具有如下通式
全文摘要
本发明提供了以萤火虫荧光素结构为基础的荧光染料。这些染料可在较短的波长处被最佳地激发，并且具有至少50nm的斯托克斯频移。本发明的荧光染料可用于制备染料-共轭物，该染料-共轭物能够用于样品中分析物的检测。
文档编号G01N33/535GK102498177SQ201080040648
公开日2012年6月13日 申请日期2010年7月15日 优先权日2009年7月16日
发明者H·阿哈万·塔夫狄, L·S·卡阿努马利, R·A·艾克霍特, R·K·古普塔, R·德席尔瓦, 王国平 申请人:贝克曼考尔特公司