一种油脂中黄曲霉毒素B₁快速检测试剂盒及其制备方法

专利名称：一种油脂中黄曲霉毒素B₁快速检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及ー种油脂中黄曲霉毒素B1快速检测试剂盒及其制备方法，利用吐温20对油脂样品进行乳化处理，再将处理后样品用于黄曲霉毒素B1胶体金免疫层析检测试纸条检测，属于免疫学和微生物菌类毒性代谢产物检测方法技术领域。
背景技术：
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黄曲霉毒素(AFT)是ー类结构和理化性质相似的ニ呋喃香豆素衍生物，基本结构含有一个ニ呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)，前者是产毒和致癌的主要结构，后者对毒性和致癌性起加强作用。目前已发现的黄曲霉毒素有20种左右，AFT在紫外线下能产生特定的荧光，根据荧光颜色不同，将其分为蓝紫色荧光的B族和黄緑色荧光的G族两大类及其衍生物，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)的急性毒性最強，是目前已经发现的AFT中的最強致癌物。AFB1中毒症状表现为呕吐、厌食、发热、黄疸、腹水等肝炎症状，能诱导畸形、癌症的发生，对鱼类、禽类、家畜和灵长类动物的试验证明其肿瘤诱导作用极大，井能诱导多种癌症的发生。大量的流行病学调查证实，AFB1的高摄入量和人类肝癌的发病率呈正相关关系，例如在非洲和东南亚等ー些地区，AFB1污染饮食被确定是肝细胞癌最主要的诱发因素之一，因此对食品中AFB1进行快速、有效的检测在食品安全上具有重要意义。AFT的分子量在312-346之间，熔点为268_269°C。AFB1分子量为312. 27，在中性水溶液中较稳定，在强酸性溶液中稍有分解，易被碱或强氧化剂破坏，加热至268-269°C的熔解温度才开始裂解，故一般烹调温度不破坏其毒性。AFB1和其它AFT —祥，难溶于水、己烷、石油醚，易溶于甲醇、こ醇、氯仿、ニ甲基甲酰胺等有机溶剂，而花生等含油脂较高的粮食作物相对于其它食物而言更容易受到产AFB1的霉菌污染，因此被AFB1污染的食用油对人类健康危害极大。目前，金标-AFB1快速免疫层析检测试纸是ー种被大量应用的AFB1检测手段。此种试纸利用胶体金颗粒对黄曲霉素-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)进行标记，使其与样品中的AFB1竞争结合固定在试纸条检测线上的抗体，检测线如果显现胶体金的红色，则说明样品中不含有AFB1，反之则有。此试纸操作简单，灵敏度高，但是由于抗原抗体反应无法在油脂中发生，故此试纸目前无法检测含油脂的液体样品，在检测前必须对油脂样品进行复杂萃取处理和除油步骤，本项发明提供了ー种简单处理油脂的液体，该液体与油脂混合后，可将混合液直接作为免疫层析检测试纸(稍加改造)的点样样品并进行快速鉴定。

发明内容
本发明的目的本发明提供一种简单、有效的油脂样品处理液，并对胶体金标免疫层析检测试纸结构稍加改造后，使其适用于这种油脂混合样品的检测。本发明技术方案油脂样品处理原理是采用吐温20作为乳化剂对油脂样品进行乳化处理，使油脂在油脂处理液(甲醇-PBS-吐温溶液)中均匀分散为微小油滴，形成稳定的水包油(0/W)型乳化体系。在层析过程由于吐温20发挥着表面活性剂的作用，微小的油滴完全被水分子稳固包囊着，使作为亲水胶体的抗体始终处于稳定的水相环境中，抗体的活性与功能不会受到影响，并且油样中的AFB1溶解于甲醇水溶液中可与AFB1-BSA在水相中竞争结合固定的抗AFB1抗体，纤维素膜上的免疫反应正常发生而不受微小油滴干扰。检测原理分别将AFB1-BSA与羊抗鼠抗体固定在硝酸纤维素膜上作为检测线与质控线，在层析过程中，处理后的油脂样品中的AFB1首先与胶体金标记的小鼠抗AFB1抗体反应，在样品中AFB1浓度越大，结合在固定抗体上的金标-AFB1-BSA就越少，检测线所显现的胶体金的红色就越浅。如果油样中AFB1浓度超过检测限度则所有的胶体金标记的小鼠抗AFB1毒素抗体都将被结合，则在检测线上就不会出现显色。正常情况下，无论是否含有AFB1质控线都显示红色。通过观察检测线的顔色可直接定性判断油脂样品中AFB1的有无。本发明的有益結果本发明采用改进的胶体金标免疫层析检测试纸，可直接对食用油中的AFB1-行检测。检测时将油脂处理液与油脂简单混合后，油脂即成为可有效进行免疫层析检测的乳浊液样品，根据观测区检测线和质控线的颜色变化，确定食用油样品中 AFB1是否超标。与现有胶体金标免疫层析检测试纸相比，本项发明的AFB1快速检测试剂盒工作时无需复杂的油脂样品处理工艺，不仅缩短了预处理时间，而且突破了常规胶体金标免疫层析检测试纸只能检测水溶液样品的限制，可对含油脂样品直接检测


图I油脂样品处理液工作原理示意2金标免疫层析检测试纸结构示意3试剂盒检测食用油中AFBi结果图
具体实施例方式I.试剂材料玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水纸、塑胶板、羊抗小鼠IgG购自Solarbio公司！AFB1-BSA(溶于甲醇-PBS)、牛血清蛋白V购自Sigma公司AFB1单克隆抗体购自蓝图生物科技有限公司；氯金酸、朽1檬酸三钠购自国药；吐温20购自amresco公司；本实验用水均为超纯水。2.油脂样品处理液的制备向2. Oml离心管中准确加入490iU PBS缓冲液、210ul甲醇、300 Ul吐温20。漩涡震荡混匀制成油脂样品处理液，常温密闭保存。3.金标-AFB1免疫层析试纸制备I)配制1%氯金酸溶液将Ig氯金酸溶解于IOOml超纯水中，4°C保存。2)配制1%朽1檬酸三钠溶液称取Ig朽1檬酸三钠溶于IOOml超纯水中，4°C保存。3)硝酸纤维素膜封闭液称取Ig BSA溶解于IOOml 0. 01mol/L PBS缓冲液中，再加入100 u I吐温20，充分混合，4°C保存。4)胶体金制备准确量取IOOml 0.01%氯金酸溶液于硅化三角瓶中，摇匀后置于微波炉煮沸，搅动后立即加入2ml I %柠檬酸三钠溶液，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色，继续煮沸10分钟。待溶液冷却至室温后用超纯水定容至100ml，采用紫外分光光度计检测颗粒均匀度及粒度。5)胶体金标记AFB1单克隆抗体
使用PBS缓冲液稀释AFB1单克隆抗体为I. Omg/ml。取胶体金溶液100ml，用0. ImoVLK2CO3调节pH至9. O。将2ml稀释后抗AFB1单抗溶液加入胶体金溶液中，滴加时应在磁力快速搅拌下逐滴缓慢加入，继续搅拌15min。电磁搅拌下加入200mg牛血清蛋白以稳定金颗粒的残留表位。再搅拌IOmin后，以1500rpm/min 4°C离心IOmin,弃沉淀,上清液再以12000rpm/min 4°C离心30min,小心吸去上清,所得沉淀即为胶体金-抗AFB1单抗结合物。使用lmmol/L Tris-HCl (pH 9. 0)缓冲液稀释至5ml,以0. 5mg/ml叠氮钠防腐,4°C保存备用。6)处理玻璃纤维膜 将吸水玻璃纤维剪裁为长I. 5cm,宽0. 5cm矩形小片后浸泡于胶体金-抗AFB1单抗混合液中，37°C干燥2h，使玻璃纤维素膜吸附胶体金-杭AFB1单抗结合物，4°C密闭保存备用。7)处理硝酸纤维素膜在硝酸纤维素膜上用AFB1-BSA (2. Omg/ml)及羊抗鼠IgG多克隆抗体(2. Omg/ml)划约Imm宽的线，分别作为检测线(T线)和对照线(C线)。37°C干燥20分钟后，用NC膜封闭液封闭2h，以0. Olmol/L PBS洗涤3次。37°C干燥30min。干燥后切成0. 5cmX I. 5cm的小条装入塑料盒中，加入干燥剂，密封避光，4°C保存备用。8)试纸条的组装试纸条由样品垫(吸水纸)、吸水玻璃纤维、硝酸纤维素膜、余液吸收垫(吸水纸)、底板(塑胶板)纸四部分組成。作为样品垫的吸水纸剪切为长宽均为0.7X0. 5cm的长方形小片。余液吸收垫(吸水纸)剪切为长I. 5cm,宽0. 5cm的矩形小条。将样品垫、吸水玻璃纤维、硝酸纤维素膜和余液吸收垫依次粘贴于5. OcmXO. 5cm塑胶板表面制成金标-AFB1免疫层析试纸，除硝酸纤维素膜和余液吸收垫重叠区为3mm外，吸水玻璃纤维和样品垫及硝酸纤维素膜的重叠区为2mm，且硝酸纤维素膜含30°斜面。试剂盒的实际使用下面实际介绍本发明的使用方法，但不能作为对本发明的限制。I.试剂与样品AFB1标准液购自Sigma公司；食用花生油购自超市。2.阳性样品的准备使用0. Olmol/L PBS将AFB1稀释至2mg/ml标准液。分别向8管500iU花生油中添加不同体积AFB1标准液，制成终浓度为0ng/ml、0. 5ng/ml、l. Ong/ml、2. 0ng/ml、5. 0ng/ml> 10. 0ng/ml、20. 0ng/ml、30. Ong/ml 的阳性样品。3.阴性样品准备取8管500 ill食用花生油，不添加AFBi标准液，但添加与各管阳性样品所加标准液体积相同的0. Olmol/L PBS缓冲液。4.样品检测前的处理将阳性、阴性样品各分别吸取300 Ul加入16管油脂样品处理液中，颠倒混匀，制为16管待检液。5.分别从16管待检液中吸取300 Ul下层液体(不吸取泡沫)，缓慢滴加在金标-AFB1免疫层析试纸样品垫上，5分钟后观察检测結果。6.检测結果重复以上实验3次。阴性样品全部正确检出阴性，假阳性率为0%。阳性样品检测结果如表I :表I黄曲霉毒素BI快速检测试剂盒检测灵敏度
权利要求
1.ー种油脂中黄曲霉毒素B1快速检测试剂盒及其制备方法，其特征是由油脂样品处理液和金标试纸条组成，油脂经油脂样品处理液处理后，直接滴入金标试纸条进行黄曲霉毒素B1快速检测。
2.如权利要求I所述的检测试剂盒制备方法，其特征是油脂样品处理液由2ml规格的Appendorf管以及其中所 装试剂组成，每管依照4. 9 2. I 3的比例配制PBS、甲醇和吐温20的混合溶液Iml ；
3.如权利要求I所述的检测试剂盒制备方法，其特征是金标试纸条中吸水滤纸与吸水玻璃纤维，吸水玻璃纤维与硝酸纤维素膜的互相重叠区为2mm。
4.如权利要求3所述的检测试剂盒制备方法，其特征是金标试纸条中玻璃纤维与吸水滤纸及硝酸纤维素膜重叠形成30°斜面角。
全文摘要
本发明涉及一种油脂中黄曲霉毒素B1快速检测试剂盒及其制备方法，属于免疫学和微生物菌类毒性代谢产物检测方法技术领域。结合吐温20乳化油脂样品技术，建立了可直接用于检测油脂中黄曲霉毒素B1的金标快速检测试纸，该试剂盒最低检出限度为10ng/ml。本项发明的油脂中黄曲霉毒素B1快速检测试剂盒工作时无需复杂的油脂样品处理工艺，不仅缩短了预处理时间，而且突破了常规胶体金标免疫层析检测试纸只能检测水溶液样品的限制，可对含油脂样品直接检测。
文档编号G01N33/577GK102841202SQ201110172360
公开日2012年12月26日 申请日期2011年6月24日 优先权日2011年6月24日
发明者陈超, 王英典, 万一非, 万沅松, 龙云映, 颜亨梅 申请人:安宝生, 袁剑锋, 陈超