一种绝对定量油中甘油酯类成分的方法
【专利摘要】本发明提供了一种绝对定量油中甘油酯类成分的方法，该方法如下：LC-APCI/MS表征技术对样品油溶液中的甘油酯类成分定性并获得理论摩尔分子量；利用靶向收集策略收集样品油中各个甘油酯类成分；用无标准品评价回收率策略对靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分进行回收率计算，得到回收率数值；利用改良的甘油三酯试剂盒和甘油或单个甘油酯标准品水解、测定各甘油酯类成分的摩尔含量，通过等摩尔换算法换算甘油的含量绝对定量样品油中各个甘油酯类成分的质量百分含量。本发明能够仅利用甘油或单个甘油酯标准品来绝对定量油中的甘油酯类成分。
【专利说明】一种绝对定量油中甘油酯类成分的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于酶水解绝对定量油中甘油酯类成分的方法，属于食品药品中油类成分的质量控制【技术领域】。
【背景技术】
[0002]甘油酯类成分主要分布在脂肪、油和奶制品中，它是由一个甘油分子与I?3个脂肪酸分子缩合而成，对生物体内的脂类代谢具有调节作用，同时对于辅助免疫系统发挥免疫功能的肠道微生物群落也有调节作用。但是，如果体内甘油酯类成分过量，或者甘油酯类成分过分吸收、异常代谢、排泄缓慢，则会导致人体出现动脉粥样硬化、高血脂和肥胖等疾病。
[0003]植物油中的主要成分为甘油酯类成分，这些成分都具有很好的抗肿瘤效果，因此就需要控制甘油酯类成分的含量，使其既能够发挥抗肿瘤效果又不会过量引起副作用。但是由于甘油酯类成分难以分离获得，因而迫切需要开发一种绝对定量油中甘油酯类成分的方法来对油进行质量控制。
[0004]现有技术中，高效液相色谱-示差折光检测法是脂肪和食用油法定标准的检测方法，在过去的几十年里，二维气相色谱、同位素标记质谱、酶联甘油三酯检测和柱后反应检测方法已经被用于植物油中甘油酯类成分的测定，然而以上方法高度依赖甘油酯类成分的标准品，而甘油酯类标准品极难获得且品种和数量非常有限，如何在没有标准品或少用标准品的情况下绝对定量油中甘油酯类成分目前存在困难。
[0005]现有技术中，由于脂肪酶可以高效水解甘油酯类成分，例如甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯，所以目前普遍应用商品化的甘油三酯试剂盒能高效检测生物样品中的甘油酯类成分，尤其是血液和组织样品。但是，目前商品化或改良的甘油三酯试剂盒没有应用在油样品中甘油酯类成分的绝对定量。
【发明内容】
[0006]鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种绝对定量油中甘油酯类成分的方法，能够在不用或少用对照品的情况下绝对定量油中的甘油酯类成分。
[0007]本发明通过以下技术方案得以实现:
[0008]一种绝对定量油中甘油酯类成分的方法，该方法包括如下步骤:
[0009]用LC-APCI/MS表征技术对样品油溶液中的甘油酯类成分定性并获得理论摩尔分
子量;
[0010]利用靶向收集策略收集样品油中各个甘油酯类成分；
[0011]用无标准品评价回收率策略对靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分进行回收率计算，得到回收率数值；
[0012]利用改良的甘油三酯试剂盒和甘油或单个甘油酯标准品水解、测定各甘油酯类成分的摩尔含量，通过等摩尔换算法换算甘油的含量绝对定量样品油中各个甘油酯类成分的质量百分含量。
[0013]上述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法中，优选的，所述用LC-APCI/MS表征技术对样品油溶液中的甘油酯类成分定性并获得理论摩尔分子量的方法如下:
[0014]步骤一，调整色谱条件，使各个甘油脂类成分实现色谱分离；
[0015]步骤二，液相色谱-大气压化学电离质谱联用，对各个甘油脂类成分定性，获得理论摩尔分子量。
[0016]上述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法中，优选的，所述的靶向收集策略收集样品油中各个甘油酯类成分的方法如下:
[0017](I)样品油经过合适的前处理，用溶剂定量溶解样品油，得到样品油溶液，在优化的色谱条件下，各成分实现基线分离，便于后续的各甘油酯类成分的含量检测分析；
[0018](2)靶向收集策略可依赖ELSD、MS、紫外检测器，在优化的检测器条件下，便于各甘油酯类成分祀向收集；
[0019](3)合适浓度的油样品，在优化的色谱和检测器条件下，连续进样五次，分别统计各甘油酯类成分的保留时间和峰面积的差异，判断分析系统的稳定性和重复性；
[0020](4) 靶向收集策略:运用优化的色谱和检测器条件下，各甘油酯类成分实现基线分离，用聚乙烯管分别收集各甘油酯类成分，在常温下用氮气吹干所收集样品，用于样品化合物含量测定和回收率评价。
[0021]上述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法中，优选的，所述的用无标准品评价回收率策略对靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分进行回收率计算，其方法如下:
[0022]步骤一，配制样品油溶液，将样品油溶液用溶剂逐步稀释成系列浓度的多个浓度的样品；
[0023]步骤二，将步骤一所得的多个浓度的样品进入液相色谱仪进行色谱分析，色谱条件选用靶向收集策略收集样品油中各个甘油酯类成分时所用的色谱条件和检测器，根据分析结果，根据色谱峰面积及浓度的对数计算样品中各个甘油酯类成分的标准曲线；
[0024]步骤三，靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分常温下用氮气吹干后用溶剂复溶，分别进入液相色谱仪进行色谱分析，色谱条件选用靶向收集策略收集样品油中各个甘油酯类成分时所用的色谱条件和检测器，得到各个甘油酯类成分的色谱峰面积(Ad)；
[0025]步骤四，收集回收率计算:采用公式
【权利要求】
1.一种绝对定量油中甘油酯类成分的方法，该方法包括如下步骤: 用LC-APCI/MS表征技术对样品油溶液中的甘油酯类成分定性并获得理论摩尔分子量; 利用靶向收集策略收集样品油中各个甘油酯类成分； 用无标准品评价回收率策略对靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分进行回收率计算，得到回收率数值； 利用改良的商品化甘油三酯试剂盒和甘油或单个甘油酯标准品来水解、测定各甘油酯类成分的摩尔含量，通过等摩尔换算法换算甘油的含量绝对定量样品油中各个甘油酯类成分的质量百分含量。
2.根据权利要求1所述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法，其特征在于:所述的用无标准品评价回收率策略对靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分进行回收率计算，其方法如下: 步骤一，配制样品油溶液，将样品油溶液用溶剂逐步稀释成系列浓度的多个浓度样品; 步骤二，将步骤一所得的多个浓度的样品进入液相色谱仪进行色谱分析，色谱条件选用靶向收集策略收集样品油中各个甘油酯类成分时所用的色谱条件和检测器，根据分析结果，根据色谱峰面积及浓度的对数计算样品中各个甘油酯类成分的标准曲线； 步骤三，靶向收集策略收`集的样品油中的各个甘油酯类成分常温下用氮气吹干后用溶剂复溶，分别进入液相色谱仪进行色谱分析，色谱条件选用靶向收集策略收集样品油中各个甘油酯类成分时所用的色谱条件和检测器，得到各个甘油酯类成分的色谱峰面积；步骤四，计算回收率，得到回收率值: 当选用检测器为MS和/或紫外检测器时，计算回收率所采用的公式为:
Λ — fi R = -- X Cl— ) XIOO /q
kCa
Λ? t/* 当选用检测器为ELSD检测器时，计算回收率所采用的公式为: ? InJrf 1ΛΛη/ R =-xl 00%
In Aq — k In η,
* 其中，R是回收率、η是稀释倍数、Ad是靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分的色谱峰面积、A0是靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分的理论响应峰面积、k是样品油中各甘油酯类成分的标准曲线斜率、Ctl为靶向收集策略进样的样品油溶液的浓度；当选用MS检测器时，AtnAci分别表示靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分的检测峰面积和理论响应峰面积分别相对一定浓度内标响应峰面积的比值。
3.根据权利要求1所述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法，其特征在于:所述的用改良的甘油三酯试剂盒和甘油或单个甘油酯标准品来水解、测定各甘油酯类成分的摩尔含量，通过等摩尔换算法换算甘油的含量绝对定量样品油中各个甘油酯类成分的质量百分含量，其方法如下: 对商品化甘油三酯试剂盒的R2液进行改良，得到改良的商品化甘油三酯试剂盒的R2液；分三个批次利用靶向收集策略收集样品油中的各个甘油酯类成分并用氮气吹干； 向三个批次靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分中分别添加相同量的溶剂，得到各个甘油酯类成分的溶液，再向各溶液中加入30倍溶液体积量的改良的商品化甘油三酯试剂盒的R2液，得到各个甘油酯类成分的混合液； 配制对照品溶液，用溶液梯度稀释该对照品溶液，得到系列浓度的对照品溶液； 精密吸取与各个甘油酯类成分的溶液相等体积的系列浓度的对照品稀释液，加入30倍溶液体积量的改良的商品化甘油三酯试剂盒的R2液，得到系列浓度对照品稀释液的混合溶液，重复三批次； 将各个甘油酯类成分的混合液、系列浓度对照品稀释液的混合溶液分别涡旋，后放入.37 °C恒温箱孵育水解15min ； 将水解后的各个甘油酯类成分的混合液、系列浓度对照品稀释液的混合溶液分别吸取加入到96孔板后，加入2-4倍混合液体积量的商品化甘油三酯试剂盒的Rl酶溶液，反应5min,用酶标仪550nm下测定吸收度； 根据吸收度及浓度各取平均值计算对照品的响应值对浓度的标准曲线，再依据所述标准曲线和三个批次各个甘油酯类成分的混合液的吸收度响应值计算靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分的浓度，取平均值； 计算各甘油酯类成分在油中所占的质量百分含量，其计算公式为:
4.根据权利要求3所述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法，其特征在于:所述改良的商品化甘油三酯试剂盒的R2液为在商品化甘油三酯试剂盒的R2液中加入O~400KU/L的脂蛋白脂肪酶。
5.根据权利要求1-4任一项所述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法，其特征在于:所述对照品包括甘油、三油酸甘油酯和/或单个甘油酯，所述甘油酯还包括甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯中的一种或几种的组合。
6.根据权利要求1-4任一项所述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法，其特征在于:所述溶剂包括异丙醇、乙醇、甲醇、氯仿、正己烷、二甲基亚砜、水、TWEEN系列、SPAN系列、TRITON系列表面活性剂中的一种或几种的组合，优选异丙醇。
7.根据权利要求1-4任一项所述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法，其特征在于:所述样品油为包含甘油酯的植物油和/或动物油及其相关制剂。
8.根据权利要求7所述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法，其特征在于:所述样品油为鸦胆子油。
9.根据权利要求1所述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法，其特征在于:所述的靶向收集策略和无标准品评价回收率策略用ELSD、MS或紫外检测器作为检测设备。
10.权利要求1-8任一项所述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法在定量油中的甘油酯类成分中的应用 。
【文档编号】G01N30/88GK103698438SQ201310628545
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】李萍, 刘鄂湖, 谭婷, 赖长江生, 曾素玲 申请人:中国药科大学