本发明涉及药物技术领域，具体地说，涉及含中药金雀根提取物药物的质量控制方法，所述的金雀根提取物作为抗骨质疏松症药物；本方法中以金雀根中的三个代表性化学成分kobophenol A,(+)-α-viniferin及carasinol B为质控指标，用HPLC技术建立含金雀根提取物药物的质控标准。
背景技术：
现有技术公开了骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量减少、骨微观结构退化、脆性增加和易发生骨折为特征的一种全身性疾病。随着人口老龄化的到来，原发性骨质疏松症已经成为严重的大众健康问题。据流行病学调查发现，目前全世界受到骨质疏松症困扰的中老年人约为2亿人；仅中国就有超过5000万的骨质疏松症患者，在50岁以上的人口中，骨质疏松症患者达到50％。
目前，针对骨质疏松症的药物主要有以下5类：一、抑制骨吸收为主的骨吸收抑制剂，如雌激素、双膦酸盐和降钙素等；第二类是以促进骨形成为主的骨形成促进剂，如氟化物、甲状旁腺激素等；第三类是兼有抑制骨吸收和促进骨形成药物，如依普黄酮、维生素K、锶盐等；第四类是骨矿化作用药物，如钙剂和维生素D活化剂；第五类是中药制剂，如仙灵骨葆胶囊、强骨胶囊、续断壮骨胶囊等。上述药物中，中药制剂因其毒副作用较小，价格相对便宜，而且往往具有多作用靶点的特点，因此受到越来越多的关注。本申请的前期研究工作证实，金雀根提取物可以明显增加去卵巢大鼠的股骨骨密度、骨小梁面积及骨量，可以用于骨质疏松症的治疗。然而，传统中药由于成分复杂，使其制剂存在一定的可控性、稳定性的困扰，这也是中医药国际化的难题之一。
本申请的发明人基于长期以来研究实践，拟提供用于抗骨质疏松的金雀根提取物的质量控制方法，以保证金雀根提取物中有效成分的含量水平，从而保持其药理作用的稳定。
技术实现要素：
本发明的目的针对现有技术存在的不足，提供一种含金雀根提取物药物的质量控制方法，以保证金雀根提取物中有效成分的含量水平，从而保持其药理作用的稳定。
本方法中采用HPLC技术，以式(Ⅰ)所示的化学结构式kobophenol A、(+)-α-viniferin及carasinol B为代表性成分指标，采用外标法进行定量分析，当金雀根提取物中该三种组分的质量百分比之和不小于50％时，在口服剂量为2.2～8.8mg/kg/天时，即可科学、可靠、简便的控制含金雀根提取物药物的质量标准，进而可获得理想的抗骨质疏松的药物效果。
本发明对经系统研究并鉴定获得的金雀根提取物的69个化合物化学成分进行体外生物活性研究，结果显示，其中的化学成分kobophenol A、(+)-α-viniferin及carasinol B具有刺激成骨细胞，抑制破骨细胞的作用，是其活性成分；金雀根中的二苯乙烯类化学成分发现有26种，是该植物中主要结构类型，kobophenol A、(+)-α-viniferin及carasinol B具有较大含量，且carasinol B为其专有成分；因此，本发明中选择该三种成分作为质控指标，可以保证含金雀根提取物药物中有效成分的含量水平，从而保持其药理作用的稳定。
具体而言，本发明的一种含金雀根提取物药物的质量控制方法，其特征在于，其包括，采用HPLC法，以式(Ⅰ)所示的化学结构式kobophenol A、(+)-α-viniferin及carasinol B为质控指标，用外标法进行定量分析，通过下述步骤：
设定色谱条件为：流动相为甲醇-乙腈-pH缓冲液；本发明的实施例中，优选流动相配比为：甲醇-乙腈-pH缓冲液为19.5∶18.5∶62；柱温30℃，流速1.0～1.5mL/min，进样量20μL；检测波长为250～350nm，本发明中，优选284nm波长；
制作标准曲线：
分别制备不同浓度kobophenol A标准液，(+)-α-viniferin和carasinol B标准液，将各标准液在所述色谱条件下进行HPLC分析，得各浓度标准液样品所对应的峰面积，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，制作kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B的标准曲线(如图1所示)；
测定金雀根提取物有效成分的含量，
根据kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B的峰面积和标准曲线方程计算其在金雀根提取物中的质量百分比。
本发明中，当金雀根提取物中所述三种组分的质量百分比之和不小于50％时，在口服剂量为2.2～8.8mg/kg/天时，即为含金雀根提取物药物的质量控制标准，进而可获得理想的抗骨质疏松的药物效果。
本发明中，采用仪器为：Agilent 1100高效液相色谱仪(美国)；
本发明中，采用化学试剂为：甲醇、乙腈(色谱纯)(购自Dikma公司)；蒸馏水购自Milli-Q系统(Millipore Corporation,美国)；无水乙酸钠、乙酸乙酯和乙醇(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司；冰醋酸(分析纯)购自上海试剂一厂；实验材料为：对照品kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B从金雀根中分离纯化，HPLC纯度均大于99％。
本发明中，通过下述方法制作标准曲线：
标准品kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B精密称重并用流动相分别定容至容量瓶中，然后依次等倍稀释，得kobophenol A标准液，浓度依次为800、400、200、100、50、12.5μg/mL；(+)-α-viniferin和carasinol B标准液，浓度依次为320、160、80、40、20、10μg/mL。将各标准液在上述色谱条件下进行HPLC分析，得各浓度样品所对应的峰面积，然后以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标制作kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B的标 准曲线(如图1所示)。
本发明中，通过精密度考察、准确度考察及稳定性考察证实了该方法的可靠性；
本发明中，对式(Ⅰ)所示结构式的kobophenol A、(+)-α-viniferin及carasinol B进行了试验验证，结果显示：
化学成分kobophenol A、(+)-α-viniferin及carasinol B在0.01μg/mL可分别刺激大鼠第二继代成骨细胞增殖12.5％，11.8％和10％，是金雀根提取物中活性成分(培养成骨细胞以6×103/cm2密度接种于6孔塑料培养板，24h后加入待测样品，于7％NCS-MEM(GIBCO)培养液中培养48小时，然后用MTT法测定)；而且从化学结构的类型而言，它们都属于天然产物中一种较为特征的二苯乙烯类成分，其分布具有一定的种属特异性，尤其是化合物carasinol B，是金雀根中独特的化学成分，至今尚未在其它天然产物中发现，本发明选择这三个化学成分为指标，既确保了金雀根提取物化学成分组成的相对恒定，并进一步保证了其抗骨质疏松作用的有效性。
本发明经反复实验结果表明，所建立的分析方法稳定、准确和可靠，测得的金雀根提取物中kobophenol A、(+)-α-viniferin及carasinol B为代表性成分，该三种组分的质量百分比之和不小于50％时，可作为抗骨质疏松金雀根提取物药物的质量控制标准。
本发明中，还可采用UPLC法、毛细管电泳法等类似方法，以式(Ⅰ)所示的化学结构式kobophenol A、(+)-α-viniferin及carasinol B为质控指标，用外标法进行定量分析。
附图说明
图1为kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将 落在权利要求书的范围内。
实施例1
仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪(美国)；
化学试剂：甲醇、乙腈(色谱纯)均来自Dikma公司；蒸馏水来自Milli-Q系统(Millipore Corporation,美国)；无水乙酸钠、乙酸乙酯和乙醇(分析纯)来自国药集团化学试剂有限公司；冰醋酸(分析纯)来自上海试剂一厂；实验材料：对照品kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B从金雀根中分离纯化，HPLC纯度均大于99％；
色谱条件：ODS-2hypersil反相柱(5μm，150×4.6mm，Thermo Electron Corporation，美国)；流动相甲醇-乙腈-邻苯二甲酸缓冲液(0.04M，pH 5.0)(19.5:18.5:62.0)；柱温30℃；流速1.5mL/min；进样体积20μL；检测波长284nm；
标准曲线的制作：标准品kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B精密称重并用流动相分别定容至容量瓶中，然后依次等倍稀释，得kobophenol A标准液，浓度依次为800、400、200、100、50、12.5μg/mL；(+)-α-viniferin和carasinol B标准液，浓度依次为320、160、80、40、20、10μg/mL；将各标准液在上述色谱条件下进行HPLC分析，得各浓度样品所对应的峰面积，然后以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标制作kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B的标准曲线(如图1所示)；经精密度考察、准确度考察及稳定性考察证实所述方法的可靠性；
金雀根提取物有效成分的含量测定，根据kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B的峰面积和标准曲线方程计算其在金雀根提取物中的质量百分比；确定金雀根提取物三者百分含量之和须不低于金雀根提取物50％时，为适宜作为抗骨质疏松药物。