一种检测骨代谢相关细胞因子的抗体芯片试剂盒的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种抗体芯片试剂盒，尤其是涉及一种骨代谢相关细胞因子的抗体芯片试剂盒。
背景技术：
：骨骼是持续行使重塑的代谢活动的组织，包括两个相对的过程即骨形成(成骨细胞)和骨吸收(破骨细胞)。在正常情况下，骨吸收与骨形成跟不同的激素(如pth、维生素d、类固醇和降钙素等)及内在调节因子(如细胞因子和生长因子等)紧密相关。骨吸收过程由rankl和m-csf调节，由opg抑制。骨形成由许多生物因子诱导，特别是bmps、fgf、pdgf和tgfβ；同时受m-csf、alp、骨钙素、骨桥蛋白和骨粘连蛋白的调控。骨吸收和骨形成的失衡导致骨代谢疾病，如骨质疏松症、骨关节炎、类风湿性关节炎和骨移位。检测骨代谢相关细胞因子常用的方法包括骨影像学检查和骨密度检查。骨影像学检查可以发现骨折以及其他病变，如骨关节炎、椎间盘疾病以及脊椎前移，但需在骨量下降30％以上才能观察到。骨密度检测是骨折的预测指标，测量特定部位的骨密度可以预测局部的骨折发生的危险性，但不能监测骨细胞代谢水平的变化情况。有鉴于此，有必要开发一种新型的骨代谢相关细胞因子定量检测试剂盒，以克服现有技术中亟待解决的问题，实现多种受体的高通量、高灵敏度、高特异性和低成本检测。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种检测骨代谢相关细胞因子的抗体芯片试剂盒，该试剂盒能够通过一次实验迅速、简捷和准确地测定31个蛋白质的表达水平，而不需要昂贵的检测仪器。本发明所述的检测骨代谢相关细胞因子的抗体芯片试剂盒包括：固相载体、样本稀释液、洗涤液、冻干蛋白标准品混合物、检测抗体混合物、结合链亲合素 的cy3染料底物、封口膜；其中，所述固相载体为包被特异性抗体的标准组织玻片；所述特异性抗体是针对选自以下骨代谢相关细胞因子的抗体：人激活素-a，酸性成纤维细胞生长因子，双调蛋白，碱性成纤维细胞生长因子，人骨形态发生蛋白-4，人骨形态发生蛋白-9，人e选择素，细胞间黏附分子-1，胰岛素样生长因子1，白细胞介素1α，白细胞介素1β，白细胞介素6，白细胞介素8，白细胞介素11，白细胞介素17，单核细胞趋化蛋白-1，巨噬细胞集落刺激因子，巨噬细胞炎性蛋白1α，基质金属蛋白酶2，基质金属蛋白酶9，基质金属蛋白酶13，骨活素，胎盘钙粘蛋白，核因子кβ受体活化因子，基质细胞衍生因子-1，人音猬因子n端，转化生长因子-β1，转化生长因子-β2，肿瘤坏死因子-α，血管细胞粘附分子-1，血管内皮钙粘蛋白。根据本发明所述的检测骨代谢相关细胞因子的抗体芯片试剂盒的进一步特征，所述固相载体为经过亲水试剂烷基糖苷处理的玻片。更优选地，所述亲水试剂为质量分数为0.01～0.2％的烷基糖苷、0.01～0.1％的甘油，0.01～0.05％的聚乙二醇4000的超纯水溶液；亲水试剂处理玻片的方法为将玻片在亲水试剂中浸泡3～5分钟，晾干即可。最优选地，所述亲水试剂为质量分数为0.1％的烷基糖苷、0.05％的甘油，0.01％的聚乙二醇4000的超纯水溶液；亲水试剂处理玻片的方法为将玻片在亲水试剂中浸泡3分钟，晾干即可。更优选地，所述骨代谢相关细胞因子检测抗体混合物在24℃、40％的湿度条件下点样到固相载体上。本发明所述的检测骨代谢相关细胞因子的抗体芯片试剂盒具有以下优点：(1)本发明选用没有空间限制的标准组织玻片作为载体，可使点在同一微阵列上检测骨代谢相关细胞因子的数目可以不受空间的限制。由于玻片具有非常低的自身荧光，而且荧光信号不具扩散性，不同点间的荧光信号不会彼此干扰，所以一次可以同时检测几十个因子。本发明采用抗体夹心法原理在玻片表面进行多重elisa反应，不仅一次可以检测多达几十个骨代谢相关细胞因子，并且所检测的骨代谢相关细胞因子灵敏度可达单因子的elisa检测灵敏度。定量抗体芯片平台采用多重夹心elisa的技术，使研发人员能够准确地同时测定多个骨代谢相关细胞因子的浓度。它结合了elisa高灵敏度和特异性的 优点，以及高通量的检测技术，将捕获抗体结合到固体载玻片上，加入样品孵育后再加入生物素标记的检测抗体，最后加入链霉亲和素-cy3标记物荧光染料进行激光扫描。不同于传统的elisa方法，定量抗体芯片采用阵列结构，使通过多重捕获抗体结合玻片的支持，实现了在一个玻片中同时检测多个骨代谢相关细胞因子。抗体芯片试剂盒通过类似于夹心法elisa的检测方法，用含cy3通道的激光扫描仪对反应结束的玻片进行扫描成像，选用合适的激光扫描参数使芯片上最高信号接近饱和，所得图像存储为tiff文件。然后用芯片读数软件将每个点的荧光信号转化为数码信号。通过梯度稀释的骨代谢相关细胞因子的标准样品的数码信号绘制每个骨代谢相关细胞因子的信号与浓度标准曲线，然后通过相应的标准曲线计算出每个骨代谢相关细胞因子在未知样品中的浓度。(2)克服了常规elisa在受体检测中的检测指标单一，耗时，耗力，耗材等缺点，同时也克服了现有多因子检测技术中的低通量，重复性差等弱点。本发明使用标准组织玻片作为表面载体，可以在玻片表面完成多重夹心elisa的反应。同时抗体芯片的规格符合标准96孔酶标板的尺寸，使得高通量样品操作成为可能。(3)本发明所述抗体芯片试剂盒所检测的受体的浓度可以达到单个elisa的检测灵敏度和精确度。(4)通过对本发明所述抗体芯片试剂盒在不同样品中介质回收率的测定，确定本发明的芯片试剂盒可以运用于血清、细胞上清液等不同的生物样品。(5)由于骨骼的正常发育与否可以通过检测参与骨骼代谢的因子来衡量，因此，本发明所述抗体芯片试剂盒实现了多因子的联合检测，可以从有限的样品中得到骨骼代谢因子的全方位图谱可用于骨骼疾病的诊断、疗效监测，并可用于骨骼代谢的机理研究。附图说明图1为本发明所述的抗体芯片点阵图。图2a至图2c为本发明所述的抗体对之间的交叉反应的测试结果。图3为灵敏度的实验结果。具体实施方式实施例1：抗体芯片载体的筛选。常规的抗体芯片多以硝酸纤维素膜为载体，由于硝酸纤维素膜是多层结构，芯片的洗涤难度大，以致芯片的背景高，结果波动大。同时硝酸纤维素膜易碎，不易于大规模的操作，用于大规模临床样本的使用还不普遍。而传统的玻片价廉背景低，这给诊断和研究领域的广泛使用带来了突破。我们筛选了市面上不用活性方法处理的玻片，无论是醛基化还氨基化的玻片点样效果不稳定。经过大量的筛查得出温度及玻片表面的活性试剂成分才是决定玻片点样效果的关键。采用以下5组的玻片：第1组为氨基化玻片，购自康宁公司，货号为ultragaps40019。第2组为醛基化玻片：将第1组玻片加入戊二醛浸泡40分钟制作醛基化玻片。第3组为apes玻片：将普通玻片加入丙酮稀释的apes中浸泡0.5至1分钟，再用纯丙酮清洗制成apes玻片。第4组为多聚赖氨酸玻片：将普通玻片加入pbs稀释的多聚赖氨酸浸泡0.5至1个小时，再用纯水清洗制成多聚赖氨酸玻片。第5组为经亲水试剂处理的玻片：将普通玻片用亲水试剂处理，亲水试剂为0.01至0.1％的烷基糖苷。各种玻片的点样效果不尽相同，加入亲水涂层的玻片点样效果较明显，点样效果较未处理过的高。其中经过氨基化及亲水处理的玻片较其他的类型效果较高。在20至26度条件下，膜玻/片点样效果较清晰，背景值低；而在27至30度条件下，无论何种膜/玻片的点样效果都出现扩散现象，温度湿度越高，扩散越明显。将上述5组玻片结合抗体后加入二抗及底物，在不同的温度及湿度条件下的灵敏度筛选结果如下表1：表1：综合以上指标，最终选择经过亲水试剂烷基糖苷处理的玻片作为固相载体。实施例2：本发明所述的抗体芯片试剂盒的制备。本发明所述的抗体芯片试剂盒包括以下组份：(1)结合31种特异性抗体的定量抗体芯片玻片。(2)样本稀释液：为通用的样本稀释液。2瓶用于稀释样本的15ml5x浓缩稀释液d，1瓶用于稀释抗体和hrp-链亲和素的15ml5x浓缩稀释液b。1x稀释液b为15mm,ph7.4的pbs缓冲液，溶质及其在所述稀释液b中的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下：0.5％酪蛋白，2-4％蔗糖，150mmnacl。1x稀释液d为15mm,ph6.5的pbs缓冲液，溶质及其在所述标本稀释液中的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下：2-4％蔗糖，150mmnacl。(3)洗涤液：为通用的洗涤液。含吐温20的20x浓缩洗涤液。1x洗涤液为ph7.2，含0.1％吐温20、0.1mol/l的磷酸盐缓冲液。(4)冻干蛋白标准品混合物：为经过筛选的目标蛋白混合物，可通过稀释作为梯度标准品。(5)检测抗体混合物：生物素化的检测抗体混合物。(6)结合链亲合素的cy3染料底物.(7)封口膜。为了检测样品中是否存在相应的骨代谢相关细胞因子，制备固定有针对于如下蛋白质的特异性抗体的玻片：人激活素-a(activina)、酸性成纤维细胞生长因子(afgf)、双调蛋白(ar)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、人骨形态发生蛋白-4(bmp-4)、人骨形态发生蛋白-9(bmp-9)、人e选择素(e-selectin)、细胞间黏附分子-1(icam-1)、胰岛素样生长因子1(igf-1)、白细胞介素1α(il-1α)、白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素8(il-8)、白细胞介素11(il-11)、白细胞介素17(il-17)、单核细胞趋化蛋白-1(mcp-1)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、巨噬细胞炎性蛋白1α(mip-1α)、基质金属蛋白酶2(mmp-2)、基质金属蛋白酶9(mmp-9)、基质金属蛋白酶13(mmp-13)、骨活素(osteoactivin)、胎盘钙粘蛋白(p-cadherin)、核因子кβ受体活化因子(rank)、基质细胞衍生因子-1(sdf-1α)、人音猬因子n端(shhn)、转化生长因子-β1(tgfβ1)、转化生长因子-β2(tgfβ2)、肿瘤坏死因子-α(tnf α)，血管细胞粘附分子-1(vcam-1)、血管内皮钙粘蛋白(ve-cadherin)。将以上各个蛋白质用含0.1％小牛白蛋白的磷酸缓冲液稀释后按照一定的量混合在一起，分装后用冷冻干燥法干燥并于－80℃保存。2、抗体芯片的制备与保存将含特异性抗体的pbs缓冲液(含有0.01-10g/100ml牛白蛋白)用全自动点样仪点样于玻片上。具体的芯片点阵以生物素标记的牛igg作为阳性对照。31种抗体及两种不同浓度的阳性对照在每个阵列中都有重复点。在本实施例中芯片阵列采用如图1所示的排布方式，但事实上，在其他实施例中，芯片阵列还可以以其它的排布方式进行组合，并不局限于如图所表示的形式。每张玻片上有16个相同的芯片阵列。将点样好的玻片放于室温条件下静置过夜，然后在干燥器中抽气干燥2小时。干燥后的玻片装上配套的16孔框架把一张玻片分割成16个互不干扰的小区。u形框夹从两侧将16孔框架，硅胶垫与标准载玻片卡贴紧在一起，以致标准载玻片贴紧封闭16孔框架的底部，使16孔框架上的每个小格形成一个小的反应孔,16孔框架边缘分别按照孔的位置标注1至16的凹陷数字以方便辨认。用粘性膜封闭框架后，把整张芯片用不透气的小袋封装然后于2℃到8℃保存备用。本实施例中，全自动点样仪为美国伯乐公司或铂金艾尔默公司生产的产品。当然，在发明技术方案的上述步骤中，仪器和材料的采用并不局限于本实施例的列举，而是以能够解决本发明的技术问题，并实现相应的技术效果为依据。实施例3：用本发明的试剂盒定量检测骨代谢相关细胞因子的实验。1.玻片芯片的完全干燥将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。2.对表1所示的骨代谢相关细胞因子蛋白梯度进行梯度稀释2.1添加500μl的样品稀释液到细胞因子标准混合物的小管中，重新溶解标准品。打开小管前，先快速的离心，轻轻的上下抽打溶解粉末，标记这个小管为管1。2.2分别标记6个干净的离心管为管2、管3到管7，添加200μl的样品稀释液到每个小管中。2.3抽取100μl的管1加入到管2中轻轻混合，然后从管2中抽取100μl加入到管3中，如此梯度稀释至管7。2.4抽取100μl的样品稀释液到另一个新的离心管中，标记为对照，作为阴性对照。注：因为每种细胞因子的起始浓度是不同的，所以管1到管7的梯度稀释后，每个细胞因子的系列浓度是不同的。表2：经梯度稀释后用于作标准曲线的骨代谢相关细胞因子标准品的浓度(pg/ml)对照管7管6管5管4管3管2管1activina0137412123537041111133333100000afgf0274823246974072222266667200000ar05164914844413334000bfgf014411233701111333310000bmp-4027822477412222666720000bmp-9027822477412222666720000e-selectin027822477412222666720000icam-1055165494148144441333340000igf-10137412123537041111133333100000il-1α03825742226672000il-1β013103089267800il-603825742226672000il-801251544133400il-11027822477412222666720000il-17014411233701111333310000mcp-103825742226672000m-csf05164914844413334000mip-1α014411233701111333310000mmp-130137412123537041111133333100000mmp-2014411233701111333310000mmp-9011339929688926678000osteoactivin014411233701111333310000p-cadherin0137412123537041111133333100000rank0137412123537041111133333100000sdf-1α014411233701111333310000shhn055165494148144441333340000tgfβ1055165494148144441333340000tgfβ20110329988296388892666780000tnfα03825742226672000vcam-10549164649381481544444133333400000ve-cadherin02748232469740722222666672000003.芯片操作流程3.1每个孔中加100μl的样品稀释液，室温摇床上孵育30分钟，封闭定量抗体芯片。3.2抽去每个孔中的缓冲液，添加100μl的标准液和样品到孔中，在摇床上4℃过夜孵育。注：不同样品的孵育量不一样：血浆、血清使用前用样品稀释液1：1稀释；细胞上清液可用原液；细胞或组织裂解液经蛋白浓度测定后加入5-50ug的量。3.3清洗抽去每个孔中的标准品或样品，1×洗液i清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液i。抽去每个孔中的1×洗液i，加入1×洗液ii清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液ii，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液ii。3.4检测抗体混合物的孵育离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小时。3.5清洗抽去每个孔中的检测抗体，1×洗液i清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干净洗液，然后加入1×洗液ii清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液ii，每次清洗要抽干净洗液。3.6cy3-链霉亲和素的孵育离心cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。3.7清洗抽去每个孔中的cy3-链霉亲和素，1×洗液i清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干净洗液。3.8荧光检测1)将玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面。2)将玻片放置在玻片清洗管中，添加约30ml的1×洗液i，能整个覆盖住玻片，在室温摇床上震荡15min，弃去1×洗液i，添加约30ml的1×洗液ii，在室温摇床上震荡5min。3)去除玻片的残留洗液。将玻片放置在玻片清洗管/干燥管中，不盖盖子，在1000rpm离心3min。4)采用激光扫描仪例如axongenepix扫描信号，采用cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)。3.9芯片的数据提取以及用分析软件来进行数据分析1)用genepix软件来读取生物芯片的荧光值。2)读数后选用的数值为扣除点周围背景的中间值读数(f532median-localbackground)。用特定的定量芯片软件来作每个骨代谢相关细胞因子蛋白的标准曲线。实施例4：抗体对之间的交叉反应测试抗体对之间的交叉反应测试是根据以下方法进行的。不同芯片首先与单个抗原浓度为100ng/ml的不同抗原孵育，洗片后再与每种抗原相对应的检测抗体反应。最后经cy3-链霉亲和素孵育，芯片扫描后读数。以每种抗原的捕获抗体为横轴，以加入的抗原和相对应的检测抗体为纵轴可以得到实验结果。实验结果见图2a至图2c，每种抗体对可以特异地识别自己的检测抗原，而与其他的抗原没有交叉反应。实施例5：实验体系的介质回收率。定量抗体芯片的在不同样品介质中的适用程度通过测定介质回收率来显示。在2倍稀释的正常人血清和2倍稀释的细胞上清液(cm)中分别加入不同浓度的各个骨代谢相关细胞因子，用该定量抗体芯片检测，然后计算样品的介质回收率：样品的介质回收率＝(介入样品的骨代谢相关细胞因子浓度-对照样品的骨代谢相关细胞因子浓度)/理论上介入的骨代谢相关细胞因子浓度。实验结果显示，本发明的试剂盒在人血清和细胞上清液中的回收率见表3。表3：灵敏度的实验结果见图3，横坐标显示各种蛋白的最低检测限。灵敏度实验为常规的elisa方法。当前第1页12