基于磁分离的夹层结构RNA型流感病毒拉曼探针及其制备方法和用途与流程

技术领域:

本发明属于生物医药领域，涉及流感病毒拉曼探针及其制备方法。具体而言，涉及基于磁分离的夹层(三明治式)结构rna型流感病毒拉曼探针及其制备方法，本发明还提供了使用该探针实现h1n1和h3n2的快速检出方法。

背景技术：

据报道，rna型流感病毒有极高的传染性、发病率和死亡率，严重威胁人类健康、生命安全，并影响全球经济。资料显示，季节性流感h1n1和h3n2主要感染上呼吸道，通常导致鼻液溢、发热、肌痛等临床症状，危险性较低；而高致病性禽流感h5n1和h7n9病毒不但能感染上呼吸道，还会感染肺、肠道和大脑等器官，造成更严重的疾病，最后危及病人的生命。有关研究公开了，在我国，禽流感疫情对人类健康保健以及社会保障体系产生了强烈影响，其广受社会和医学界关注。临床及流行病学研究实践显示，h1n1和h3n2等病毒是评价禽流感爆发水平的生物标志物，发展快速检测技术，准确预警禽流感疾病传染势态，引起了业内广泛的关注与研究。

目前，在医学实践中进行rna型流感病毒的实验室检测的方法主要靠核酸测序鉴定，该法能进行病因研究，通常相关检测技术需要耗时几个小时，不适合快速分析。基于此，本申请的发明人拟提供一种在现场快速检测流感病毒的方法。尤其是通过免疫纳米拉曼探针设计，构筑夹层的(三明治式)检测结构，利用可携带的拉曼光谱仪，进行现场快速检测流感病毒，进一步建立新的临床预警技术。

技术实现要素：
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本发明的目的是提供流感病毒拉曼探针及其制备方法，具体涉及一种基于磁分离的夹层(三明治式)结构rna型流感病毒拉曼探针及其制备方法；

本发明的另一目的是提供基于所制备的探针提供一种在现场快速检测流感病毒的方法，实现h1n1和h3n2的快速检出。

本发明通过下述技术方案实现，

通过设计免疫纳米拉曼探针，构筑夹层的检测结构(如图3所示)，本发明的实施例中，所述的纳米拉曼探针结构采用三明治式，可利用可携带的拉曼光谱仪，进行现场快速检测流感病毒，进一步用于建立新的临床预警技术。

更具体的，本发明的基于磁分离的夹层(三明治式)结构rna型流感病毒拉曼探针，由作为rna型流感病毒免疫金磁捕获纳米粒子和免疫金信号纳米粒子组成夹层(三明治式)结构rna型流感病毒拉曼探针，该探针利用磁分离能很好地分离基质干扰，借助可携带式拉曼光谱仪实现临床诊断现场的快速rna型流感病毒检出。

本发明中，合成两种纳米粒子，其中，一种具有磁性并修饰能捕获rna型流感病毒抗体，另一种是具备拉曼信号表达和抗体修饰，进一步形成三明治夹心结构，可利用便携式拉曼光谱仪，在5分钟内实现h1n1和h3n2的快速检出。

本发明中，免疫金磁捕获纳米粒子选自四氧化三铁磁性纳米粒子，通过三氯化铁、二氯化铁在碱性条件下利用共沉淀法制备，同时以植酸钠为桥连剂结合柠檬酸三钠还原制得金纳米粒子，形成金磁纳米粒子(形貌如图1所示)；向金磁纳米粒子中加入流感病毒多价抗体，以金-氮键结合抗体，包括；室温孵化；加入牛血清白蛋白封闭活性位点，室温再孵化；磁分离，洗涤，重新 分散在磷酸缓冲溶液中，得所述的免疫金磁捕获纳米粒子；透射电镜图显示制得的免疫金磁捕获纳米粒子成功合成。

本发明中，免疫金信号纳米粒子通过下述方法制备：

采用frens法，将金纳米粒子与4-巯基苯甲酸(4-mba)溶液混合，室温孵化，离心，弃去上层溶液，重新分散在pbs溶液中，加入n-羟基琥珀酰亚胺溶液和1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液溶液，再加入influenzaaigg，室温孵化，加入bsa溶液封闭活性位点，室温孵化，10000rpm离心，用pbs溶液洗涤，最后弃去上层溶液，重新分散在pbs溶液中，获得免疫金信号纳米粒子，图2显示了免疫金信号纳米粒子的透射电镜图，表明信号探针大小在30纳米左右，分散性良好。

本发明中，制得的免疫金磁捕获纳米粒子与rna型流感病毒发生特异性免疫反应，通过与免疫金信号纳米粒子孵化，构筑成三明治夹心结构。

本发明中，进行了现场高致病性禽流感h5n1和h7n9病毒等其它病毒的快速检测，将免疫金磁捕获纳米粒子和免疫金信号纳米粒子与灭活后的h3n2混合后，室温孵化，磁分离后pbs水洗，再磁分离后，直接进行拉曼检测，拉曼光谱结果显示，与控制组相比，在有h3n2和h1n1存在下，信号探针的拉曼信号有显著的增强，表明制得的磁性三明治结构免疫拉曼探针能实现rna型流感病毒快速捕获、分离和检测，借助p3实验室也可用于诊疗现场高致病性禽流感h5n1和h7n9病毒等其它病毒的快速检测。

本发明的优点是：

1、制备方法简单，可用于大批量合成免疫金磁捕获纳米粒子。

2、所选抗体是多克隆流感抗体，能结合多种rna型流感病毒，比如 h1n1、h3n24、h5n1和h7n9，既有针对性又有通用性。

3、免疫金信号纳米粒子中的4-mba既可以作为信号探针又可直接连接rna型流感病毒抗体。

4、该拉曼检测方法与磁性分离方法结合，可快速检出rna型流感病毒，文献中对病毒的检测尚无相关技术报道。

以下结合附图和本发明的优选实施例进一步卓明本发明，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

附图说明

图1是四氧化三铁/纳米金(免疫金磁捕获纳米粒子)的透射电镜图，表明已成功合成。

图2是纳米金(免疫金信号纳米粒子)的透射电镜图，表明信号探针大小在30纳米左右，分散性良好。

图3是检测示意图，免疫金磁捕获纳米粒子与rna型流感病毒发生特异性免疫反应，通过与免疫金信号纳米粒子孵化，构筑成三明治夹心结构。然后进行快速磁分离，通过可携带拉曼光谱仪器，在所选光谱条件下，实现快速流感病毒检出。

图4拉曼光谱中可以发现，与控制组相比，在有h3n2和h1n1存在下，信号探针的拉曼信号有显著的增强，可见该磁性三明治结构免疫拉曼探针能实现rna型流感病毒快速捕获、分离和检测，借助p3实验室也可用于诊疗现场高致病性禽流感h5n1和h7n9病毒等其它病毒的快速检测。

具体实施方式

实施例1制备基于磁分离的新型三明治结构rna型流感病毒拉曼探针(1)制备免疫金磁捕获纳米粒子：

三氯化铁、二氯化铁在碱性条件下利用共沉淀法制备：同时以植酸钠为桥连剂结合柠檬酸三钠还原所得的金纳米粒子，形成金磁纳米粒子(四氧化三铁磁性纳米粒子，如图1所示)；

向1－3ml金磁纳米粒子中加入5－15μl流感病毒多价抗体(influenzaaigg，150u/ml)，以金-氮键结合抗体，室温孵化30分钟，加入10μl牛血清白蛋白(bsa，5％w/v)封闭活性位点，室温孵化30分钟，磁分离，洗涤3-4次，重新分散在1ml磷酸缓冲溶液(pbs溶液，0.1m，ph＝7)中，即得免疫金磁捕获纳米粒子；

(2)免疫金信号纳米粒子：

采用frens法，将1－5ml金纳米粒子与2.5－7.5μl1mm4-巯基苯甲酸(4-mba)溶液混合，室温孵化30－50分钟，以10000rpm离心10min，弃去上层溶液，重新分散在1mlpbs溶液中，加入5μln-羟基琥珀酰亚胺溶液(nhs，100mm)和10μl1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液(edc，100mm)溶液，再加入5μlinfluenzaaigg(150u/ml)，室温孵化30分钟，加入10μlbsa溶液(5％w/v)封闭活性位点，室温孵化30分钟，以10000rpm离心15分钟，用pbs溶液洗涤3-4次，最后弃去上层溶液，重新分散在1mlpbs溶液中，即得免疫金信号纳米粒子(如图2所示)。

(3)快速检测病毒(检测流程如图3所示意)：

i.将1ml免疫金磁捕获纳米粒子和1ml免疫金信号纳米粒子与200μl灭活后h3n2(细胞培养基，滴度为1×10⁴tcid50/ml)充分混合，将1ml免疫金磁捕获纳米粒子和1ml免疫金信号纳米粒子与200μl灭活后h1n1(鸡胚培养液，滴度为5.62×10⁵tcid50/ml)充分混合；

ii.室温孵化1.5小时－2小时；

iii.磁分离后，pbs水洗3－5次；

iv、磁分离，滴在干净的铝箔纸上，待干后直接置于可携带拉曼仪器上进行拉曼检测(激光功率300mw，采样积分时间1－3s，累积次数为3－5次)。

结果显示，本发明检测方法中拉曼检测方法与磁性分离方法结合，所选抗体是多克隆流感抗体，能结合多种rna型流感病毒，比如h1n1、h3n24、h5n1和h7n9，既有针对性又有通用性，免疫金信号纳米粒子中的4-mba既可以作为信号探针又可直接连接rna型流感病毒抗体，可快速检出rna型流感病毒。