本发明涉及药物分析
技术领域：
，具体涉及一种银杏叶制剂中有效成分的鉴别方法，主要通过薄层色谱法定性分析银杏叶制剂中的有效成分，特别是分析黄酮类化合物。
背景技术：
：银杏(GinkgoBiloba)是目前世界上现存种子植物中最古老的一种，也是可追溯到2亿多年前二叠纪时的银杏家族的唯一幸存者。银杏叶的植药提取物在中国及很多国家都用于药物治疗，其药用价值非常高，具有拮抗血小板活化因子、清除自由基、抗炎、抗过敏、扩张血管、保护心脑血管、改善外周血液循环、降低血清胆固醇及辅助抗癌等多种药理学活性。银杏叶中的黄酮苷和萜类内酯是产生上述药理学活性的主要成分，也是银杏叶提取物中的主要有效成分和质量控制指标。银杏叶中的主要有效成分之一是黄酮类化合物，包括至少14种不同的化合物，例如黄酮醇、黄酮、黄烷酮和双黄酮等等，这些化合物中，黄酮苷和黄酮醇苷包括山奈素、槲皮素和异鼠李素与葡萄糖或鼠李糖结合物(统称总黄酮醇苷)，是市场上常用于治疗目的的银杏叶制剂中(例如等)最显著的成分，实验表明黄酮苷和黄酮醇苷为有力的抗氧剂，可清除氧自由基从而避免由于年龄老化而引起的细胞和组织损伤，它们会严重影响大脑功能，包括记忆力和注意力，参考文献如：J.Pincemail等人,LaPresseMedicaleVol.15(1996),1475-1479；J.Robak等人,BiochemPharmacolVol.37(1988),837-841；J.Kleijnen与P.KnipschildGinkgobiloba(DrugProfiles),theLancet340:1136(1992)。目前，临床或市售的各类银杏叶制剂(包括但不限于胶囊剂、注射剂、与其他药效成分联用的复方制剂等)中，主药成分为银杏叶或其提取物，也是将总黄酮醇苷和萜类内酯作为有效成分进行质量控制。现有银杏叶制剂的质量控制方法，参照中国药典的标准执行(详见2015版《中国药典》一部,P1491-1493)，总黄酮醇苷的薄层色谱鉴别步骤为：点样量：3μl，固定相：含4％醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为粘合剂的硅胶G板，展开剂：乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5:3:1:1)，显色剂：3％三氯化铝乙醇溶液，置于紫外光灯(365nm)下检视其荧光，检视结果见图1。该方法的不足之处在于：斑点间界限模糊，拖尾，成线条状，说明分离效果差，不利于鉴别，难以对银杏叶制剂中有效成分进行定性分析与质量控制。刘瑞明、郭莉等，在《中成药中银杏叶薄层色谱快速鉴别》一文(时珍国医国药,1999年第10卷第4期,P265)中提出一种快速鉴别银杏叶的方法，其薄层色谱的鉴别步骤为：点样量：10μl，固定相：硅胶G板，展开剂：正丁醇-醋酸-水(4:1:5)，置于紫外光灯(365nm)下检视其荧光，检视结果见图2(图2中序号1指复胆片，序号2指银杏叶对照药材，序号3指银杏叶胶囊)。该方法的不足之处在于：该方法不能对银杏叶提取物中的各有效成分进行分离，点板后的检视结果仅显现主斑点，仅表明产品含有银杏叶提取物，区分度差。CN1508542A公开了名为《银杏叶组合物及制备方法与应用》的中国发明专利，涉及一种鉴定和定量分析银杏叶制剂中的有效成分的方法，其黄酮的薄层色谱的鉴别步骤为：点样量：10μl，固定相：硅胶G板，展开剂：乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水(100:11:11:26)，显色剂：1％三氯化铝乙醇溶液，置于紫外光灯(365nm)下检视其荧光(详见说明书实施5部分)。该方法的不足之处在于：实施案例中仅文字描述检视结果显示有8个黄色斑点，并无图谱证明，无法判断鉴定的准确性。CN1939392A公开了名为《一种中药复方制剂的质量控制方法》的中国发明专利，涉及对总黄酮醇苷的鉴别测试方法，采用薄层色谱的鉴别步骤为：点样量：1～30μl，固定相：0.1～8％醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为粘合剂的硅胶G板，展开剂：乙酸乙酯/甲酸乙酯-丁酮/丙酮-甲醇/乙醇-水＝(1-20)：(0.5-10)：(0.1-5)：(0.1-5)，显色剂：0.5～10％三氯化铝乙醇溶液，置于紫外光灯(365nm)下检视其荧光(详见权4的d步骤、权5的d步骤和实施例6部分)。该方法的不足之处在于：从实施例6的展开剂筛选结果可知，仅仅当采用固定相：0.4％醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为粘合剂的硅胶G板、展开剂：乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(5:3:1:1)时，总黄酮醇苷的分离效果清晰，但存在边缘效应的缺陷。CN1772013A公开了名为《银杏达莫注射制剂的质量控制方法》的中国发明专利，涉及银杏叶注射剂中黄酮类物质的鉴别方法，其薄层色谱的鉴别步骤为：点样量：5～20μl，固定相：聚酰胺薄膜，展开剂：二氯甲烷-冰醋酸-50～99％乙醇＝(1～10)：(1～6)：(0.2～5)，显色剂：0.1～20％三氯化铝乙醇溶液，置于紫外光灯(365nm)下检视其荧光(详见说明书实施例1部分)。该方法的不足之处在于：展开剂的选择由于物质极性的差异，会使得在薄层板两边沿的浓度比在中间的低，导致比移值不合适，影响展析结果，不利于定性分析。综上所述，如何改进中国药典所规定的银杏叶制剂中有效成分的鉴别方法，提供一种适宜的鉴别方法，尤其是选择一种合适的展开剂，能够准确鉴别银杏叶制剂中各类有效成分(黄酮类)，实现对有效成分的定性分析，是本领域技术人员尚未攻克的技术难题。技术实现要素：本发明目的在于提供了一种银杏叶制剂中有效成分的鉴别方法，改进了现有的薄层色谱条件，使得黄酮类有效成分能够清晰分离、精准鉴别，且方法重现性好，解决了现有技术存在的上述缺陷。本发明所采用的技术方案具体如下：一种银杏叶制剂中有效成分的鉴别方法，包括如下步骤：(1)供试品的制备：取待测银杏叶制剂适量，加正丁醇提取、过滤，滤液蒸干，残渣加乙醇使溶解，作为供试品溶液；(2)对照品的制备：取银杏叶对照制剂适量，加正丁醇提取、过滤，滤液蒸干，残渣加乙醇使溶解，作为对照品溶液；(3)薄层色谱层析：吸取供试品溶液和对照品溶液各1～10μl，分别点样于同一硅胶G板，以乙酸乙酯、异丙醇、甲醇和水的混合物展开，取出薄板、空气中晾干，喷以1～5％三氯化铝乙醇溶液，置于365nm紫外光灯检视荧光，观察斑点；其中，硅胶G板为以含4％醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为粘合剂的硅胶G薄层板，展开剂中各组分的体积比为乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水＝(1～4)：(6～9)：(0.5～1)：(1～2)。优选的，步骤(1)和步骤(2)中，加正丁醇15ml，温浸15分钟并时时振摇，放冷，过滤，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解。优选的，步骤(3)中，供试品溶液、对照品溶液的点样量为3μl。优选的，步骤(3)中，显色剂为3％三氯化铝乙醇溶液。优选的，步骤(3)中，展开剂的各组分及体积比为乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水＝2:6:1:1。本发明中采用薄层色谱鉴别银杏叶制剂有效成分的原理为：根据组分(即各有效成分，下同)在吸附剂和展开剂中的吸附系数不同，在薄层板上进行无数次吸附，解吸附，再吸附，再解吸附，吸附系数大的在板上的移动速度慢，吸附系数小的在板上移动速度快，在薄层板上产生差速迁移为得到分离。因此吸附剂与展开剂的选择往往是决定试验成功与否的重要因素。具体到本发明中，由于吸附剂通常为硅胶G板，替换选择的可能性较低，而展开剂的选择对分离效果、分离时间、斑点形状等影响较大，故选择合适的展开剂非常关键。我们知道，在薄层色谱过程中，色谱条件的确定、色谱结果的判断是非常重要的，而色谱斑点的好坏是判断色谱结果的关键。选择不合适的展开剂会出现拖尾、边缘效应、比移值不合适等情况，严重干扰色谱结果的判断，影响样品鉴别的准确性及可靠性。例如展开剂的pH值会影响样液中酸、碱成分在其中的解离形式，不同形式的物质极性不同，在薄层板上移动的速度就不同，容易造成拖尾现象。又例如在使用混合溶剂展开时，极性较弱和沸点较低的展开剂在薄层板两边沿处较易挥发，致使在薄层板两边沿的浓度比在中间的低，板上展开剂的比例不一致(即比移值不合适)，极性发生改变，展析结果容易产生边缘效应。因此，发明人在选择展开剂时，是根据组分的极性、吸附剂的活度、展开剂的极性这三者的相对关系进行选择，通过组分分子与展开剂分子争夺吸附剂表面活性中心而得到分离；在充分考虑各种影响因素的基础上，经多次创造性的实验探索，才筛选出适合本发明鉴别方法的专属展开剂，具有创新价值。需要补充说明的是，本发明所涉及的银杏叶制剂有效成分，是指黄酮类化合物，具体涉及槲皮素、山奈素、异鼠李素这三种成分，这三种成分也是目前学术界判断药理活性的共识成分。总之，本发明提供的银杏叶制剂中有效成分的鉴别方法，改进了现有技术的薄层色谱条件，筛选恰当的展开剂，使得银杏叶制剂的有效成分在鉴别过程中分离效果好、斑点清晰、比移值适中，能够准确鉴别各有效成分，有利于定性分析和质量控制；而且该鉴别方法的重现性好、通用性强，可适用于市售的各类银杏叶制剂的有效成分鉴别，应用价值大。附图说明1、图1为采用中国药典方法的薄层色谱检视结果图。2、图2为采用文献《中成药中银杏叶薄层色谱快速鉴别》方法的薄层色谱检视结果图。3、图3为实施例1采用本发明方法的薄层色谱检视结果图。具体实施方式实施例1银杏叶制剂有效成分的鉴别方法(1)供试品的制备：取待测银杏叶制剂适量(约相当于总黄酮醇苷48mg)，加正丁醇15ml提取，温浸15分钟并时时振摇，放冷，过滤，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；(2)对照品的制备：取银杏叶对照制剂适量(约0.2mg)，加正丁醇15ml提取，温浸15分钟并时时振摇，放冷，过滤，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为对照品溶液；(3)薄层色谱层析：吸取供试品溶液和对照品溶液各3μl，分别点样于同一以含4％醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为粘合剂的硅胶G薄层板，以乙酸乙酯、异丙醇、甲醇和水的混合物展开，展开剂的各组分及体积比：乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水＝2:6:1:1，取出薄板、空气中晾干，喷以3％三氯化铝乙醇溶液，置于365nm紫外光灯检视荧光，观察斑点。检视结果见图3，清晰显示有3个斑点，分别对应为槲皮素、山奈素、异鼠李素。实施例2银杏叶制剂有效成分的鉴别方法本实施例中，薄层色谱层析的条件改成：点样量为10μl，展开剂为乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水＝4:9:0.5:2，显色剂为5％三氯化铝乙醇溶液，其余鉴别步骤参照实施例1。检视结果清晰显示有3个斑点。实施例3银杏叶制剂有效成分的鉴别方法本实施例中，薄层色谱层析的条件改成：点样量为1μl，展开剂为乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水＝1:6:1:1，显色剂为1％三氯化铝乙醇溶液，其余鉴别步骤参照实施例1。检视结果清晰显示有3个斑点。实施例4展开剂的筛选由于银杏叶制剂有效成分之槲皮素、山奈素、异鼠李素的理化性质各不相同，且极性差异的影响对于点板、分离甚为关键，加上可能存在的阴性干扰，普通条件难以达到精准鉴别的要求，为此发明人根据相似相容原则进行展开剂影响因素的考察，以筛选合适的展开剂。考察方法参照本发明提供的鉴别方法实行，仅替换各种展开剂，其他实验条件不变，筛选结果见下表所示。序号条件现象1乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水＝5:3:1:1斑点间界限模糊，拖尾，成线条状2乙酸乙酯-甲醇-水-正己烷＝10:2:1:5斑点间界限模糊，拖尾，成线条状3乙酸乙酯-乙酸-正己烷＝5:3:1对照品展开至前沿4乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水＝2:6:1:1分离最清晰，Rf值最适中，阴性无干扰5乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水＝4:9:0.5:2分离清晰，Rf值适中，阴性无干扰6乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水＝1:6:1:1分离清晰，Rf值适中，阴性无干扰上述列表中，序号1对应中国药典，序号4-6对应本发明实施例1-3，可知：当选择以含4％醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为粘合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水＝2:6:1:1为展开剂时，展开效果最佳，此时三种有效成分的分离最清晰，Rf值最适中，阴性无干扰。当前第1页1 2 3