一种基于OMP18检测空肠弯曲菌的ELISA检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明属生物医药和医学检验技术领域，涉及免疫化学检测技术，具体涉及一种空肠弯曲菌免疫学检测试剂盒，更具体涉及一种基于OMP18的B细胞抗原表位的空肠弯曲菌的ELISA检测试剂盒及其制备方法

背景技术：

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是常见的人兽共患病病原菌，广泛存在于鸟、禽、狗、猫等动物体内，也是一种食物源性病原菌，可通过污染禽畜肉和代谢产品及未经消毒处理的水而导致感染，如未煮熟的鸡肉、巴氏杀菌不彻底的牛奶、蛋制品、生火腿等。另外，空肠弯曲菌在牛、羊、狗等畜禽的生殖道和肠道内大量存在，故可通过分娩或排泄物污染食物和饮水。

空肠弯曲菌能引起人类多种疾病，例如，急性肠炎、格林-巴利综合症，被认为是人类细菌性腹泻的主要致病菌之一，是全球范围内重要的人兽共患细菌性肠道病原菌，其感染率在世界各地普遍呈上升趋势。空肠弯曲菌致病性强，人群普遍易感，5岁以下儿童的发病率最高，苍蝇亦起重要的媒介作用，亦可经接触感染，同时感染的产妇可在分娩时传染给胎儿。

在食品加工、贮存和运输过程中的冷、热、日照和氧气等均可对空肠弯曲菌造成损害，但食品中的空肠弯曲菌往往数量少且活性较低，常规方法不易检测得到。另外，空肠弯曲菌体外培养困难，生长条件要求苛刻，常规培养方法对于快速准确的检测与鉴定有一定的难度。体外培养难度大和待检测物数量少给快速正确检测带来挑战。近年来，核酸分子杂交技术和PCR等分子生物学检测方法取得了很大进展，国内外已先后开展了一些针对空肠弯曲菌的基因检测，针对的靶基因主要包括16S rDNA、3S rDNA、hipO、鞭毛蛋白基因(flaA或flaB)等，基于PCR扩增技术的检测方法为核酸水平检测空肠弯曲菌提供了有效的检测手段，但由于采用PCR方法需要对病原菌的数量有要求，提取致病菌的DNA片段，对操作者有一定专业背景的要求，同时从准备到得到检测结果时间较长，不能满足快速准确的检测要求。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种基于OMP18的B细胞抗原表位多肽检测空肠弯曲菌的酶联免疫试剂盒，使所述试剂盒满足对空肠弯曲菌进行快速检测报告的需求。

本发明提供了一种基于OMP18的B细胞抗原表位多肽检测空肠弯曲菌的酶联免疫试剂盒，包括以下组分：

(1)包被有OMP18的B细胞抗原表位多肽的检测板；

(2)洗涤液；

(3)二抗酶标记的兔抗IgG溶液；

(4)终止液；

(5)样品稀释液；

(6)底物显色液。

优选的，所述的检测板为真空密封包装。

优选的，所述终止液为1～2mol/L的硫酸溶液或2～3mol/L的氢氧化钠溶液。

优选的，所述样品稀释液为pH值7.4～8.0、摩尔浓度0.1～0.25mol/L、含有45～50％甲醇的磷酸盐缓冲液。

优选的，所述OMP18的B细胞抗原表位多肽抗原的包被浓度为4～9μg/ml。

优选的，所述酶标记兔抗IgG所使用的酶为HRP，所述底物显色液为TMB。

优选的，所述洗涤液为包含0.05～0.1％Tween 20的PBS溶液。

优选的，所述空肠弯曲菌OMP18的B细胞抗原表位多肽的A抗原表位氨基酸序列为STKSTSVSGDSSVDSNRGSGGSDGWDID。

所述空肠弯曲菌OMP18的B细胞抗原表位多肽的B抗原表位肽序列为EGNCDEWGTDEY。

优选的，所述空肠弯曲菌OMP18的B细胞抗原表位多肽的C抗原表位肽序列为SYGETNPVCTEKTKACDAQNRR。

本发明提供了上述技术方案所述的试剂盒在检测空肠弯曲菌中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

a、将待测样品进行前处理；

b、将所述步骤a处理后的待测样品加入已经包被有OMP18的B细胞抗原表位多肽的检测板孔内，混合，孵育，用洗涤液洗涤；

c、所述检测板孔加入二抗溶液，混合，孵育，用洗涤液洗涤；

d、加入底物显色液，孵育，加入终止液混匀，测定OD值。

本发明提供了一种基于OMP18的B细胞抗原表位多肽检测空肠弯曲菌的酶联免疫试剂盒，包括包被有OMP18的B细胞抗原表位多肽的检测板、洗涤液、二抗酶标记的兔抗IgG溶液、终止液、样品稀释液和底物显色液。本发明是以OMP18的B细胞抗原表位多肽为包被抗原，根据间接法的免疫反应原理，基于OMP18的B细胞抗原表位多肽来检测空肠弯曲菌。本发明提供的试剂盒便于携带和保存；操作方便，方法稳定、结果准确，为临床诊断和治疗检测的使用提供极大的方便，同时检测快速，满足临床上快速检测的需要。

附图说明

图1为3个OMP18的B细胞抗原表位多肽免疫反应性检测结果柱状图

图2为3个OMP18的B细胞抗原表位多肽免疫特异性检测结果柱状图

具体实施方式

本发明提供了一种基于OMP18的B细胞抗原表位多肽检测空肠弯曲菌的酶联免疫试剂盒，包括以下组分：(1)包被有OMP18的B细胞抗原表位多肽的检测板；(2)洗涤液；(3)二抗酶标记的兔抗IgG溶液；(4)终止液；(5)样品稀释液；(6)底物显色液。

本发明提供的酶联免疫试剂盒，通过将OMP18的B细胞抗原表位多肽作为包被抗原，来检测空肠弯曲菌是否存在。本发明所述试剂盒具有良好的重复性、特异性、敏感性特点，能应用于实验室对空肠弯曲菌的鉴别分析，对于空肠弯曲菌的检测预防具有一定的意义。

本发明提供的酶联免疫试剂盒包括包被有OMP18的B细胞抗原表位多肽的检测板。本发明对所述检测板的结构没有特殊限制，本领域技术人员熟知的检测板均可以使用，在本领域技术人员熟知的检测板中包被OMP18的B细胞抗原表位多肽即可。本发明中所述检测板，采用真空密封包装。

在本发明中，所述检测板中包被有OMP18的B细胞抗原表位多肽。所述空肠弯曲菌OMP18的B细胞抗原表位多肽的A抗原表位的氨基酸序列为STKSTSVSGDSSVDSNRGSGGSDGWDID；所述空肠弯曲菌OMP18的B细胞抗原表位多肽的B抗原表位肽的氨基酸序列为EGNCDEWGTDEY；所述空肠弯曲菌OMP18的B细胞抗原表位多肽的C抗原表位肽的氨基酸序列为SYGETNPVCTEKTKACDAQNRR。

在本发明中，所述的OMP18的B细胞抗原表位多肽抗原的包被浓度优选为4～9μg/ml，更优选为5～8μg/ml。本发明对所述OMP18的B细胞抗原表位多肽的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员所熟知的OMP18的B细胞抗原表位多肽获取方法即可，本申请实施例采用悬浮芯片技术获得OMP18的B细胞抗原表位多肽。

在本发明中，所述OMP18的B细胞抗原表位多肽的制备方法具体优选：采用固相多肽合成技术，以N-α-Fmoc保护的氨基酸为原料，Fmoc-AA-Wang树脂为载体，HBTU方法偶联后获得多肽粗品，将粗品多肽分析鉴定后，采用制备型反相液相色谱(RP-HPLC)法进行纯化，并以HPLC和MS分析鉴定。

本发明提供的酶联免疫试剂盒包括洗涤液。在本发明中，所述洗涤液优选为包含0.05～0.1％Tween 20的PBS溶液。本发明对所述洗涤液的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的PBS溶液的即可，本申请实施例中所用PBS溶液自行制备。

本发明提供的酶联免疫试剂盒包括终止液。所述终止液为1～2mol/L的硫酸溶液或2～3mol/L的氢氧化钠溶液。本发明对所述终止液的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的终止液即可，本申请实施例中所用终止液为自己配置得到。

本发明提供的酶联免疫试剂盒包括样品稀释液。所述样品稀释液为pH值7.4～8.0、摩尔浓度0.1～0.25mol/L、含有45～50％甲醇的磷酸盐缓冲液。本发明对所述样品稀释液的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的样品稀释液即可，本申请实施例中所用样品稀释液为自己配制得到。

本发明提供的酶联免疫试剂盒包括二抗酶标记兔抗IgG。所述二抗酶标记兔抗IgG所使用的酶为HRP。本发明对所述酶标记兔抗IgG的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的酶标记兔抗IgG即可，本申请实施例中所用酶标记兔抗IgG购自杭州泽衡生物科技有限公司。

本发明提供的试剂盒包括底物显色液。在本发明中，所述底物显色液优选为TMB(3,3,5,5-四甲基联苯胺)。

本发明提供了上述技术方案所述的试剂盒在检测空肠弯曲菌中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

a、将待测样品进行前处理；

b、将所述步骤a处理后的待测样品加入已经包被有OMP18的B细胞抗原表位多肽的检测板孔内，混合，进行第一次孵育，用洗涤液进行第一次洗涤；

c、所述检测板孔加入二抗溶液，混合，进行第二次孵育，用洗涤液进行第二次洗涤；

d、加入底物显色液，进行第三次孵育，加入终止液混匀，测定OD值。

在本发明中，所述前处理为将待测样品进行稀释。本发明对所述稀释的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员公知所熟知的稀释的技术方案即可。所述样品的稀释度优选为1：10～100。

所述前处理后，本发明将经过所述前处理的样品加入已经包被有OMP18的B细胞抗原表位多肽的检测板孔内，混合，进行第一次孵育。在本发明中，所述第一次孵育的环境温度优选为35～38℃，更优选37℃；所述第一次孵育的时间优选20～35min，更有选为30min。

孵育完成后，本发明采用洗涤液对检测板进行第一次洗涤。在本发明中，所述第一次洗涤的次数优选为4～5次。

洗涤液进行第一次洗涤后，本发明向所述洗涤后的检测板中加入二抗溶液，所述二抗溶液的加入量与样品加入量按体积比为1：1～2，所述二抗溶液的质量浓度为2mg/ml，混合，进行第二次孵育。在本发明中，所述第二次孵育的环境优选为37℃，孵育时间优选为30min。

本发明在第二次孵育完成后对检测板进行第二次洗涤。在本发明中，所述第二次洗涤的次数优选为4～5次。

向洗涤后的检测板加入底物显色液，进行第三次孵育。在本发明中，所述底物显色液的用量与样品加入量按体积比为1：1。在本发明中，所述三次孵育的条件与上述技术方案所述第一次孵育条件相同。

所述第三次孵育后，本发明向所述检测板中加入终止液混匀，对检测板测定OD值。在本发明中，所述终止液的用量为50μl；所述测定OD值在450nm波长下进行测定。

为了验证OMP18的B细胞抗原表位多肽作为包被抗原是否适用于检测空肠弯曲菌的实验，本发明对OMP18的B细胞抗原表位多肽的免疫反应性进行测定，包括下列步骤：

1)用包被液稀释抗原OMP18的B细胞抗原表位多肽，将所述稀释后的抗原加入到检测板中，过夜，用BSA作为包被抗原进行阴性对照；

2)将所述步骤1)得到的包被有抗原的检测板进行洗涤，空干后，向包被有抗原的检测板中加入封闭液，封闭过夜，次日对检测板进行洗涤，密封；

3)向所述步骤2)所得检测板加入一抗兔抗空肠弯曲菌全菌IgG，孵育，然后倒掉兔抗空肠弯曲菌全菌IgG，加洗涤液洗涤，加入稀释后的酶标记的羊抗兔IgG二抗溶液，孵育，倒掉所述二抗溶液洗涤，加入底物显色，检测OD值；

4)根据阴性对照样本OD值+3SD作为阳性判断标准。

本发明用包被液稀释抗原OMP18的B细胞抗原表位多肽。在本发明中，所述抗原的稀释度优选为1:1000～64000，更有选为1∶1000、1∶4000、1∶16000、1∶64000。

在本发明中，阴性对照使用的BSA的浓度、体积、稀释度与所述OMP18的B细胞抗原表位多肽的浓度稀释度体积相同。

得到包被有所述抗原的检测板后，在4℃条件下加入封闭液200～300μl，优选为300μl，所述封闭的时间为12～14h。

所述封闭液为质量浓度为5％的小牛血清溶液。本发明对所述小牛血清的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的小牛血清即可，本申请实施例中所用的小牛血清的来源为市售的商品。

封闭后，本发明向所述检测板中加入洗涤液进行第一次洗涤。本发明中，所述第一次洗涤在室温下进行；洗涤次数优选为3～6次，更有选为4～5次；洗涤液加入量为50μl。

所述洗涤液为包含0.05％Tween 20的PBS溶液。本发明对所述洗涤液的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的PBS溶液的即可，本申请实施例中所用PBS溶液为自己配置得到。

完成第一次洗涤后，本发明向所述封闭后的检测板中加入一抗兔抗空肠弯曲菌全菌IgG。在本发明中，所述一抗的稀释度优选为1:3000。

所述加入一抗后孵育的温度优选为35～38℃，更优选37℃，所述孵育的时间优选20～35min。更优选为30min。

加入一抗孵育后，本发明向检测板加入洗涤液进行第二次洗涤。在本发明中，第二次洗涤与第一次洗涤方法相同。

第二次洗涤后，本发明向检测板中加入稀释后的酶标记的羊抗兔IgG二抗溶液。在本发明中，所述二抗溶液的稀释度优选为1:8000～12000，更优选为1：10000；所述二抗溶液的加入量为50μl。

加入二抗后的孵育条件为温度优选为35～38℃，更优选37℃，所述孵育的时间优选20～35min，更有选为30min；所述孵育时间内静置，避免发生晃动。

加入二抗孵育后，本发明向检测板中加入洗涤液进行第三次洗涤。在本发明中，第三次洗涤与第一次洗涤方法相同。

第三次洗涤后，本发明向检测板中加入底物显色。在本发明中，加入底物为TMB，对所述加入底物的量和底物的浓度没有特殊要求，为本领域技术人员所熟知的底物浓度即可。

所述底物为TMB。本发明对所述TMB的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的TMB即可，本申请实施例中所用的TMB来源为市售的商品。

加入底物后，对检测板进行OD值检测。在本发明中，对检测板进行OD值检测所采用的酶标仪种类和型号没有特殊限制，为本领域技术人员所熟知的酶标仪即可。所述检测的波长为450nm。

为了验证OMP18的B细胞抗原表位多肽作为包被抗原是否适用于检测空肠弯曲菌的实验，还对OMP18的B细胞抗原表位多肽的免疫特异性进行测定，具体包括下列步骤：

a)将抗原表位肽包被于检测板中，包被过夜，采用BSA溶液作为阴性对照；

b)将所述步骤a)所得包被抗原用洗涤液洗涤，然后用封闭液封闭过夜，对检测板进行洗涤，然后密封；

c)将所述步骤b)所得检测板加入稀释的一抗空肠弯曲菌全菌兔抗IgG溶液，孵育，然后倒掉所述一抗空肠弯曲菌全菌兔抗IgG溶液，加洗涤液洗涤，向检测板加入稀释后的酶标记的兔抗IgG二抗溶液，孵育，倒掉所述二抗溶液，洗涤，向检测板加入底物显色，检测OD值；

d)根据阴性对照样本OD值+3SD作为阳性判断标准。

本发明用包被液稀释抗原OMP18的B细胞抗原表位多肽。在本发明中，所述抗原的稀释度优选为1∶64000。

在本发明中，阴性对照使用的BSA的浓度、体积、稀释度与所述OMP18的B细胞抗原表位多肽的浓度稀释度体积相同。

得到包被有所述抗原的检测板后，在4℃条件下加入封闭液200～300μl，优选为300μl，所述封闭的时间为12～14h。

所述封闭液为质量浓度为5％的小牛血清溶液。本发明对所述小牛血清的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的小牛血清即可，本申请实施例中所用的小牛血清的来源为市售的商品。

封闭后，本发明向所述检测板中加入洗涤液进行第一次洗涤。本发明中，所述第一次洗涤在室温下进行；洗涤次数优选为3～6次，更有选为4～5次。

所述洗涤液为包含0.05％Tween 20的PBS溶液。本发明对所述洗涤液的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的PBS溶液的即可，本申请实施例中所用PBS溶液为自己配置得到。

完成第一次洗涤后，本发明向所述封闭后的检测板中加入一抗兔抗空肠弯曲菌全菌IgG。在本发明中，所述一抗的稀释度优选为1:3000。

所述加入一抗后孵育的温度优选为35-38℃，更优选37℃，所述孵育的时间优选20～35min。更优选为30min。

所述一抗溶液分别为空肠弯曲菌感染兔血清、健康兔血清、大肠埃希菌感染兔血清、痢疾志贺菌感染兔血清和伤寒沙门菌感染兔血清。本发明对所述一抗的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的所述一抗即可，本申请实施例中所用的所述一抗的来源为市售的商品。

加入一抗孵育后，本发明向检测板加入洗涤液进行第二次洗涤。在本发明中，第二次洗涤与第一次洗涤方法相同。

第二次洗涤后，本发明向检测板中加入稀释后的酶标记的羊抗兔IgG二抗溶液。在本发明中，所述二抗溶液的稀释度优选为1:8000～12000，更优选为1：10000。

加入二抗后的孵育条件为温度优选为35～38℃，更优选37℃，所述孵育的时间优选20～35min，更有选为30min，

加入二抗孵育后，本发明向检测板中加入洗涤液进行第三次洗涤。在本发明中，第三次洗涤与第一次洗涤方法相同。

第三次洗涤后，本发明向检测板中加入底物显色。在本发明中，加入底物为TMB，对所述加入底物的量和底物的浓度没有特殊要求，为本领域技术人员所熟知的底物浓度即可。

所述底物为TMB。本发明对所述TMB的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的TMB即可，本申请实施例中所用的TMB来源为市售的商品。

加入底物后，对检测板进行OD值检测。在本发明中，对检测板进行OD值检测所采用的酶标仪种类和型号没有特殊限制，为本领域技术人员所熟知的酶标仪即可。所述检测的波长为450nm。

结果显示OMP18的B细胞抗原三个表位多肽在稀释度在1∶1000、1∶4000、1∶16000、1∶64000时免疫反应性均有明显增高，其中稀释度在1∶1000时增高最明显；与此同时，三个OMP18的B细胞抗原表位多肽具有较好的免疫特异性，因此，三个OMP18的B细胞抗原表位多肽可以作为包被抗原对空肠弯曲菌感染的血清进行ELISA检测。

下面结合实施例对本发明提供的酶联免疫试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

采用TMHMM Server V2.0,DNA Star，NCBI/Blast等生物信息分析软件和工具分析了空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的结构和分子特征，域预测蛋白功能结构表明OMP18中存在OMP A结构域，并与空肠弯曲菌的粘附能力密切相关。二级结构分析结果显示，在OMP18蛋白中有3个线性B细胞表位，其具有良好的抗原性和亲水性，采用悬浮芯片技术，具体用固相多肽合成技术，以N-α-Fmoc保护的氨基酸为原料，Fmoc-AA-Wang树脂为载体，HBTU方法偶联后获得多肽粗品，将粗品多肽分析鉴定后，采用制备型反相液相色谱(RP-HPLC)法进行纯化，并以HPLC和MS分析鉴定，筛选出3个空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的B细胞线性抗原表位多肽。

经测序发现，所述空肠弯曲菌OMP18的B细胞抗原表位多肽的A抗原表位氨基酸序列为STKSTSVSGDSSVDSNRGSGGSDGWDID；所述空肠弯曲菌OMP18的B细胞抗原表位多肽的B抗原表位肽序列为EGNCDEWGTDEY；所述空肠弯曲菌OMP18的B细胞抗原表位多肽的C抗原表位肽序列为SYGETNPVCTEKTKACDAQNRR。

实施例2

OMP18的B细胞抗原表位多肽免疫反应性测定方法，包括以下步骤：

1)实施例1得到的三种抗原表位多肽分别为A抗原、B抗原、C抗原，对每种抗原进行按照1:1000，1:4000，1:16000，1:64000的比例进行稀释，以OMP18Pro为阳性对照；

2)向96孔酶标板各孔中加入50μL上述稀释度的抗原，4℃包被过夜，各抗原表位肽样本均重复三孔，等量BSA为包被抗原的阴性对照；

3)次日用含0.05％Tween 20的PBS洗涤4次，然后用5％小牛血清4℃封闭过夜；

4)将封闭后的酶标板以1:3000稀释的50ul的兔抗空肠弯曲菌全菌IgG一抗溶液，37℃孵育30min；

5)孵育完成后酶标板弃去未反应的一抗溶液，用含0.05％Tween 20的PBS洗涤5次；

6)向洗涤后的酶标板加入1:10000稀释的50ul质量浓度的2mg/ml HRP标记的羊抗兔IgG二抗溶液，37℃孵育30min；

7)孵育完成后的酶标板弃去未反应的二抗溶液，洗涤4次，加入底物MB，450nm波长下测定OD值。

8)以阴性对照样本OD值+3SD(SD是指OD值的标准差)作为阳性判断标准。

实验结果如下所示，表1为不同梯度浓度的3个OMP18的B细胞抗原表位多肽免疫反应性ELISA检测OD值。

表1不同梯度浓度的3个OMP18的B细胞抗原表位多肽免疫反应性ELISA检测OD值

实施例3

OMP18的B细胞抗原表位多肽免疫特异性测定方法，包括以下步骤：

a)向96孔酶标板中加入1:64000比例稀释的50μl上述三种OMP18的B细胞抗原表位多肽溶液，4℃包被于检测板中过夜，各抗原表位肽样本均重复三孔,采用BSA溶液作为阴性对照；

b)将所述步骤a)所得包被有抗原的酶标板用含0.05％Tween20的PBS洗涤5次，然后用5％小牛血清4℃封闭过夜；

c)将所述步骤b)所得检测板中分别加入稀释的空肠弯曲菌感染兔血清、健康兔血清、大肠埃希菌感染兔血清、痢疾志贺菌感染兔血清和伤寒沙门菌感染兔血清各50ul，37℃孵育30min；

d)孵育后的酶标板倒掉所述抗液，用含0.05％Tween 20的PBS洗涤5次；

e)向检测板加入1:10000稀释的稀释后50ul质量浓度的2mg/ml的HRP标记的兔抗IgG二抗溶液，37℃孵育30min，

f)孵育后的酶标板倒掉未反应完成的二抗溶液，用含0.05％Tween 20的PBS洗涤5次，向检测板加入底物TMB显色，450nm波长下测定OD值；

g)根据阴性对照样本OD值+3SD作为阳性判断标准。

实验结果如下表2所示，表2为3个OMP18的B细胞抗原表位多肽免疫特异性ELISA检测OD值。

表2 3个OMP18的B细胞抗原表位多肽免疫特异性ELISA检测OD值

由以上实施例可知，结果显示OMP18的B细胞抗原三个表位多肽在稀释度在1∶1000、1∶4000、1∶16000、1∶64000时免疫反应性均有明显增高，其中稀释度在1∶1000时增高最明显；与此同时，三个OMP18的B细胞抗原表位多肽具有较好的免疫特异性，因此，三个OMP18的B细胞抗原表位多肽可以作为包被抗原对空肠弯曲菌感染的血清进行ELISA检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。