一种一步均相SAA检测试剂盒及其制备和使用方法与流程

本发明涉及SAA含量检测领域，具体涉及一种一步均相SAA检测试剂盒及其制备和使用方法。

背景技术：

血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A protein，SAA)是一种急性时相反应蛋白，属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质，相对分子量约为12 000。SAA基因具有4个外显子，3个内含子，长约3.20kb，与其他大多数载脂蛋白的基因一样。目前已发现的4种人SAA基因均位于11号染色体上。SAA1和SAA2属急性期基因，编码急性期蛋白(A-SAA)；SAA3是假基因；SAA4是结构基因，编码结构蛋白。SAA是一种高度特异性的蛋白质，成熟SAA由104个氨基酸构成，其N端的11个氨基酸是脂质结合部位，其前端76个氨基酸被酶切后可成为淀粉样蛋白A，而其第77～104位氨基酸是中性粒细胞结合区，有免疫相关的生物学功能。

在急性时相反应中，经白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)、SAA和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)刺激，肝细胞可迅速合成SAA，浓度在4-6h内达到峰值，从正常水平的1-5μg/ml升高到1000μg/ml，但半减期短，只有50min左右。PCT要在1-2d达到峰值、半减期长；CRP要在2-3d达到峰值、增幅数至数百倍、半减期最长。因此，在感染性疾病的最早期或急性期诊断中，无论是细菌、病毒还是真菌感染，SAA的灵敏度都要优于PCT和CRP；尤其是对于病毒性感染的诊断和鉴别诊断来说，SAA更具优势。

SAA在病毒和细菌感染中均升高，而病毒感染中CRP几乎不升高或升高不明显。对于微弱的炎症刺激，SAA较CRP更灵敏。因此，在CRP正常的病毒感染患者、非侵袭性或早期侵袭性细菌感染患者中，SAA是一个较为有用的指标。在小儿感染性疾病早期，由于小儿患者的体征和症状均不明确，很难鉴别是细菌感染还是病毒感染。所以早期快速地鉴别小儿患者细菌感染和病毒感染，对于及时有效地治疗及各种并发症的预防有着重要的意义。病毒感染时PCT水平稍增高，CRP几乎不升高或升高不明显，而SAA则明显升高，且病毒感染组SAA/CRP比值明显高于细菌感染组，提示病毒感染时，血清SAA变化较CRP、PCT更为敏感，因此血SAA水平和SAA/CRP比值可作为诊断病毒感染、鉴别细菌和病毒感染的敏感指标。另外，SAA和CRP的比值与小儿感染性疾病的严重程度存在相关性，监测SAA/CRP比值比单独检测SAA或CRP具有更大的应用价值。

目前用于检测SAA的方法主要是放射性免疫检测法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、乳胶免疫比浊法等。RIA有很高的检测灵敏度，但由于标记物具有放射性危害，标记物稳定性差，废弃物难以处理等缺点，已逐渐退出临床检验领域。ELISA法采用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)或碱性磷酸酶标记抗体，并催化底物产生颜色变化，具有操作简单，试剂稳定期长的特点，但ELISA法的检测灵敏度较低，线性范围窄，目前主要应用于传染性疾病筛查等对检测灵敏度要求较低的项目。乳胶免疫比浊法是利用抗原抗体反应原理测定血清中SAA的含量，此方法无法兼顾灵敏度和线性。

技术实现要素：

发明目的：针对现有SAA免疫检测方法存在的问题，本发明提供一种可用于定量检测的一步均相SAA检测试剂盒；本发明还提供一种一步均相SAA检测试剂盒的制备方法和使用方法。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种一步均相SAA检测试剂盒，主要组成包括：抗SAA抗体偶联的发光微球、抗SAA抗体偶联的感光微球、分析缓冲液、反应孔。

所述发光微球表面活性基团为醛基、羧基、氨基等，发光微球带有发光化合物和镧系元素化合物的高分子，发光化合物可以是Dioxene(二氧杂环己烯)或Thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，镧系元素化合物可以是Eu(TTA)₃/TOPO或Eu(TTA)₃/Phen等，发光微球大小为100-300nm，该发光微球可由铂金埃尔默公司购得。

所述感光微球表面活性基团为醛基、羧基、氨基等，感光微球带有光激发产生单线态氧的染料，如酞箐染料、叶绿素等，感光微球大小为100-300nm，该感光微球可由铂金埃尔默公司购得。

进一步地，所述抗SAA抗体(通过常规免疫学方法制备)为针对SAA不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。

进一步地，所述反应孔为微孔板、微流控试剂盘、反应杯或反应管。

本发明所述的一步均相SAA检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

(1)抗SAA抗体偶联发光微球的制备；

(2)抗SAA抗体偶联感光微球的制备；

(3)分析缓冲液的制备。

进一步地，所述抗SAA抗体偶联发光微球的制备，包括如下步骤：

(1)将抗SAA抗体加入到超滤管中，离心，用HEPES缓冲液洗涤，备用；将发光微球，用HEPES缓冲液清洗，离心，去除上清；

(2)将抗体溶液加入到发光微球中，重悬；

(3)加入2.0-3.0μl 10％质量分数Tween 20，8-12μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，震荡反应24-48小时；

(4)加8-12μl 65mg/ml CMO溶液到反应体系中；震荡反应0.5-1.5小时，离心，去除上清；

(5)加入150-250μl Tris-HCl缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；

(6)最后一次离心后用PBS缓冲液和牛血清白蛋白混合液重悬微球，使用前稀释至所需浓度。

进一步地，所述抗SAA抗体偶联感光微球的制备，包括如下步骤：

(1)将抗SAA抗体加入到超滤管中，离心，用HEPES缓冲液洗涤，备用；将感光微球，用HEPES缓冲液清洗，离心，去除上清；

(2)将抗体溶液加入到感光微球中，重悬；

(3)加入2.0-3.0μl 10％质量分数Tween 20，8-12μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，震荡反应24-48小时；

(4)加8-12μl 65mg/ml CMO溶液到反应体系中；震荡反应0.5-1.5小时，离心，去除上清；

(5)加入150-250μl Tris-HCl缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；

(6)最后一次离心后用PBS缓冲液和牛血清白蛋白混合液重悬微球，使用前稀释至所需浓度。

进一步地，所述分析缓冲液的制备，包括如下步骤：将HEPES 0.1-2g、BSA0.1-5g、Casein 0.1-5g、NaCl 0.5-3g、Triton X-100 0.01-1ml加入蒸馏水溶解后，制成分析缓冲液。

进一步地，步骤(1)中所述抗SAA抗体与发光微球与的质量比为1：(1-100)。

进一步地，步骤(1)所述抗SAA抗体与感光微球的质量比为1：(1-100)。

进一步地，使用分析缓冲液稀释抗SAA抗体偶联的发光微球浓度为10-200μg/ml；稀释抗SAA抗体偶联的感光微球浓度为10-200μg/ml。

本发明所述的一步均相SAA检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗SAA抗体偶联的发光微球和抗SAA抗体偶联的感光微球，混合反应5-60分钟；

(2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值；

(3)绘制SAA浓度与光信号值的标准曲线，利用步骤(2)测得的光信号值，通过标准曲线计算SAA含量。

有益效果：由现有技术相比，本发明的一步均相SAA检测试剂盒具有如下优点：本发明所得试剂盒能利用SAA的抗体，以氧通道化学发光技术为平台，针对炎症诊断的SAA快速检测，本发明的试剂盒检测快速准确、范围宽、灵敏度高、特异性好、重复性好、免清洗；同时本发明的试剂盒的制备方法简单，无污染，并且试剂盒使用方法操作简单，将其应用于感染的监测，可以提高炎症诊断的准确率，便于临床检测使用，具有极大的市场价值。

附图说明

图1是本发明实施例3提供的SAA检测试剂盒原理示意图；

图2是本发明实施例3提供的SAA检测试剂盒检测线性范围图；

图3是本发明实施例3试剂盒与西门子SAA试剂盒的检测结果相关性比较图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

抗SAA抗体偶联发光微球的制备：

(1)将0.1mg抗SAA单克隆抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。将0.1mg发光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；

(2)将抗体溶液加入到发光微球中，重悬；

(3)加入2.0μl 10％Tween 20，8μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，37℃震荡反应24小时；

(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加8μl溶液到反应体系中；37℃震荡反应0.5小时，离心，去除上清；

(5)加入150μl Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；

(6)最后一次离心后用PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。

抗SAA抗体偶联感光微球的制备：

(1)将0.1mg抗SAA单克隆抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。将0.1mg感光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；

(2)将抗体溶液加入到感光微球中，重悬；

(3)加入2.0μl 10％Tween 20，8μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，37℃震荡反应24小时；

(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加8μl溶液到反应体系中；37℃震荡反应0.5小时，离心，去除上清；

(5)加入150μl Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；

(6)最后一次离心后用PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。

分析缓冲液的制备：将HEPES 0.1g、BSA 0.1g、Casein 0.1g、NaCl 0.5g、Triton X-100 0.01ml加入90ml蒸馏水溶解后调节pH到7.4，水补足到100ml，制成分析缓冲液。

使用分析缓冲液稀释抗SAA抗体偶联的发光微球浓度为10-200μg/ml；稀释抗SAA抗体偶联的感光微球浓度为10-200μg/ml。

上述抗SAA抗体偶联发光微球、抗SAA抗体偶联感光微球、分析缓冲液再加入微孔板组成本发明所述的试剂盒。

实施例2

抗SAA抗体偶联发光微球的制备：

(1)将0.1mg抗SAA多克隆抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。将10mg发光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；

(2)将抗体溶液加入到发光微球中，重悬；

(3)加入3μl 10％Tween 20，12μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，37℃震荡反应48小时；

(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加12μl溶液到反应体系中；37℃震荡反应1.5小时，离心，去除上清；

(5)加入250μl Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；

(6)最后一次离心后用PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。

抗SAA抗体偶联感光微球的制备：

(1)将0.1mg抗SAA多克隆抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。将10mg感光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；

(2)将抗体溶液加入到感光微球中，重悬；

(3)加入3μl 10％Tween 20，12μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，37℃震荡反应48小时；

(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加12μl溶液到反应体系中；37℃震荡反应1.5小时，离心，去除上清；

(5)加入250μl Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；

(6)最后一次离心后用PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。

分析缓冲液的制备：将HEPES 2g、BSA 5g、Casein 5g、NaCl 3g、Triton X-100 1ml加入90ml蒸馏水溶解后调节pH到7.4，水补足到100ml，制成分析缓冲液。

使用分析缓冲液稀释抗SAA抗体偶联的发光微球浓度为10-200μg/ml；稀释抗SAA抗体偶联的感光微球浓度为10-200μg/ml。

上述抗SAA抗体偶联发光微球、抗SAA抗体偶联感光微球、分析缓冲液再加入微流控试剂盘组成本发明所述的试剂盒。

实施例3

(1)将0.1mg抗SAA单克隆抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。将1mg发光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；

(2)将抗体溶液加入到发光微球中，重悬；

(3)加入2.5μl 10％Tween 20，10μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，37℃震荡反应36小时；

(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加10μl溶液到反应体系中；37℃震荡反应1小时，离心，去除上清；

(5)加入200μl Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；

(6)最后一次离心后用PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。

抗SAA抗体偶联感光微球的制备：

(1)将0.1mg抗SAA单克隆抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。将1mg感光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；

(2)将抗体溶液加入到感光微球中，重悬；

(3)加入2.5μl 10％Tween 20，10μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，37℃震荡反应36小时；

(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加10μl溶液到反应体系中；37℃震荡反应1小时，离心，去除上清；

(5)加入200μl Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；

(6)最后一次离心后用PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。

分析缓冲液的制备：将HEPES 1.0g、BSA2.5g、Casein 2.5g、NaCl 1.75g、Triton X-100 0.5ml加入90ml蒸馏水溶解后调节pH到7.4，水补足到100ml，制成分析缓冲液。

使用分析缓冲液稀释抗SAA抗体偶联的发光微球浓度为10-200μg/ml；稀释抗SAA抗体偶联的感光微球浓度为10-200μg/ml。

上述抗SAA抗体偶联发光微球、抗SAA抗体偶联感光微球、分析缓冲液再加入反应杯组成本发明所述的试剂盒。

实施例4

抗SAA抗体偶联发光微球的制备：

(1)将0.1mg抗SAA单克隆抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。将5mg发光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；

(2)将抗体溶液加入到发光微球中，重悬；

(3)加入2.5μl 10％Tween 20，10μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，37℃震荡反应36小时；

(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加10μl溶液到反应体系中；37℃震荡反应1小时，离心，去除上清；

(5)加入200μl Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；

(6)最后一次离心后用PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。

抗SAA抗体偶联感光微球的制备：

(1)将0.1mg抗SAA单克隆抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。将5mg感光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；

(2)将抗体溶液加入到感光微球中，重悬；

(3)加入2.5μl 10％Tween 20，10μl 400mM NaCNBH₃，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，37℃震荡反应36小时；

(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加10μl溶液到反应体系中；37℃震荡反应1小时，离心，去除上清；

(5)加入200μl Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；

(6)最后一次离心后用PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。

分析缓冲液的制备：将HEPES 1.0g、BSA2.5g、Casein 2.5g、NaCl 1.75g、Triton X-100 0.5ml加入90ml蒸馏水溶解后调节pH到7.4，水补足到100ml，制成分析缓冲液。

使用分析缓冲液稀释抗SAA抗体偶联的发光微球浓度为10-200μg/ml；稀释抗SAA抗体偶联的感光微球浓度为10-200μg/ml。

上述抗SAA抗体偶联发光微球、抗SAA抗体偶联感光微球、分析缓冲液再加入反应管组成本发明所述的试剂盒。

实施例5

试剂盒的使用方法：

(1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗SAA抗体偶联的发光微球和抗SAA抗体偶联的感光微球，混合反应5-60分钟；

(2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值；

(3)绘制SAA浓度与光信号值的标准曲线，利用步骤(2)测得的光信号值，通过标准曲线计算SAA含量。

试验例6

本发明试剂盒方法学评价：

1、线性

配制浓度为0μg/ml，2μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，的血清淀粉样蛋白A标准品溶液。在反应孔中分别加入5μl标准品，加入20μl偶联血清淀粉样蛋白A抗体的发光微球(终浓度10μg/ml)，加入20μl偶联血清淀粉样蛋白A抗体的感光微球(终浓度10μg/ml)，室温暗处温育15分钟。温育后，激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值。

如上用本发明实施例3所制备的SAA检测试剂盒对其进行检测，绘制各检测试剂盒标准工作曲线(见附图2)。从附图2可以看出本发明所制备的检测试剂盒能保持良好的线性，血清淀粉样蛋白A浓度为200μg/ml时方法无Hook效应。

2、准确度

准确性测量是指用已知量血清淀粉样蛋白A标准品加入到正常人的血清标本中，测量加入后浓度值与加入的理论值进行比较，计算血清淀粉样蛋白A的回收率。检测结果如下：

3、精密度

选取3份不同浓度的标本，分别按照本发明所述的方法重复测量20次。根据20次的测量结果，计算平均偏差C.V.％值。

4、分析灵敏度

分析灵敏度的定义为：是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。重复20次测量零剂量点，计算其平均值(X)和标准差(SD)，以X+2SD的计算的浓度值即为该试剂盒的分析灵敏度。本发明试剂盒的分析灵敏度为2pg/ml。

5、特异性

检测本发明的氧通道化学发光免疫分析试剂在干扰性物质(溶血、高血脂、高胆红素)存在的情况下检测标本的准确性。将血红蛋白溶液(5mg/ml)分别取适量加入到1ml的血清淀粉样蛋白A阳性血清标本中，使血清中血红蛋白的含量分别为1mg/ml、0.5mg/ml。将甘油三酯溶液(5mg/ml)分别取适量加入到1ml的血清淀粉样蛋白A阳性血清标本中，使血清中甘油三酯的含量分别为1mg/mL、0.5mg/ml。将胆红素溶液(5mg/ml)分别取适量加入到1ml的血清淀粉样蛋白A阳性血清标本中，使血清中胆红素的含量分别为50μg/ml、25μg/ml。对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的血清淀粉样蛋白A阳性标本进行测定，在反应孔中每孔分别加入5μl含加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的血清淀粉样蛋白A阳性标本，加入20μl偶联抗血清淀粉样蛋白A抗体的发光微球(终浓度10μg/ml)，加入20μl偶联血清淀粉样蛋白A抗体的感光微球(终浓度10μg/ml)，室温暗处温育15分钟。温育后，激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值。将理论浓度与实测浓度的比值作为回收率，回收率在96.36％-106.01％之间。表明血清淀粉样蛋白A氧通道化学发光试剂在检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。

6、相关性

如图3所示，与西门子血清淀粉样蛋白A化学发光试剂盒的相关性为：y＝0.9976x-0.0597，R²＝0.9961

本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器要求低的优点。

本发明的原理(见附图1)是通过在均相条件下将偶联了抗血清淀粉样蛋白A抗体的带有酞菁染料的感光微球1，包被有二甲基噻吩、蒽等活性分子且带有铕螯合物、偶联了抗血清淀粉样蛋白A抗体的发光微球2混合。此时偶联了抗血清淀粉样蛋白A抗体感光微球1和偶联了抗血清淀粉样蛋白A抗体的发光微球2迅速有效地识别检测样本3的目标分子而形成免疫夹心复合物。在激光(波长为680nm)的照射下，感光微球上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单线态氧。单线态氧扩散至发光微球，与其上的化学发光剂反应，进一步激活了同样在发光微球上的荧光基团，使之发出荧光，波长为615nm。单线态氧的半衰期为4μs，在溶液中的扩散距离为200nm左右。如果生物分子不存在相互作用，单线态氧无法扩散到发光微球，则不会有荧光信号产生。

以上实施例仅用以说明本材料的技术实施方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。