本发明涉及细胞生物学领域及免疫荧光技术，具体是AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒。
背景技术：
细胞凋亡 (apoptosis) 是细胞为维持内环境稳定，更好地适应生存环境而主动形成的一种自我死亡过程，它涉及一系列基因的激活、表达及调控等作用。大量的光镜及超微结构的研究分析证明哺乳动物附植前的胚胎就可以观察到细胞凋亡的发生，胚胎细胞的凋亡有利于胚胎去除发育异常的细胞，但研究结果发现细胞凋亡与胚胎发育的停滞相关，超出某一程度的凋亡不利于胚胎的发育。因此研究着床前胚胎细胞的凋亡将有助于正确理解胚胎的发育过程，改进体外培养体系，提高胚胎质量，解决哺乳动物胚胎流产率高的问题。
Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。而且Caspase-3 常被用作细胞凋亡检测的标志物。
目前对胚胎质量的评价指标主要是囊胚细胞总数和 ICM/TE，计数方法是染色后不同类型的细胞分别统计，然而其所用的染色方法受不同的动物品种、囊胚大小与细胞总数，通透剂的浓度和染料作用时间等多种因素的影响，导致对不同发育期的囊胚需要进行反复多次的条件摸索，因此该方法的可重复性差。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供灵敏度高、特异性强、操作简单、重复性好、效率高的AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒，所述试剂盒包括：含0.6-0.8％BSA的PBS缓冲液，含2.5-4％多聚甲醛的PBS缓冲液，含0.6-0.8％Triton X-100和0.06-0.08％吐温40的PBS缓冲液，兔抗caspase-3一抗，带有Alexa Fluor488绿色荧光素标记的山羊抗兔IgG二抗，含18-22μM DAPI的PBS缓冲液。
作为本发明进一步的方案：含0.7％BSA的PBS缓冲液。
作为本发明进一步的方案：含3％多聚甲醛的PBS缓冲液。
作为本发明进一步的方案：含0.7％Triton X-100和0.07％吐温40的PBS缓冲液。
作为本发明进一步的方案：含20μM DAPI的PBS缓冲液。
作为本发明进一步的方案：所述兔抗caspase-3一抗是用合成的人caspase-3蛋白中靠近Asp175的氨基末端残基的多肽抗原免疫兔子获得的多克隆抗体；兔抗caspase-3一抗按1:600的体积比稀释于封闭液中；其中，所述封闭液为含10％山羊血清和0.06-0.08％吐温40的PBS液。
作为本发明进一步的方案：所述山羊抗兔IgG二抗按1:600的体积比稀释于封闭液中；其中，所述封闭液为含10％山羊血清和0.06-0.08％吐温40的PBS液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用针对caspase-3一抗和携带荧光素的二抗进行抗原抗体反应，对胚胎中的凋亡细胞进行荧光标记和计数；再用DNA染料着色所有细胞的细胞核，从而计算出囊胚细胞的凋亡率。本发明结合荧光显微镜，能对凋亡细胞进行准确定性和定量检测，灵敏度高、特异性强，操作简单，重复性好，效率高。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例中，AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒，所述试剂盒包括：含0.6％BSA的PBS缓冲液，含2.5％多聚甲醛的PBS缓冲液，含0.6％Triton X-100和0.06％吐温40的PBS缓冲液，兔抗caspase-3一抗，带有Alexa Fluor488绿色荧光素标记的山羊抗兔IgG二抗，含18μM DAPI的PBS缓冲液。所述兔抗caspase-3一抗是用合成的人caspase-3蛋白中靠近Asp175的氨基末端残基的多肽抗原免疫兔子获得的多克隆抗体；兔抗caspase-3一抗按1:600的体积比稀释于封闭液中；其中，所述封闭液为含10％山羊血清和0.06％吐温40的PBS液。所述山羊抗兔IgG二抗按1:600的体积比稀释于封闭液中；其中，所述封闭液为含10％山羊血清和0.06％吐温40的PBS液。
实施例2
本发明实施例中，AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒，所述试剂盒包括：含0.8％BSA的PBS缓冲液，含4％多聚甲醛的PBS缓冲液，含0.8％Triton X-100和0.08％吐温40的PBS缓冲液，兔抗caspase-3一抗，带有Alexa Fluor488绿色荧光素标记的山羊抗兔IgG二抗，含22μM DAPI的PBS缓冲液。所述兔抗caspase-3一抗是用合成的人caspase-3蛋白中靠近Asp175的氨基末端残基的多肽抗原免疫兔子获得的多克隆抗体；兔抗caspase-3一抗按1:600的体积比稀释于封闭液中；其中，所述封闭液为含10％山羊血清和0.08％吐温40的PBS液。所述山羊抗兔IgG二抗按1:600的体积比稀释于封闭液中；其中，所述封闭液为含10％山羊血清和0.08％吐温40的PBS液。
实施例3
本发明实施例中，AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒，所述试剂盒包括：含0.7％BSA的PBS缓冲液作为洗液，含3％多聚甲醛的PBS缓冲液作为固定液，含0.7％Triton X-100和0.07％吐温40的PBS缓冲液作为通透液，兔抗caspase-3一抗作为一抗，带有Alexa Fluor488绿色荧光素标记的山羊抗兔IgG二抗作为二抗，含20μM DAPI的PBS缓冲液作为染色液。所述兔抗caspase-3一抗是用合成的人caspase-3蛋白中靠近Asp175的氨基末端残基的多肽抗原免疫兔子获得的多克隆抗体；兔抗caspase-3一抗按1:600的体积比稀释于封闭液中；其中，所述封闭液为含10％山羊血清和0.07％吐温40的PBS液。所述山羊抗兔IgG二抗按1:600的体积比稀释于封闭液中；其中，所述封闭液为含10％山羊血清和0.07％吐温40的PBS液。
将实施例3的试剂盒用于牛囊胚细胞凋亡检测，
差异染色程序如下 (以下所有染色操作均在四孔板中完成)：
a.将牛囊胚在37℃洗液中洗3次；
b.使用固定液室温固定20min，四孔板每孔最多25枚囊胚；
c.在通透液中室温处理30min，每孔500μL通透液，每孔最多25枚囊胚；
d.取出囊胚，在洗液中清洗3次；
e.在2MHCl中室温处理20min；
f.在100mMTris-HCl中室温处理20min；
g.取出囊胚，在洗液中清洗3次；
h.放入封闭液中，4℃过夜；
i.取出囊胚移入兔抗caspase-3一抗中，室温孵育2h；
j.取出囊胚，在洗液中洗3次，每次5min以上；
k.将囊胚放入标记Alexa Fluor488的山羊抗兔IgG中，室温孵育2h，避光；
l.取出囊胚，在洗液中洗3次，每次5min以上；
m.将囊胚放入染色液中，室温染色10min；
n.取出囊胚，洗液洗3次；
o.使用DABCO封片，压片，荧光显微镜下拍照。
牛囊胚细胞计数：荧光显微镜下分别统计凋亡细胞数和囊胚总细胞数，计算凋亡率(凋亡细胞数/总细胞数)来评估囊胚质量。
牛囊胚细胞凋亡率统计：实验重复3次，每次随机选取10个牛囊胚，分别在绿色、紫外激发光照射下，对凋亡细胞、囊胚总细胞进行计数，两者相比得出凋亡率。牛囊胚总细胞数的平均值为68.50个，凋亡率为6.02％，可见胚胎凋亡比例较低，胚胎质量优秀，后期发育能力较好。
注：凋亡率＝凋亡细胞数×100/总细胞数
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。