一种水体中浮游植物叶绿素a提取与测定方法与流程

本发明涉及水环境监测领域，具体的说是一种水体中浮游植物叶绿素a提取与测定方法。

背景技术：

叶绿素a是植物光合作用中的重要光合色素，其含量可以反映植物的生长状况。叶绿素a属于合成天然低分子有机化合物，不溶于水，溶于有机溶剂，如丙酮、乙醚、氯仿等。在水环境的富营养化研究中，叶绿素a的含量是表征浮游植物生物量的最常用指标之一。如今广泛应用于水质评价和水体富营养化评价等方面，水质监测技术规范中明确规定湖泊水库叶绿素属于常规监测项目。

目前对水体中浮游植物叶绿素a提取与测定的的方法众多，目前使用较多的是依据《水和废水监测分析方法(第四版)》书中采用研磨-丙酮提取分光光度法作为方法。该法采用90％丙酮为溶剂，通过反复研磨、浓缩、离心来提取测定叶绿素a的浓度。但是在实验中发现此法存在一些问题：比如研磨过程中易造成组织中叶绿素的流失，操作繁琐，人为误差较大，准确性和安全性低等。鉴于此，对现有方法进行一定的改进，研究一种新的提取与测定叶绿素a的方法：提取方法为反复冻融-浸提法，测定方法为荧光光度法，对监测水体富营养化程度，治理受损水环境具有重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术中的问题，本发明提供了一种水体中浮游植物叶绿素a提取与测定方法。其能有效提取水中浮游植物叶绿素a，具有人为误差小、稳定性好、操作简单、快捷且安全，也提高了测量精度，减少了实验误差。

本发明所要解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

一种水体中浮游植物叶绿素a提取与测定方法，其具体步骤如下：

(1)水样的采集：在水面以下0.5m通过水样采集器采集500ml水样，存于棕色玻璃瓶中，并加入0.5％碳酸镁悬浊液1ml，以防止酸化引起色素溶解；

(2)水样的浓缩：在抽滤器上装好滤膜，使用0.45μm醋酸纤维滤膜，倒入100ml水样进行抽滤，抽滤时负压不能过大，在水样刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，用滤纸吸干剩余水分，每个水样需准备2个滤膜用来做平行实验；

(3)叶绿素a的提取：将抽滤后的滤膜放入比色管中，放入-5℃低温中冷冻20min，取出放置于室温下5min，此过程反复5次后向比色管中加入10ml的90％丙酮溶液，剧烈震荡后放置于4℃中避光提取12小时，期间应再震荡3次以上，最后放入高速离心机以5000r/min速度离心30min；

(4)标准曲线的绘制：使用标准储备液稀释至一定浓度作为标准使用液，通过分子荧光光谱仪以定量模式进行荧光强度测定，并以90％丙酮溶液为空白参比测定荧光强度，绘制一定叶绿素a浓度与荧光强度标准曲线；

(5)叶绿素a的测定：取上清液于分子荧光光谱仪比色皿中，用90％丙酮溶液作参比，即空白荧光强度测定，读取荧光强度值，通过查标准曲线并代入公式ρ＝C*0.1(C为标准曲线上叶绿素a浓度)，求得最后叶绿素a的浓度。

作为本发明的一种优选技术方案，水样的采集时加入0.5％碳酸镁悬浊液1ml。

作为本发明的一种优选技术方案，水样的抽滤时使用0.45μm醋酸纤维滤膜，并准备2个滤膜做平行实验。

作为本发明的一种优选技术方案，叶绿素a的提取时放入-5℃低温中冷冷冻20min，取出放置于室温下5min，此过程反复5次。

作为本发明的一种优选技术方案，叶绿素a的提取时放入高速离心机以5000r/min速度离心30min。

因此，本发明的有益效果是：操作简单，转移次数少，降低了样品的损失；避免了研磨中的人为误差，数据较为稳定，精度较高；检测快捷，同时尽可能的减少了人体与丙酮的接触的时间。

附图说明

图1是本发明叶绿素a浓度与荧光强度标准曲线；

图2是本发明方法与研磨-丙酮提取分光光度法标准偏差比较折线图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段，创作特征，达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种水体中浮游植物叶绿素a提取与测定方法，选择某湖泊水体，选择湖泊中10个点为采样点，具体步骤如下：

(1)水样的采集：在水面以下0.5m通过水样采集器采集500ml水样，存于棕色玻璃瓶中，并加入0.5％碳酸镁悬浊液1ml，以防止酸化引起色素溶解；

(2)水样的浓缩：在抽滤器上装好滤膜，使用0.45μm醋酸纤维滤膜，倒入100ml水样进行抽滤，抽滤时负压不能过大，在水样刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，用滤纸吸干剩余水分，每个水样需准备2个滤膜用来做平行实验；

(3)叶绿素a的提取：将抽滤后的滤膜放入比色管中，放入-5℃低温中冷冻20min，取出放置于室温下5min，此过程反复5次后向比色管中加入10ml的90％丙酮溶液，剧烈震荡后放置于4℃中避光提取12小时，期间应再震荡3次以上，最后放入高速离心机以5000r/min速度离心30min；

(4)标准曲线的绘制：使用标准储备液稀释至一定浓度作为标准使用液，通过分子荧光光谱仪以定量模式进行荧光强度测定，并以90％丙酮溶液为空白参比测定荧光强度，绘制一定叶绿素a浓度与荧光强度标准曲线，见附图1；

(5)叶绿素a的测定：取上清液于分子荧光光谱仪比色皿中，用90％丙酮溶液作参比，即空白荧光强度测定，读取荧光强度值，通过查标准曲线并代入公式ρ＝C*0.1(C为标准曲线上叶绿素a浓度)，求得最后叶绿素a的浓度；

依据《水和废水监测分析方法(第四版)》书中研磨-丙酮提取分光光度法检测相同水样中叶绿素a的浓度，结果作为对比参考；

表1为本发明方法与研磨-丙酮提取分光光度法所测得叶绿素a浓度结果对比，包括平行样结果和结果之间的相对偏差、标准偏差，附图2为两种方法的标准偏差比较折线图。

表1两种方法分析测定结果(单位：μg/L，A和B为平行样)

采用本发明的一种水体中浮游植物叶绿素a提取与测定方法，操作简单，转移次数少，降低了样品的损失；避免了研磨中的人为误差，数据较为稳定，精度较高；检测快捷，同时尽可能的减少了人体与丙酮的接触的时间。

以上描述了本发明的主要特征、基本原理。本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入本发明要求保护的范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。