本发明涉及蔗糖酶活性的测定方法。
背景技术：
蔗糖酶广泛存在于所有土壤中，它是表征土壤生物活性重要的酶。蔗糖酶(β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC3.2.1.26)是一种水解酶。它能催化非还原性双糖(蔗糖)的1，2-糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。蔗糖酶主要是将碳水化合物水解产生的糖类进一步分解形成单糖，从而为微生物的繁殖提供营养，常用蔗糖酶活性表征土壤的熟化程度和肥力水平。
测定土壤蔗糖酶活性的方法-比色法，是目前比较常用的测定土壤蔗糖酶活性的方法。该方法采用8％蔗糖为基质，基质在土壤蔗糖酶的作用下生成葡萄糖，葡萄糖和3，5-二硝基水杨酸反应生成橙黄色的3-氨基-5硝基水杨酸，在508nm波长下有最大吸光值。但是该方法存在许多的不足，蔗糖酶活性在酸性的介质中最大，为了让反应在最适pH，以往常用多种缓冲液，醋酸盐缓冲液(pH4.5-5.5)，磷酸盐缓冲液(pH4.9-5.5)，醋酸盐－磷酸盐缓冲液(pH5.5)，但是缓冲液的不同会使土壤蔗糖酶活性测量的结果存在一定的差异，导致测定的结果不够准确。不仅如此，这些缓冲液存放的时间短，在测定过程中受试剂影响较大，导致比色法测定蔗糖酶活性准确性较低。
技术实现要素：
本发明的目的要解决现有比色法测定蔗糖酶活性准确性较低的问题，而提供土壤蔗糖酶的测定方法。
土壤蔗糖酶的测定方法，具体是按以下步骤进行：
一、配制显色剂3,5-二硝基水杨酸溶液：首先向20mL～21mL 2mol/L氢氧化钠水溶液中加入50mL～51mL去离子水，并混匀，然后加入0.49g～0.51g二硝基水杨酸，二硝基水杨酸完全溶解后再加入30.00g～30.10g酒石酸钾钠，最后利用去离子水定容至100mL，即得到显色剂3,5-二硝基水杨酸溶液；
二、配制蔗糖溶液：将8.00g蔗糖溶入去离子水中，定容至100mL，得到质量分数为8％的蔗糖溶液；
三、配制缓冲液：缓冲液储备液：将12.10g～12.14g三(羟甲基)氨基甲烷、11.60g～11.64g顺丁烯二酸、14.00g～14.10g柠檬酸一水化合物和6.30g～6.34g硼酸依次溶于500mL～510mL 1mol/L的NaOH水溶液中，并利用蒸馏水定容至1000mL，缓冲液储备液；取200mL～210mL缓冲液储备液转移至1000mL容量瓶中，并利用0.10mol/L～0.14mol/L HCl将200mL～210mL缓冲液储备液的pH调节至6.0，再用去离子水定容至1000mL，得到缓冲液；
四、土样培养：将待测土壤用孔径为2mm的筛子过筛，称取过完筛的待测土壤5.01g～5.04g置于50mL三角瓶中，用胶头滴管加入甲苯4～5滴，加入15mL步骤二得到的质量分数为8％的蔗糖溶液，加入5mL步骤三得到的缓冲液，摇匀混合物后，再用保鲜膜密封，放入已预热的恒温箱，在温度为37℃～38℃下培养23.5h～24.5h，得到培养后土样；
五、测定：将步骤四的培养后土样过滤，取0.5mL～1mL滤液移入50mL容量瓶中，加入3mL步骤一得到的显色剂3,5-二硝基水杨酸溶液，并在沸腾的水浴锅中加热5min～6min，然后移至自来水流下冷却3min～4min，再利用蒸馏水稀释定容至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色检测；
六、标准葡萄糖溶液配制；将葡萄糖先在温度为50～58℃条件下真空干燥至恒重，得到干燥的葡萄糖，然后取500mg干燥的葡萄糖溶于100mL蒸馏水中，即得到标准葡萄糖溶液，再将标准葡萄糖溶液稀释10倍，制成葡萄糖工作液，所述的葡萄糖工作液中葡萄糖的浓度为0.5mg/mL；
七、标准曲线的绘制：
依次称取0mL、1mL、2mL、3mL、4mL和5mL步骤六得到的葡萄糖工作液，分别注入6只50mL容量瓶中，用蒸馏水依次补齐至10mL，然后分别加3mL 3,5-二硝基水杨酸，并在沸腾水浴锅中加热5min，随即将6只50mL容量瓶移至自来水流下冷却3min，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色，比色检测后以光密度值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线；
八、空白对照检测：将待测土壤用孔径为2mm的筛子过筛，称取过完筛的待测土壤5.01g～5.04g置于50mL三角瓶中，用胶头滴管加入甲苯4～5滴，加入5mL步骤三得到的缓冲液，摇匀混合物后，再用保鲜膜密封，放入已预热的恒温箱，在温度为37℃～38℃下培养23.5h～24.5h，得到空白对照培养后土样；将空白对照培养后土样过滤，取0.5mL～1mL滤液移入50mL容量瓶中，加入3mL步骤一得到的显色剂3,5-二硝基水杨酸溶液，并在沸腾的水浴锅中加热5min～6min，然后移至自来水流下冷却3min～4min，再利用蒸馏水稀释定容至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色检测；
九、确定葡萄糖浓度：根据步骤七得到的标准曲线依次确定步骤五中葡萄糖浓度a1和步骤八中葡萄糖浓度a2，a1-a2＝a，a为步骤五中剩余葡萄糖浓度；
十、结果计算：蔗糖酶活性以24h后1g过完筛的待测土壤中葡萄糖的质量表示蔗糖酶活性Suc：
Suc＝a×V×n/m
式中：a为步骤五中剩余葡萄糖浓度，单位mg/mL；V为显色液体积50mL；n为
分取倍数；m为烘干土重，单位g。
本发明优点：
通过使用改进的通用缓冲液代替醋酸盐缓冲液(pH4.5-5.5)，磷酸盐缓冲液(pH4.9-5.5)，醋酸盐-磷酸盐缓冲液(pH5.5)缓冲液，培养溶液的次序进行调整后，提高了蔗糖酶活性测定的准确性。同时采用本发明方法与原有的普通方法多种缓冲液测定同一土壤蔗糖酶活性，本发明方法得到的值分别为102.14、107.87、109.74、115.45、95.47，标准值为106.13±7.62，原有方法采用的缓冲液测定得到值分别为253.97±20.87,144.61±23.44、141.30±26.96，本发明测定土壤蔗糖酶活性平行性好，变异系数小，方法可行性高。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式是土壤蔗糖酶的测定方法，具体是按以下步骤进行：
一、配制显色剂3,5-二硝基水杨酸溶液：首先向20mL～21mL 2mol/L氢氧化钠水溶液中加入50mL～51mL去离子水，并混匀，然后加入0.49g～0.51g二硝基水杨酸，二硝基水杨酸完全溶解后再加入30.00g～30.10g酒石酸钾钠，最后利用去离子水定容至100mL，即得到显色剂3,5-二硝基水杨酸溶液；
二、配制蔗糖溶液：将8.00g蔗糖溶入去离子水中，定容至100mL，得到质量分数为8％的蔗糖溶液；
三、配制缓冲液：缓冲液储备液：将12.10g～12.14g三(羟甲基)氨基甲烷、11.60g～11.64g顺丁烯二酸、14.00g～14.10g柠檬酸一水化合物和6.30g～6.34g硼酸依次溶于500mL～510mL 1mol/L的NaOH水溶液中，并利用蒸馏水定容至1000mL，缓冲液储备液；取200mL～210mL缓冲液储备液转移至1000mL容量瓶中，并利用0.10mol/L～0.14mol/L HCl将200mL～210mL缓冲液储备液的pH调节至6.0，再用去离子水定容至1000mL，得到缓冲液；
四、土样培养：将待测土壤用孔径为2mm的筛子过筛，称取过完筛的待测土壤5.01g～5.04g置于50mL三角瓶中，用胶头滴管加入甲苯4～5滴，加入15mL步骤二得到的质量分数为8％的蔗糖溶液，加入5mL步骤三得到的缓冲液，摇匀混合物后，再用保鲜膜密封，放入已预热的恒温箱，在温度为37℃～38℃下培养23.5h～24.5h，得到培养后土样；
五、测定：将步骤四的培养后土样过滤，取0.5mL～1mL滤液移入50mL容量瓶中，加入3mL步骤一得到的显色剂3,5-二硝基水杨酸溶液，并在沸腾的水浴锅中加热5min～6min，然后移至自来水流下冷却3min～4min，再利用蒸馏水稀释定容至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色检测；
六、标准葡萄糖溶液配制；将葡萄糖先在温度为50～58℃条件下真空干燥至恒重，得到干燥的葡萄糖，然后取500mg干燥的葡萄糖溶于100mL蒸馏水中，即得到标准葡萄糖溶液，再将标准葡萄糖溶液稀释10倍，制成葡萄糖工作液，所述的葡萄糖工作液中葡萄糖的浓度为0.5mg/mL；
七、标准曲线的绘制：
依次称取0mL、1mL、2mL、3mL、4mL和5mL步骤六得到的葡萄糖工作液，分别注入6只50mL容量瓶中，用蒸馏水依次补齐至10mL，然后分别加3mL 3,5-二硝基水杨酸，并在沸腾水浴锅中加热5min，随即将6只50mL容量瓶移至自来水流下冷却3min，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色，比色检测后以光密度值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线；
八、空白对照检测：将待测土壤用孔径为2mm的筛子过筛，称取过完筛的待测土壤5.01g～5.04g置于50mL三角瓶中，用胶头滴管加入甲苯4～5滴，加入5mL步骤三得到的缓冲液，摇匀混合物后，再用保鲜膜密封，放入已预热的恒温箱，在温度为37℃～38℃下培养23.5h～24.5h，得到空白对照培养后土样；将空白对照培养后土样过滤，取0.5mL～1mL滤液移入50mL容量瓶中，加入3mL步骤一得到的显色剂3,5-二硝基水杨酸溶液，并在沸腾的水浴锅中加热5min～6min，然后移至自来水流下冷却3min～4min，再利用蒸馏水稀释定容至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色检测；
九、确定葡萄糖浓度：根据步骤七得到的标准曲线依次确定步骤五中葡萄糖浓度a1和步骤八中葡萄糖浓度a2，a1-a2＝a，a为步骤五中剩余葡萄糖浓度；
十、结果计算：蔗糖酶活性以24h后1g过完筛的待测土壤中葡萄糖的质量表示蔗糖酶活性Suc：
Suc＝a×V×n/m
式中：a为步骤五中剩余葡萄糖浓度，单位mg/mL；V为显色液体积50mL；n为分取倍数；m为烘干土重，单位g。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一中配制显色剂3,5-二硝基水杨酸溶液：首先向20mL 2mol/L氢氧化钠水溶液中加入50mL去离子水，并混匀，然后加入0.50g二硝基水杨酸，二硝基水杨酸完全溶解后再加入30.00g酒石酸钾钠，最后利用去离子水定容至100mL，即得到显色剂3,5-二硝基水杨酸溶液。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二之一不同点是：步骤三中将12.10g三(羟甲基)氨基甲烷、11.60g顺丁烯二酸、14.00g柠檬酸一水化合物和6.30g硼酸依次溶于500mL 1mol/L的NaOH水溶液中，并利用蒸馏水定容至1000mL，缓冲液储备液；取200mL缓冲液储备液转移至1000mL容量瓶中，并利用0.10mol/L HCl将200mL缓冲液储备液的pH调节至6.0，再用去离子水定容至1000mL，得到缓冲液。其他与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同点是：步骤四中在温度为37.5℃下培养24h，得到培养后土样。其他与具体实施方式一至三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同点是：步骤八中在温度为37.5℃下培养24h，得到空白对照培养后土样。其他与具体实施方式一至四相同。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
采用下述试验验证本发明效果
实施例1：土壤蔗糖酶的测定方法，具体是按以下步骤进行：
一、配制显色剂3,5-二硝基水杨酸溶液：首先向20mL 2mol/L氢氧化钠水溶液中加入50mL去离子水，并混匀，然后加入0.50g二硝基水杨酸，二硝基水杨酸完全溶解后再加入30.00g酒石酸钾钠，最后利用去离子水定容至100mL，即得到显色剂3,5-二硝基水杨酸溶液；
二、配制蔗糖溶液：将8.00g蔗糖溶入去离子水中，定容至100mL，得到质量分数为8％的蔗糖溶液；
三、配制缓冲液：缓冲液储备液：将12.10g三(羟甲基)氨基甲烷、11.60g顺丁烯二酸、14.00g柠檬酸一水化合物和6.30g硼酸依次溶于500mL 1mol/L的NaOH水溶液中，并利用蒸馏水定容至1000mL，缓冲液储备液；取200mL缓冲液储备液转移至1000mL容量瓶中，并利用0.10mol/L HCl将200mL缓冲液储备液的pH调节至6.0，再用去离子水定容至1000mL，得到缓冲液；
四、土样培养：将待测土壤用孔径为2mm的筛子过筛，称取过完筛的待测土壤5.02g置于50mL三角瓶中，用胶头滴管加入甲苯5滴，加入15mL步骤二得到的质量分数为8％的蔗糖溶液，加入5mL步骤三得到的缓冲液，摇匀混合物后，再用保鲜膜密封，放入已预热的恒温箱，在温度为37.5℃下培养24h，得到培养后土样；
五、测定：将步骤四的培养后土样过滤，取1mL滤液移入50mL容量瓶中，加入3mL步骤一得到的显色剂3,5-二硝基水杨酸溶液，并在沸腾的水浴锅中加热6min，然后移至自来水流下冷却4min，再利用蒸馏水稀释定容至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色检测；
六、标准葡萄糖溶液配制；将葡萄糖先在温度为55℃条件下真空干燥至恒重，得到干燥的葡萄糖，然后取500mg干燥的葡萄糖溶于100mL蒸馏水中，即得到标准葡萄糖溶液，再将标准葡萄糖溶液稀释10倍，制成葡萄糖工作液，所述的葡萄糖工作液中葡萄糖的浓度为0.5mg/mL；
七、标准曲线的绘制：
依次称取0mL、1mL、2mL、3mL、4mL和5mL步骤六得到的葡萄糖工作液，分别注入6只50mL容量瓶中，用蒸馏水依次补齐至10mL，然后分别加3mL 3,5-二硝基水杨酸，并在沸腾水浴锅中加热5min，随即将6只50mL容量瓶移至自来水流下冷却3min，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色，比色检测后以光密度值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线；
八、空白对照检测：将待测土壤用孔径为2mm的筛子过筛，称取过完筛的待测土壤5.02g置于50mL三角瓶中，用胶头滴管加入甲苯5滴，加入5mL步骤三得到的缓冲液，摇匀混合物后，再用保鲜膜密封，放入已预热的恒温箱，在温度为37.5℃下培养24h，得到空白对照培养后土样；将空白对照培养后土样过滤，取1mL滤液移入50mL容量瓶中，加入3mL步骤一得到的显色剂3,5-二硝基水杨酸溶液，并在沸腾的水浴锅中加热6min，然后移至自来水流下冷却4min，再利用蒸馏水稀释定容至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色检测；
九、确定葡萄糖浓度：根据步骤七得到的标准曲线依次确定步骤五中葡萄糖浓度a1和步骤八中葡萄糖浓度a2，a1-a2＝a，a为步骤五中剩余葡萄糖浓度；
十、结果计算：蔗糖酶活性以24h后1g过完筛的待测土壤中葡萄糖的质量表示蔗糖酶活性Suc：
Suc＝a×V×n/m
式中：a为步骤五中剩余葡萄糖浓度，单位mg/mL；V为显色液体积50mL；n为分取倍数；m为烘干土重，单位g。
实施例2：对比试验1：
一、配制显色剂3,5-二硝基水杨酸溶液：首先向20mL 2mol/L氢氧化钠水溶液中加入50mL去离子水，并混匀，然后加入0.50g二硝基水杨酸，二硝基水杨酸完全溶解后再加入30.00g酒石酸钾钠，最后利用去离子水定容至100mL，即得到显色剂3,5-二硝基水杨酸溶液；
二、配制蔗糖溶液：将8.00g蔗糖溶入去离子水中，定容至100mL，得到质量分数为8％的蔗糖溶液；
三、土样培养：将待测土壤用孔径为2mm的筛子过筛，称取过完筛的待测土壤5.02g置于50mL三角瓶中，用胶头滴管加入甲苯5滴，加入15mL步骤二得到的质量分数为8％的蔗糖溶液，加入5mL缓冲液，摇匀混合物后，再用保鲜膜密封，放入已预热的恒温箱，在温度为37.5℃下培养24h，得到培养后土样；所述的缓冲液为酸盐缓冲液，其pH为4.5～5.5；
四、测定：将步骤三的培养后土样过滤，取1mL滤液移入50mL容量瓶中，加入3mL步骤一得到的显色剂3,5-二硝基水杨酸溶液，并在沸腾的水浴锅中加热6min，然后移至自来水流下冷却4min，再利用蒸馏水稀释定容至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色检测；
五、标准葡萄糖溶液配制；将葡萄糖先在温度为55℃条件下真空干燥至恒重，得到干燥的葡萄糖，然后取500mg干燥的葡萄糖溶于100mL蒸馏水中，即得到标准葡萄糖溶液，再将标准葡萄糖溶液稀释10倍，制成葡萄糖工作液，所述的葡萄糖工作液中葡萄糖的浓度为0.5mg/mL；
六、标准曲线的绘制：
依次称取0mL、1mL、2mL、3mL、4mL和5mL步骤五得到的葡萄糖工作液，分别注入6只50mL容量瓶中，用蒸馏水依次补齐至10mL，然后分别加3mL 3,5-二硝基水杨酸，并在沸腾水浴锅中加热5min，随即将6只50mL容量瓶移至自来水流下冷却3min，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色，比色检测后以光密度值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线；
七、空白对照检测：将待测土壤用孔径为2mm的筛子过筛，称取过完筛的待测土壤5.02g置于50mL三角瓶中，用胶头滴管加入甲苯5滴，加入5mL缓冲液，摇匀混合物后，再用保鲜膜密封，放入已预热的恒温箱，在温度为37.5℃下培养24h，得到空白对照培养后土样；将空白对照培养后土样过滤，取1mL滤液移入50mL容量瓶中，加入3mL步骤一得到的显色剂3,5-二硝基水杨酸溶液，并在沸腾的水浴锅中加热6min，然后移至自来水流下冷却4min，再利用蒸馏水稀释定容至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色检测；所述的缓冲液为酸盐缓冲液，其pH为4.5～5.5；
八、确定葡萄糖浓度：根据步骤六得到的标准曲线依次确定步骤三中葡萄糖浓度a1和步骤七中葡萄糖浓度a2，a1-a2＝a，a为步骤三中剩余葡萄糖浓度；
九、结果计算：蔗糖酶活性以24h后1g过完筛的待测土壤中葡萄糖的质量表示蔗糖酶活性Suc：
Suc＝a×V×n/m
式中：a为步骤五中剩余葡萄糖浓度，单位mg/mL；V为显色液体积50mL；n为分取倍数；m为烘干土重，单位g。
实施例3：对比试验2：步骤三中所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液，其pH为4.9～5.5；步骤七中所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液，其pH为4.9～5.5。其它步骤与实施例2相同。
实施例4：对比试验3：步骤三中所述的缓冲液为醋酸盐-磷酸盐缓冲液，其pH为5.5；步骤七中所述的缓冲液为醋酸盐-磷酸盐缓冲液，其pH为5.5。其它步骤与实施例2相同。
按照实施例1至4方法分别对同种过完筛的待测土壤进行检测5次，检测结果如表1所示。
表1
表1为4个实施例的有效分光比色值。其中样品编号A为采用实施例1方法测定的5份过完筛的待测土壤蔗糖酶活性的测试结果，样品编号B为采用实施例2的方法测定的5份过完筛的待测土壤蔗糖酶活性的测试结果，样品编号C为采用实施例3的方法测定的5份过完筛的待测土壤蔗糖酶活性的测试结果，样品编号D为采用实施例4的方法测定的5份过完筛的待测土壤蔗糖酶活性的测试结果。采用实施例1测定得到的土壤蛋白酶活性变异系数为0.60％，显示出较好的准确性。