丙氨酰谷氨酰胺注射液中一个四肽类杂质的分离制备方法与流程

本发明属于药物杂质研究
技术领域：
，具体涉及丙氨酰谷氨酰胺注射液中的一个四肽类微量杂质的分离制备方法。
背景技术：
：化学药物在临床使用中会产生一些不良反应，这个不良反应除了与药品本身的药理活性有关外，与药品中存在的杂质也有很大关系。因此，对于化学药品各个国家药典均在附录中设有专门的杂质检验通则，中国药典二部从(2005)开始附录中设有药物杂质研究指导原则，国家食品药品监督管理局也发布了《化学药物杂质研究的技术指导原则》。针对药物中的杂质，必须依据其生理活性制定其质控限度，其中包括：药品中的杂质被有效的分离，从而保证药品质量，减少药物的不良反应。药物杂质的分离制备是药物研究中最为关键的技术之一。中国药典(2015年版)明确规定，丙氨酰谷氨酰胺注射液中单个未知杂质的含量不得超过0.5％。由于丙氨酰谷氨酰胺分子结构的特殊性，在高温灭菌过程中易引入类似结构副产物，由于其化学结构的相似性，传统的分离方法如萃取、重结晶、蒸馏和TLC都很难将其分离。分析型的HPLC只能获得微克级的产物，为了获得高品质的丙氨酰谷氨酰胺注射液，需提取其主要杂质并进行结构确证。已经公开发表于《JournalofChromatographyA》的“Quantitativehigh-performanceliquidchromatography–tandemmassspectrometryimpurityprofilingmethodsfortheanalysisofarenteralinfusionsolutionsforaminoacidsupplementationcontainingl-alanyl-l-glutamine”(2012,1259,111-120)一文中告知了一种四肽类微量杂质，其分子量为417.2Da，分子式为C16H27N5O8，氨基酸序列为：L-Ala-L-Glu-(L-Ala-L-Gln)，化学结构式如(I)所示：技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种丙氨酰谷氨酰胺注射液中分离制备四肽类微量杂质的方法；以便于对丙氨酰谷氨酰胺注射液系列产品进行质量控制。为了解决上述技术问题，本发明提供一种丙氨酰谷氨酰胺注射液中一个四肽类微量杂质的分离制备方法，包括以下步骤：1)、采用高效液相色谱法(制备型高效液相色谱法)对丙氨酰谷氨酰胺注射液中的四肽杂质进行预分离：所述高效液相色谱法以氨丙基键合硅胶为固定相，以乙腈-甲酸铵缓冲液为流动相进行等度洗脱；该四肽类微量杂质的分子式为C16H27N5O8；通过紫外检测器的在线监测，收集、合并目标馏分并冷冻干燥，得四肽杂质粗品；2)、采用高效液相色谱法(制备型高效液相色谱法)对步骤1)所得到的四肽杂质粗品进行精制纯化：所述高效液相色谱法以氨丙基键合硅胶为固定相，以乙腈-甲酸缓冲液为流动相进行等度洗脱；通过紫外检测器的在线监测，收集、合并目标馏分并冷冻干燥，得到纯化的四肽类杂质。作为本发明的四肽类微量杂质的分离制备方法的改进：所述步骤1)中：甲酸铵缓冲液为甲酸铵水溶液，甲酸铵浓度为10mM～20mM；氨丙基键合硅胶的粒径为20～30μm；流动相中，乙腈的体积含量均为30％～60％(较佳为40％)；流动相的pH值均为3.0～4.5(较佳为4)。所述步骤2)中：甲酸缓冲液为甲酸水溶液，甲酸体积浓度为0.1～0.2％；氨丙基键合硅胶的粒径≤7μm；流动相中，乙腈的体积含量均为30％～60％(较佳为50％)。在本发明中，步骤1)的洗脱流速为40～60ml/min(较佳为50ml/min)；步骤2)的洗脱流速为8～12ml/min(较佳为10ml/min)。在本发明中，步骤1)和步骤2)所用的氨丙基键合硅胶均可通过常规市购方式获得，例如：步骤1)所用的氨丙基键合硅胶可购自日本YMC公司生产的NHG12S21的氨丙基键合硅胶；步骤2)所用的氨丙基键合硅胶可购自日本YMC公司生产的NH12S05-2520WT的氨丙基键合硅胶。本发明所述的丙氨酰谷氨酰胺注射液中的四肽类微量杂质，其分子量为417.2Da，分子式为C16H27N5O8，氨基酸序列为：L-Ala-L-Glu-(L-Ala-L-Gln)，化学结构式如上述(I)所示。本发明通过制备型高效液相色谱方法将丙氨酰谷氨酰胺注射液中的一个含量仅为0.3％的四肽类微量杂质进行高效分离与制备，并采用高分辨质谱(HRMS)、一维及二维核磁共振谱(1D/2D-NMR)对该杂质的化学结构式进行结构鉴定，最终确证其分子式及化学结构。采用本发明的方法能获得高纯度的四肽类微量杂质。本发明为生产丙氨酰谷氨酰胺注射液系列产品的质量研究及杂质定性、定量控制提供了较好的杂质对照品，可以为申报临床用药制定杂质限量提供可靠依据。附图说明下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类微量杂质的结构图；图2是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类微量杂质的色谱图；图3是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类微量杂质的高分辨质谱图；图4是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类微量杂质的核磁共振氢谱图；图5是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类微量杂质的核磁共振碳谱图；图6是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类微量杂质的核磁共振DEPT135°谱图；图7是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类微量杂质的二维核磁共振(1H-1HCOSY)谱图；图8是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类微量杂质的二维核磁共振(HSQC)谱图；图9是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类微量杂质的核磁共振二维(HMBC)谱图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例1、丙氨酰谷氨酰胺注射液中一个四肽类微量杂质的预分离：将丙氨酰谷氨酰胺注射液冻干粉400.0g用500ml蒸馏水溶解，过滤(过0.45μm孔径的滤膜)，收集滤液备用。制备色谱分离条件为：高效液相色谱仪型号：汉邦NP7010色谱柱：50×250mm，内装满氨丙基键合硅胶为固定相填料，该填料粒径为20μm，孔径为流速：50ml/min。检测波长：215nm。流动相：乙腈-甲酸铵缓冲液(体积比为40:60，其中甲酸铵缓冲液中的甲酸铵浓度为20mmol/l，并用甲酸调节至pH值为4.0)。洗脱方式：等度洗脱。上样量：40.0g(50ml)。纯化过程：使色谱柱平衡15分钟后上样并进行等度洗脱，监测并分段收集馏分，对所收集的馏分进行检测(下述药典方法，按面积归一化法进行测定)，将目的峰馏分合并、除去乙腈后冻干，待后续精制分离。分十次进样(即，每次上样量为4g)，重复以上操作，共获得四肽杂质粗品4.0g，HPLC检测纯度为60.02％(面积归一化法，按照中国药典2015年版通则0512进行测定，以下同)。备注说明：洗脱时间共计50分钟，收集第36～41分钟的洗脱液，从而实现将目的峰馏分合并。实施例2、丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类的杂质的精制分离将实施例1中的四肽杂质粗品4.0g用50ml蒸馏水溶解，过滤(过0.45μm孔径的滤膜)，收集滤液备用。制备色谱精制分离条件：高效液相色谱仪型号：Waters600色谱柱：20×250mm，内装满氨丙基键合硅胶为固定相填料，该填料粒径为5μm，孔径为流速：10ml/min。检测波长：215nm。流动相：乙腈-甲酸缓冲液(体积比为50:50，其中甲酸缓冲液的甲酸浓度为0.1％)。洗脱方式：等度洗脱。上样量：400mg(5ml)。纯化过程：使色谱柱平衡30分钟后上样并进行等度洗脱，监测并收集目的峰馏分。将目的峰馏分减压旋蒸浓缩至20ml后冻干(此步骤可除去甲酸、乙腈)。分十次进样，重复以上操作。备注说明：洗脱时间共计30分钟，收集第21～24分钟的洗脱液；从而实现收集目的峰馏分。最终获得白色粉末状固体四肽杂质0.22g，纯度98.56％(按照中国药典2015年版通则0512进行测定，以下同)。结果见图2，其中横坐标代表以分钟计的运行时间，纵坐标代表吸收强度，统计结果见表1。表1、丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽杂质的色谱检测结果实施例3、丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类的杂质的结构确证高分辨质谱(HR-MS)：质谱仪型号：Agilent6210TOF-MS。测定模式：电喷雾正离子模式。目标杂质(即，实施例2所得的白色粉末状固体四肽杂质)在正离子模式下的高分辨电喷雾质谱测定结果见图3，其中产生质子化离子[M+H]+m/z418.1944，对应的元素组成为C16H28N5O8(418.1932)，误差为-2.78ppm，产生钾加合离子[M+K]+m/z456.1498，对应的元素组成为C16H27KN5O8(456.1491)，误差为-1.63ppm，根据以上数据，可以确证目标杂质的分子式为C16H27N5O8，数据结果见表2。表2、丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽杂质的高分辨质谱检测结果核磁共振谱(NMR)：仪器型号：Agilent公司600兆NMR仪。测定条件：氘代重水作溶剂，TMS作内标。目标杂质的一维及二维核磁共振谱图1H-NMR、13C-NMR、DEPT135、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC见图4-9，测定数据及解析列于表3、表4，分子编号如下：表3、目标杂质的核磁共振氢谱数据及归属表4、目标杂质的核磁共振碳谱数据及归属原子序号13C-NMRDEPT135HSQCHMBC151.24CH3.7215-CH32172.94C＝O/15-CH3356.28CH3.75H-5429.57CH21.72H-5,H-3533.75CH21.93H-46180.78C＝O/H-5752.13CH3.8816-CH38177.24C＝O/16-CH3956.81CH3.77H-111029.37CH21.55H-11,H-91134.08CH21.99H-1012177.67C＝O/H-11,H-1013179.81-COOH/H-3,H-414179.90-COOH/H-9,H-1015-CH318.96CH30.97H-116-CH318.87CH31.15H-7对比例1、将实施例1中的固定相填料由“氨丙基键合硅胶(粒径为20μm，孔径为)”改成“氨丙基键合硅胶(粒径为50μm，孔径为)”，其余等同于实施例1。即，也将目的峰馏分合并、除去乙腈后冻干。对比例2、将实施例1的乙腈-甲酸铵缓冲液改为乙腈-磷酸二氢钾缓冲液(磷酸二氢钾缓冲液为浓度为0.05mol/l的磷酸二氢钾水溶液，并用磷酸调节至pH值为4.0)，其余同实施例1。即，也将目的峰馏分合并、除去乙腈后冻干。对比例3-1、将实施例1的流动相中的甲酸铵浓度由“20mmol/l”改成“40mmol/l”，其余同实施例1。即，也将目的峰馏分合并、除去乙腈后冻干。对比例3-2、将实施例1的流动相中的甲酸铵浓度由“20mmol/l”改成“3mmol/l”，其余同实施例1。即，也将目的峰馏分合并、除去乙腈后冻干。对比例4-1、将实施例1的乙腈-甲酸铵缓冲液的体积比由“40:60”改成“20:80”，其余同实施例1。即，也将目的峰馏分合并、除去乙腈后冻干。对比例4-2、将实施例1的乙腈-甲酸铵缓冲液的体积比由“40:60”改成“70:30”，其余同实施例1。即，也将目的峰馏分合并、除去乙腈后冻干；对比例5-1、将实施例1的乙腈-甲酸铵缓冲液的pH值由“4.0”调节成“2.8”，其余同实施例1。即，也将目的峰馏分合并、除去乙腈后冻干。对比例5-2、将实施例1的乙腈-甲酸铵缓冲液的pH值由“4.0”调节成“7.0”，其余同实施例1。即，也将目的峰馏分合并、除去乙腈后冻干。上述所有对比例所得的四肽杂质粗品的纯度如表1所述。将上述所有对比例所得的四肽杂质粗品按照实施例2所述方法进行精制提纯，最终获得白色粉末状固体四肽杂质的纯度如表5所述。表5对比例6、将实施例2中的固定相填料由“氨丙基键合硅胶(粒径为5μm，孔径为)”改成“氨丙基键合硅胶(粒径为10μm，孔径为)”，其余同实施例2。对比例7、将实施例2中的乙腈-甲酸缓冲液改为乙腈-磷酸二氢钾缓冲液(磷酸二氢钾缓冲液为浓度为0.05mol/l的磷酸二氢钾水溶液，并用磷酸调节至pH值为4.0)，其余同实施例2。对比例8、将实施例2中的乙腈-甲酸缓冲液改为乙腈-甲酸铵缓冲液(甲酸铵缓冲液为浓度为10mmol/l的甲酸铵水溶液，并用甲酸调节至pH值为4.0)，其余同实施例2。对比例9-1、将实施例2的流动相中的甲酸浓度由“0.1％”改成“0.5％”，其余同实施例2。对比例9-2、将实施例2的流动相中的甲酸浓度由“0.1％”改成“0.01％”，其余同实施例2。对比例10-1、将实施例2的乙腈-甲酸缓冲液的体积比由“50:50”改成“20:80”流动相中的甲酸浓度由“0.1％”改成“0.5％”，其余同实施例2。对比例10-2、将实施例2的乙腈-甲酸铵缓冲液的体积比由“50:50”改成“70:30”，其余同实施例2。实施例1所得的四肽杂质粗品按照上述所有对比例6～对比例10系列所述方法进行精制分离，所得白色粉末状固体四肽杂质的纯度如表6所述。表6白色粉末状固体四肽杂质的HPLC检测纯度对比例689.73％对比例792.50％(需通过其他脱盐步骤除去磷酸二氢钾)对比例894.2％(需通过其他脱盐步骤除去甲酸铵)对比例9-172.55％对比例9-264.71％对比例10-166.89％对比例10-252.14％最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。当前第1页1 2 3