一种基于纳米NiCo2O4@AD双功能催化剂的电化学发光免疫传感器的制备方法及应用与流程

本发明属于新型功能材料与生物传感检测技术领域，具体涉及一种基于纳米NiCo₂O₄@AD双功能催化剂的电化学发光免疫传感器的制备方法及应用。

背景技术：

前列腺素E1 (PGE1)，广泛存在于体内的生物活性物质，是前列腺素家族中的重要成员，其对多器官系统中细胞功能有着多样化及强大的作用。作为一种环氧合酶的花生四烯酸代谢产物，PGE1与炎前和抗炎作用及骨质疏松症相关，一些研究发现PGE1能减少脊髓损伤引起的的压迫损伤并且其对骨质疏松症治疗理有一定的有益效果。PGE1，作为一种有效的血管扩张剂，具有扩张血管、改善末梢循环和抑制血小板聚集、防止血栓形成作用，其通过增加心输出量和降低充盈压和肺血管阻力对严重心脏衰竭患者具有有益的血流动力学效应。PGE1与血管疾病和肺部疾病密切相关，它在监测和量化人体前列腺素水平中有着关键的作用，因此在临床研究上，发展一种快速、简便、灵敏和低成本的PGE1的检测方法有着巨大的需求及重要的意义。

电化学发光免疫传感器，利用抗原与抗体之间的特异性结合的一类生物传感器，具有灵敏度高、选择性好、操作简便、易于小型化、可连续快速、自动化检测分析等优点，具有良好的应用前景。本发明制备了一种基于NiCo₂O₄@AD双功能催化剂的电化学发光免疫传感器，并实现对前列腺素E1的高灵敏检测。已有文献报道有着多种价态的过渡金属的氢氧化物或氧化物，如Co₃O₄, NiO, Ni(OH)₂ and NiCo₂O₄，对析氧反应过程有一定的催化作用。其中，由于Ni²⁺/Ni³⁺及Co²⁺/Co³⁺氧化还原电对的贡献，NiCo₂O₄具有更好的电子传导能力及电化学活性。本发明通过将金刚烷修饰到NiCo₂O₄纳米片表面进而制得双功能催化剂NiCo₂O₄@AD，由于该复合物具有大比表面积及良好的生物相容性，可提供更多电活性位点及生物分子固定位点，其修饰电极对析氧反应过程展示了优异的催化性能并能显著提高S₂O₈²⁻电化学发光体系的灵敏度及稳定性。基于NiCo₂O₄@AD优异的生物相容性及高催化性能，所制得的免疫传感器具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测限低等优点。

技术实现要素：

本发明的目的之一是基于纳米NiCo₂O₄@AD材料，构建一种无标记，稳定性好，灵敏度高的电化学发光免疫传感器的制备。

本发明的目的之二是将该电化学发光免疫传感器应用于前列腺素E1的高灵敏检测。

为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：

1.一种基于NiCo₂O₄@AD双功能催化剂的电化学发光免疫传感器的制备方法：

（1） 玻碳电极（GCE）首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；

（2） 滴加3μL 浓度为 0.5 mg/mL 的NiCo₂O₄@AD悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，制得NiCo₂O₄@AD修饰玻碳电极；

（3） 滴加30 μL 浓度为 2.0 wt%的戊二醛溶液于NiCo₂O₄@AD修饰电极表面活化1 h；

（4） 滴加30 μL前列腺素E1抗体（anti-PGE1）溶液于修饰电极表面并在4°C冰箱中孵育40 min，用去离子水洗去物理吸附的anti-PGE1，制得NiCo₂O₄@AD/ anti-PGE1修饰玻碳电极；

（5） 取40μL 浓度为1.0 wt.%的BSA 滴加到修饰电极表面4°C冰箱中孵育1 h，以封闭电极表面上非特异性活性位点，用去离子水冲洗电极表面洗去物理吸附，并保存在4°C冰箱中；

（6） 取30 μL浓度为0.1 fg/ml–1.0 ng/ml的前列腺素E1标准溶液滴于NiCo₂O₄@AD/ anti-PGE1修饰电极表面并在4°C冰箱中孵育40 min，用pH7.5的 PBS缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于纳米NiCo₂O₄@AD双催化剂的PGE1电化学发光免疫传感器。

2.上述NiCo₂O₄@AD材料的制备：1.0 mL 浓度为1.0 mg/mL 的NiCo₂O₄与1.0 mL 浓度为1.0wt %的3-氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES) 混合振荡12h，离心收集氨基功能化的NiCo₂O₄产物并重新分散在2.0 mL的去离子水中；然后将（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化的1-金刚烷甲酸与氨基功能化的NiCo₂O₄产物混合振荡2h，制得金刚烷修饰的NiCo₂O₄ (NiCo₂O₄@AD), 离心收集NiCo₂O₄@AD产物并重新分散在2.0 mL的去离子水中。

3.上述NiCo₂O₄材料的制备：用20 mL 乙醇及40 mL 去离子水配制浓度为1 mmol 的 Ni(NO₃)₂·6H₂O溶液, 浓度为2 mmol的Co(NO₃)₂·6H₂O 溶液及浓度为4.5 mmol 的六亚甲基四胺的混合溶液，将混合溶液转移到 100 mL 聚四氟乙烯反应釜内衬中，90 ºC下磁力搅拌24 h后冷却至室温，通过离心收集沉淀物并用去离子水及乙醇洗涤数次，在烘箱中60 ºC下烘干12 h，最后，在空气中350 ºC 煅烧2 h 获得介孔NiCo₂O₄ 纳米片。

4.本发明上述方法制备的一种基于纳米NiCo₂O₄@AD双功能催化剂的电化学发光免疫传感器。

5.前列腺素E1的检测步骤：

（1）使用电化学工作站采用三电极体系进行测定，以上述制备的一种基于纳米NiCo₂O₄@AD双催化剂的电化学发光免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，在0.1mol/ml K₂S₂O₈的pH 8.0的 PBS缓冲溶液中进行测试；

（2）采用循环伏安电压对不同浓度的前列腺素E1标准溶液进行检测，扫描电压范围为0.8V–-1.8 V，扫描速率为100 mV/s，通过电致化学发光设备采集电致化学发光信号，光电倍增管电压为900V，通过所得的电致化学发光强度与前列腺素E1标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；

（3）待测样品溶液代替前列腺素E1标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。

本发明的显著优点为：

(1)由于Ni²⁺/Ni³⁺及Co²⁺/Co³⁺氧化还原电对的贡献，NiCo₂O₄具有优异的电子传导性及电化学活性，同时具有大比表面积及介孔结构的NiCo₂O₄纳米片可提供更多电活性位点及生物分子固定位点。金刚烷具有大比表面积及较好的供电子能力。本发明通过将金刚烷修饰到NiCo₂O₄纳米片表面制得双功能催化剂NiCo₂O₄@AD，该复合物修饰电极对析氧反应过程展示了优异的催化性能并能显著提高S₂O₈²⁻电化学发光体系的灵敏度及稳定性，本发明制备的免疫传感器具有较高的灵敏度。

(2)NiCo₂O₄@AD具有大比表面积及良好的生物兼容性有利于抗体在电极表面的固定，本发明制备的免疫传感器具有较好的稳定性。

(3)本发明利用抗原、抗体的免疫反应，提高了检测方法的特异性。

附图说明

图1A为NiCo₂O₄ 纳米片的电子发射扫描电子显微镜（SEM）图。

图1B为NiCo₂O₄ 纳米片的透射电子显微镜（TEM）图。

图1B插图为NiCo₂O₄ 纳米片的高分辨透射电子显微镜（HRTEM）图。

图2为NiCo₂O₄@AD的红外光谱（IR）图。

图3为免疫传感电极的电化学发光响应信号与前列腺素E1标准溶液浓度的线性关系图。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1

1.一种基于纳米NiCo₂O₄@AD双功能催化剂的电化学发光免疫传感器的制备：

（1） 玻碳电极（GCE）首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；

（2） 滴加3μL 浓度为 0.5 mg/mL 的NiCo₂O₄@AD悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，制得NiCo₂O₄@AD修饰玻碳电极；

（3） 滴加30 μL 浓度为 2.0wt %的戊二醛溶液于NiCo₂O₄@AD修饰电极表面活化1 h；

（4） 滴加30 μL前列腺素E1抗体（anti-PGE1）溶液于修饰电极表面并在4°C冰箱中孵育40 min，用去离子水洗去物理吸附的anti-PGE1，制得NiCo₂O₄@AD/ anti-PGE1修饰玻碳电极；

（5） 取40μL 浓度为1.0 wt.%的BSA 滴加到修饰电极表面4°C冰箱中孵育1 h，以封闭电极表面上非特异性活性位点，用去离子水冲洗电极表面洗去物理吸附，并保存在4°C冰箱中；

（6） 取30 μL浓度为0.1 fg/ml–1.0 ng/ml的PGE1标准溶液滴于NiCo₂O₄@AD/ anti-PGE1修饰电极表面并在4°C冰箱中孵育40 min，用pH7.5的 PBS缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于纳米NiCo₂O₄@AD双催化剂的PGE1电化学发光免疫传感器。

实施例2

NiCo₂O₄材料的制备：

用20 mL 乙醇及40 mL 去离子水配制浓度为1 mmol 的 Ni(NO₃)₂·6H₂O溶液, 浓度为2 mmol 的 Co(NO₃)₂·6H₂O 溶液及浓度为4.5 mmol 的六亚甲基四胺的混合溶液，将混合溶液转移到 100 mL 聚四氟乙烯反应釜内衬中，90 ºC下磁力搅拌24 h后冷却至室温，通过离心收集沉淀物并用去离子水及乙醇洗涤数次，在烘箱中60 ºC下烘干12 h，最后，在空气中350 ºC 煅烧2 h 获得介孔NiCo₂O₄ 纳米片。NiCo₂O₄ 纳米片的电子发射扫描电子显微镜（SEM）图及透射电子显微镜（TEM）图，如图1A及图1B所示，表明NiCo₂O₄纳米片是由NiCo₂O₄纳米粒子单元相互连接构成，形成大量的粒间孔隙，这样的多孔结构将极大地增加电活性位点。高分辨透射电子显微镜（HRTEM）图，如图1B中插图所示，可见清晰的约0.25 nm的晶格条纹，与尖晶石NiCo₂O₄（311）晶面一致。

实施例3

NiCo₂O₄@AD材料的制备：

1.0 mL 浓度为1.0 mg/mL 的NiCo₂O₄与1.0 mL 浓度为1.0 wt%的3-氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES) 混合振荡12h，离心收集氨基功能化的NiCo₂O₄产物并重新分散在2.0 mL的去离子水中；然后将（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化的1-金刚烷甲酸与氨基功能化的NiCo₂O₄产物混合振荡2h，制得金刚烷修饰的NiCo₂O₄ (NiCo₂O₄@AD), 离心收集NiCo₂O₄@AD产物并重新分散在2.0 mL的去离子水中。NiCo₂O₄@AD的红外光谱（IR）图，如图2所示，在1666 cm^-1和3185 cm^-1处有吸收峰出现，这是典型的酰胺基团中C = O及N-H基团的伸缩振动吸收峰，表明了NiCo₂O₄@AD的成功制备。

实施例4

前列腺素E1的检测步骤：

（1）使用电化学工作站采用三电极体系进行测定，以所制备的一种基于纳米NiCo₂O₄@AD双催化剂的电化学发光免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，在0.1mol/ml K₂S₂O₈的pH 8.0的 PBS缓冲溶液中进行测试；

（2）采用循环伏安电压对不同浓度的前列腺素E1标准溶液进行检测，扫描电压范围为0.8V–-1.8 V，扫描速率为100 mV/s，通过电致化学发光设备采集电致化学发光信号，光电倍增管电压为900V，通过所得的电致化学发光强度与前列腺素E1标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线，图3为免疫传感电极的电化学发光响应信号与前列腺素E1标准溶液浓度的线性关系图；

（3）待测样品溶液代替前列腺素E1标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。