一种定量检测DNA含量的SYBRGreenI定量检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及生物化学及分子生物学领域，具体涉及一种定量检测DNA含量的SYBR Green I定量检测试剂盒及其检测方法，适用于各种DNA的定量检测。

背景技术：

在分子生物学领域进行DNA分析时常常需要对DNA进行准确定量。在临床诊断方面，病毒DNA的定量检测是临床诊断的重要依据。

SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。

SYBR Green I核酸凝胶染液是一种高敏感性的荧光染液，可用于检测琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺凝胶中的双链DNA和寡核苷酸。当染液与核酸结合后，SYBR Green I核酸凝胶染液的荧光信号会明显增强，因此经SYBR Green I核酸凝胶染液染色的凝胶显示出非常好的性价比，没有背景荧光。

目前，常规利用SYBR Green I荧光染料检测DNA含量的方法存在以下方面的不足：

1、PCR扩增过程中SYBR Green I荧光染料与DNA结合的方法存在非特异性扩增导致定量不准确的风险；

2、SYBR Green I荧光染料直接作用于样本存在对样本含量、检测仪器灵敏度要求高的问题，检测成本较高，而且样本中其他杂质也会对检测结果造成一定影响，导致定量不准确。

技术实现要素：

针对以上现有技术问题，本发明的目的在于提供一种定量检测DNA含量的SYBR Green I定量检测试剂盒及其检测方法，排出了样本中其他杂质和非特异性扩增产物对最终检测结果的影响，更准确、低成本的完成DNA含量的定量检测，包括以下步骤：粗滤；琼脂糖凝胶电泳；DNA回收；SYBR Green I荧光染色；检测及结果分析。该方法利用简化的DNA回收方法得到高纯度的DNA，再通过SYBR Green I染色和紫外分光光度计检测荧光，计算分析得到DNA浓度。具体技术方案如下：

一种定量检测DNA含量的SYBR Green I定量检测试剂盒，包括盒体，支架，第一EP管以及第二EP管，其中，所述盒体内设置支架；所述支架上设有4-6个管架；所述第一EP管设置于第一管架上，所述第一EP管底部设有钻孔，管内设有定性滤纸；所述第二EP管设置于第二管架上，所述第二EP管底部设有钻孔，管内设有定性滤纸。

进一步地，还包括盒盖，所述盒盖一侧连接至盒体并用于扣合盒体。

进一步地，所述第一EP管为0.5ml或1.5ml的EP管，所述第二EP管为0.5ml或1.5ml的EP管。

上述定量检测DNA含量的SYBR Green I定量检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

(1)粗滤；

(2)琼脂糖凝胶电泳；

(3)DNA回收；

(4)SYBR Green I荧光染色；

(5)检测；

(6)结果分析。

进一步地，步骤(1)中包括：(1-1)取待测样品放入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管中，再将这个0.5ml的EP管套入一个1.5ml的EP管中；(1-2)将套好的EP管离心，去掉0.5ml的EP管，并将1.5ml的EP管得到液体全部进行琼脂糖凝胶电泳。

进一步地，步骤(2)中包括：(2-1)配胶；(2-2)电泳准备；(2-3)上样；(2-4)电泳。

进一步地，步骤(3)中包括：(3-1)将切下来的含目的DNA的胶块切碎，放入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管中，再将这个0.5ml的EP管套入一个1.5ml的EP管中；(3-2)将套好的EP管离心，去掉0.5ml的EP管，并将1.5ml的EP管得到液体定容；(3-3)加入NaAc和无水乙醇，冷冻；沉淀干燥后溶于TE溶液。

进一步地，步骤(4)中包括：(4-1)加入与DNA复溶液等体积的稀释好的SYBR Green I工作液，混匀；(4-2)放置30分钟左右。

进一步地，步骤(5)中包括：(5-1)将染色好的DNA溶液放置到紫外分光光度计上，260nm波长处分别读取荧光值A260；(5-2)根据W_dsDNA＝A260×50μg/ml公式换算待测样品中目的DNA含量。

进一步地，(2-1)配胶：根据基因组片段大小，配置相应浓度的琼脂糖凝胶；取适量的琼脂和TAE缓冲液至锥形瓶中，摇匀并用锡纸封口，放入微波炉煮，煮好的凝胶应无气泡、色泽均匀；将煮好的凝胶放入65℃的水浴锅中，待凝胶冷却至65℃时，加入适量的SYBR Green I荧光染料，及时将凝胶倒入装好的干净电泳模具中；待凝胶完全凝固后，小心的将梳子拔出；(2-2)电泳准备：把凝胶连同胶托一起放入电泳槽正中央，胶孔的方向朝向负极，往电泳槽中倒入一定量的TAE缓冲液至刚好将凝胶淹没；(2-3)上样：将样品、6×溴酚蓝按5：1的比例混匀，轻甩后按照规定的顺序上样；(2-4)电泳：上样后，盖上电泳槽盖，接通电泳仪和电泳槽，设置电泳参数：120V 30min。

本发明方法操作简便、成本低廉、准确度高。

附图说明

图1为本发明电泳后得到的电泳图

图2是已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管示意图

图3是套入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml EP的1.5ml的EP管示意图

图4是一种定量检测DNA含量的SYBR Green I定量检测试剂盒

图中：泳道1、2为待测样品A，泳道3、4为DNA标准对照

具体实施方式

下面根据附图对本发明进行详细描述，其为本发明多种实施方式中的一种优选实施例。

在一个优选实施例中，一种定量检测DNA含量的SYBR Green I定量检测试剂盒及其检测方法，进一步地包括以下步骤：

(1)粗滤：

①取待测样品100μl，放入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管中，再将这个0.5ml的EP管套入一个1.5ml的EP管中；

②将套好的EP管在4℃10000rpm下离心10min，去掉0.5ml的EP管，并将1.5ml的EP管得到液体全部进行琼脂糖凝胶电泳；

(2)琼脂糖凝胶电泳：

①配胶：根据基因组片段大小，配置相应浓度的琼脂糖凝胶。取适量的琼脂和TAE缓冲液至锥形瓶中，摇匀并用锡纸封口，放入微波炉煮，煮好的凝胶应无气泡、色泽均匀。将煮好的凝胶放入65℃的水浴锅中，待凝胶冷却至65℃时，加入适量的SYBR Green I荧光染料，及时将凝胶倒入装好的干净电泳模具中。待凝胶完全凝固后，小心的将梳子拔出；

②电泳准备：把凝胶连同胶托一起放入电泳槽正中央，胶孔的方向朝向负极，往电泳槽中倒入一定量的TAE缓冲液至刚好将凝胶淹没；

③上样：将样品、6×溴酚蓝按5：1的比例混匀，轻甩后按照规定的顺序上样；

④电泳：上样后，盖上电泳槽盖，接通电泳仪和电泳槽，设置电泳参数：120V 30min；

(3)DNA回收：

①将切下来的含目的DNA的胶块切碎，放入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管中，再将这个0.5ml的EP管套入一个1.5ml的EP管中；

②将套好的EP管在4℃10000rpm下离心10min，去掉0.5ml的EP管，并将1.5ml的EP管得到液体用移液枪定容；

③加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.5)和2倍体积的无水乙醇，在-20℃冷冻30min以上。沉淀干燥后溶于20μl TE溶液(pH 7.8)。

(4)SYBR Green I荧光染色：

①加入与DNA复溶液等体积的稀释好的SYBR Green I工作液(稀释比例根据SYBR Green I的说明书)，混匀；

②放置30分钟。

(5)检测及结果分析：

①将染色好的DNA溶液放置到紫外分光光度计上，260nm波长处分别读取荧光值A260；

②根据W_dsDNA＝A260×50μg/ml公式换算待测样品中目的DNA含量。

粗滤步骤①取待测样品100μl，放入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管中，再将这个0.5ml的EP管套入一个1.5ml的EP管中；DNA回收步骤①将切下来的含目的DNA的胶块切碎，放入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管中，再将这个0.5ml的EP管套入一个1.5ml的EP管中；DNA回收步骤②将套好的EP管在4℃10000rpm下离心5～10min，去掉0.5ml的EP管，并将1.5ml的EP管得到液体用移液枪定容；DNA回收步骤③加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.5)和2倍体积的无水乙醇，在-20℃冷冻30min以上。沉淀干燥后溶于20μl TE溶液(pH 7.8)。

在另一个优选实施例中，一种SYBR Green I荧光染料定量检测DNA含量的方法，通过粗滤、琼脂糖凝胶电泳、DNA回收、SYBR Green I荧光染色、检测及结果分析完成待测样品DNA的定量检测，具体包括以下步骤：

1、粗滤：

(1)取待测样品100μl，放入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管中，再将这个0.5ml的EP管套入一个1.5ml的EP管中；

(2)将套好的EP管在4℃10000rpm下离心5～10min，去掉0.5ml的EP管，并将1.5ml的EP管得到液体全部进行琼脂糖凝胶电泳；

2、琼脂糖凝胶电泳：

(1)配胶：根据基因组片段大小，配置相应浓度的琼脂糖凝胶。取适量的琼脂和TAE缓冲液至锥形瓶中，摇匀并用锡纸封口，放入微波炉煮，煮好的凝胶应无气泡、色泽均匀。将煮好的凝胶放入65℃的水浴锅中，待凝胶冷却至65℃时，加入适量的SYBR Green I荧光染料，及时将凝胶倒入装好的干净电泳模具中。待凝胶完全凝固后，小心的将梳子拔出；

(2)电泳准备：把凝胶连同胶托一起放入电泳槽正中央，胶孔的方向朝向负极，往电泳槽中倒入一定量的TAE缓冲液至刚好将凝胶淹没；

(3)上样：将样品、6×溴酚蓝按5：1的比例混匀，轻甩后按照规定的顺序上样；

(4)电泳：上样后，盖上电泳槽盖，接通电泳仪和电泳槽，设置电泳参数：120V 30min；

3、DNA回收：

(1)将切下来的含目的DNA的胶块切碎，放入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管中，再将这个0.5ml的EP管套入一个1.5ml的EP管中；

(2)将套好的EP管在4℃10000rpm下离心5～10min，去掉0.5ml的EP管，并将1.5ml的EP管得到液体用移液枪定容；

(3)加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.5)和2倍体积的无水乙醇，在-20℃冷冻30min以上。沉淀干燥后溶于20μl TE溶液(pH 7.8)。

4、SYBR Green I荧光染色：

(1)加入与DNA复溶液等体积的稀释好的SYBR Green I工作液(稀释比例根据SYBR Green I的说明书)，混匀；

(2)放置30分钟。

5、检测及结果分析：

(1)将染色好的DNA溶液放置到紫外分光光度计上，260nm波长处分别读取荧光值A260；

(2)根据W_dsDNA＝A260×50μg/ml公式换算待测样品中目的DNA含量。

参照图1，应用本发明检测待测样品A中基因片段长度约1kb的DNA含量，同时设定一组已知DNA浓度(30ng/μl)的标准对照，经过粗滤和琼脂糖凝胶电泳后得到电泳图1，再经过DNA回收、SYBR Green I荧光染色和检测及结果分析，测得结果如表2：

表2

如图2所示，该EP管包含已在底部钻好孔的0.5ml的EP 21和定性滤纸22。如图3所示，该EP管包含已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管31和1.5ml的EP管32。如图4所示，该试剂盒包括图2所示的已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml的EP管41和图3所示的套入已在底部钻好孔并放入小块定性滤纸的0.5ml EP的1.5ml的EP管42。

上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。