一种定性检测乳糜的方法及试剂盒与流程

本发明涉及检测方法
技术领域：
，特别是涉及一种定性检测乳糜的方法及试剂盒。
背景技术：
：正常人体淋巴液是一种无色透明的液体，富含脂肪。外伤、感染等会造成淋巴管堵塞，该处淋巴循环途径中断，淋巴液逆流至其它系统的淋巴管中，引起其它系统淋巴管内压力增高、曲张破裂，淋巴液漏入尿液、胸水、腹水中；或者被破坏部位淋巴液压力大于组织液压力或体腔内压时，淋巴液会漏到尿液、胸水、腹水中，就会产生乳白色的体液，即乳糜尿、乳糜胸水、乳糜腹水等乳糜体液。临产医生在观察到这些乳白色体液后，会送到检验科进行乳糜试验来确定该乳白色体液中乳白色物质的来源。若乳糜试验结果为阳性，则认定此乳白色体液是真性乳糜样本。乳糜试验是一种现在常用的用来检测体液(如尿液、腹水和胸水等)中是否含有乳糜(漏入体液中的淋巴液携带的脂肪颗粒)的试验方法。按照《临床检验操作规程》，该试验利用脂肪特性，用乙醚萃取乳糜微粒脂肪小滴，再用脂溶性染料苏丹III醋酸乙醇溶液对乙醚提取物进行染色；萃取物染色后涂片，显微镜下可见脂肪颗粒被染成大小不等的橘红色球形小滴。《临床检验操作规程》(第三版)中乳糜尿检查是针对尿液样本的检测方法，其他体液的检测也是参照这个方法进行的。乳糜试验用于检查证实真性乳糜体液，通过判断样本中是否含有脂肪颗粒以确定样本是否为乳糜尿、乳糜腹水或乳糜胸水。常规的乳糜试验需要使用乙醚萃取脂肪颗粒，检测一个样本乙醚的使用量是2-5ml，一般每天要检测十几个样本，按50个样本计，每天的乙醚使用量为100-250ml，一个月的使用量可达3000-7500ml。然而，由于乙醚易燃、挥发污染程度重、具有麻痹神经的作用且可导致全身麻醉，急性大量接触后有生命危险，更重要的是乙醚会被不法分子用来进行犯罪活动，严重影响公共安全，因此，乙醚属于有毒、有害危险品，国家已经对其的购买使用加以限制，购买程序繁琐，实验室继续使用该方法既增加了试剂的管理难度，又要克服试剂购买困难的问题。多年来，乙醚抽提苏丹Ⅲ染色法都没有避免乙醚的使用。于是，建立一种不使用乙醚的乳糜检测方法迫在眉睫。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提供一种使用上述方法的定性检测乳糜的试剂盒，包括试剂部分、耗材部分和说明书；所述试剂部分包括萃取液、染色剂、阴性对照液和阳性对照液；所述萃取液为正己烷。所述耗材部分包括滴管、1.5ml离心管和玻片。所述染色剂为苏丹Ⅲ醋酸乙醇溶液；所述阳性对照液为脂肪乳注射液；所述阴性对照液为生理盐水。所述说明书记载有定性检测乳糜的方法，具体包括以下步骤：(1)、萃取：取400μl萃取液于1.5ml离心管中，加入样本500-1000μl，混合振摇，静置3-8min后，1500-2500r/min离心3-8min。(2)、染色：用滴管吸取萃取液与样本的界面层液体100μl，于玻片上涂片，立即加染色剂100μl进行染色；或涂片后晾干，再加入染色剂100μl进行染色；或进行试管染色；(3)、观察：用40倍或100倍的显微镜观察玻片上是否有橘红色球状脂肪颗粒，镜下全片无橘红色脂肪颗粒，即为乳糜阴性；镜下仅偶见橘红色脂肪颗粒，即为乳糜阳性；镜下有较多且大小不等的橘红色脂肪颗粒，即为乳糜强阳性；步骤(2)中优选试管染色，具体为：吸取正己烷与样本的界面层液体100μl于1.5ml离心管中，加入100μl染色剂，混合均匀后开盖放置5-10min挥发掉萃取液，用一次性滴管取2-3滴置于玻片上。第二方面，本发明提供一种定性检测乳糜的方法，以正己烷为萃取液将样本中的脂肪颗粒萃取到上层的萃取液中；优选的，萃取后再静置3-8min后，1500-2500r/min离心3-8min。取400μl萃取液于1.5ml离心管中，加入样本500-1000μl，混合振摇，将样本中的脂肪颗粒萃取到上层的萃取液中。萃取后吸取正己烷与样本的界面层液体100μl于1.5ml离心管中，加入100μl染色剂，混合均匀后开盖放置5-10min挥发掉萃取液，用一次性滴管取2-3滴置于玻片上。本发明还提供一种定性检测乳糜的方法，使用上述试剂盒，包括以下步骤：(1)、萃取：取400μl萃取液于1.5ml离心管中，加入样本500-1000μl，混合振摇，将样本中的脂肪颗粒萃取到上层的萃取液中，静置3-8min后，1500-2500r/min离心3-8min；(2)、染色：吸取萃取液与样本的界面层液体100μl，于玻片上涂片，立即加染色剂100μl进行染色；或涂片后晾干，再加入染色剂100μl进行染色；或进行试管染色；(3)、观察：用40倍或100倍的显微镜观察玻片上是否有橘红色球状脂肪颗粒，镜下全片无橘红色脂肪颗粒，即为乳糜阴性；镜下仅偶见橘红色脂肪颗粒，即为乳糜阳性；镜下有较多且大小不等的橘红色脂肪颗粒，即为乳糜强阳性。步骤(2)所述试管染色，具体为：吸取正己烷与样本的界面层液体100μl于1.5ml离心管中，加入100μl染色剂，混合均匀后开盖放置5-10min挥发掉萃取液，用一次性滴管取2-3滴置于玻片上。所述染色剂为苏丹Ⅲ醋酸乙醇溶液，其配制过程为：5％(v/v)乙醇100ml，冰醋酸90ml，苏丹Ⅲ粉末1.5-2.5g，先将乙醇与冰醋酸混合，倾入苏丹Ⅲ粉末，充分溶解，即可。本发明提出的定性检测乳糜的方法用正己烷取代乙醚萃取脂肪颗粒，有以下有益效果：一是安全性能有大幅提升：本发明方法筛选出了一种萃取液——正己烷，将有毒的乙醚换成食品检验常用的正己烷后，样本与萃取液的所需量比现有方法减少5-10倍，减少了有机试剂的使用量，也就减少了试剂对实验室环境的污染，保障了工作人员的健康和实验室安全。二是实用性强：本发明方法通过两年153例真实样本的验证，确定了可用正己烷作为萃取液萃取乳糜，并验证了其准确性；本发明方法具有方便快捷，安全性高，污染小等特点，有推广应用价值。附图说明图1为本发明用正己烷萃取乳糜后、染色前的试验体系；图2为显微镜下染色后的涂片视野，其中箭头所指为：橘红色的脂肪颗粒。具体实施方式正己烷是一种在公共卫生理化实验室常用的一种试剂，广泛用于食品检验领域，有沸点相对较高，危害性小，廉价易购等特点，本发明用正己烷替代乙醚萃取乳糜，建立一种新的定性检测乳糜的方法，既方便了实验试剂的管理、简化了购买程序，又减少了萃取液对检验人员健康的伤害。本发明方法的检测原理：用正己烷萃取模型样本，再用脂溶性染料苏丹Ⅲ对萃取液层进行染色，显微镜观察染色后的萃取液层中是否存在橘色脂肪颗粒，存在脂肪颗粒为阳性，不存在脂肪颗粒为阴性。本发明方法，包括以下步骤：(1)、萃取：取400μl正己烷于1.5ml离心管中，加入样本500-1000μl，混合振摇，将样本中的脂肪颗粒萃取到上层的正己烷中，静置3-8分钟后，1500-2500r/min离心3-8min。(2)、染色：吸取正己烷与样本的界面层液体100μl(图1中箭头所指)，于玻片上涂片，立即加苏丹Ⅲ醋酸乙醇溶液100μl进行染色，此法为直接涂片法；或涂片后将溶剂晾干，再加入苏丹Ⅲ醋酸乙醇溶液100μl进行染色，此法为晾干涂片法；或吸取正己烷与样本的界面层液体100μl于Doff管中，加入100μl苏丹III醋酸乙醇溶液，混合均匀后开盖放置5-10min挥发掉正己烷后，用一次性滴管取2-3滴置于玻片上，此法为试管染色法。苏丹Ⅲ醋酸乙醇溶液的配制：5％(v/v)乙醇100ml，冰醋酸90ml，苏丹Ⅲ粉末1.5-2.5g，先将乙醇与冰醋酸混合，倾入苏丹Ⅲ粉末，使之充分溶解，即得。(3)、观察：用40倍或100倍的显微镜观察玻片上是否有橘红色球状脂肪颗粒，“-”表示镜下全片无橘红色脂肪颗粒，即为乳糜阴性；“±”表示镜下仅偶见橘红色脂肪颗粒，即为乳糜阳性；“+”表示镜下有较多且大小不等的橘红色脂肪颗粒，即为乳糜强阳性，如图2所示。本发明在上述方法基础上，还提供了一种定性检测乳糜的试剂盒：包括试剂部分：萃取液(A液)：正己烷；染色剂(B液)：苏丹III醋酸乙醇溶液；阳性对照液(C液)：临床上输液用的脂肪乳(脂肪乳注射液)；阴性对照液(D液)：生理盐水；耗材部分：滴管、1.5ml离心管、玻片；和说明书。以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。下列实施例中所用原料的纯度只要达到化学纯以上即可，来源均可从市场购得。实施例：按上述方法对同一样本中的乳糜进行定性检测，方法中的具体参数见表1。模型样本的制备：收集每日生化检验剩余样本作为实验材料，根据剩余样本中甘油三酯(TG)含量，将剩余样本划分为A、B、C三个组，建立模型样本：A组中TG≤1.7mmol/L，B组中TG为1.7～5.6mmol/L，C组中TG5.6～12.8mmol/L，C组也可选择外观为临床乳糜血(血浆呈乳白色或混浊状的血液)的样本；将A组、B组和C组分别定义为模拟乳糜阴性组、乳糜临界值组、乳糜阳性组(A组样本为乳糜阴性样本，B组样本为乳糜阳性样本，C组样本为乳糜强阳性样本)，每组各40例，共120例样本。真实样本组成：取胸水43例，腹水40例，尿52例，引流液17例，分泌物1例，共153例样本。表1定性检测乳糜的方法中的具体参数实验一：萃取体积的确定分别取乳糜阳性样本5ml、1000μl、500μl三份，按乳糜阳性样本与萃取液的体积比为5:2，分别向三份乳糜阳性样本中加入2ml、400μl、200μl正己烷，分别形成5ml+2ml、1000μl+400μl、500μl+200μl三种反应体系，按上述方法进行乳糜的定性检测。结果发现500μl+200μl的反应体系萃取层分界不清楚，无法准确取出萃取液层，不适合进一步检测。1000μl+400μl体系和5ml+2ml体系检测结果均为阳性，1000μl+400μl体系可以获得5ml+2ml体系一样的萃取效果，出于成本考虑，完全可以替代传统的5ml+2ml体系。实验二：染色方法的确定目前常用的乙醚抽提苏丹Ⅲ染色法中，由于乙醚的易挥发性，采用直接涂片法，即吸取萃取了脂肪颗粒的乙醚于玻片表面涂片，立即加苏丹Ⅲ醋酸乙醇溶液进行染色。在染色和后续的观察过程中试验人员均会直接吸入乙醚，对试验人员的安全造成隐患。因此本发明的方法中使用晾干涂片法替代目前的直接涂片法，可以减少有机溶剂的吸入。并对直接涂片法与晾干涂片法的染色效果进行比较。异丙醇也是分子实验室常用的一种有机溶剂，因获取方便，一并进行了实验。取A、B、C三组模型样本各20例,分别用正己烷或异丙醇进行萃取，分别使用直接涂片法和晾干涂片法进行染色，以实施例9的方法进行定性检测，结果见表2和表3。表2直接涂片法和晾干涂片法染色的结果比较表3直接涂片法和晾干涂片法染色的阳性率比较从表2和表3中可以看出：乳糜阴性样本(A组)和乳糜强阳性样本(C组)用正己烷或乙醚萃取后采用直接涂片法染色的阳性率与晾干涂片法染色的阳性率一致，分别为0％vs.0％、100％vs.100％；用异丙醇萃取后采用直接涂片法染色的阳性率与晾干涂片法染色的阳性率只能保持基本一致，分别为0％vs.0％、80％vs.85％。然而，对于乳糜阳性样本(B组)中，乙醚、正己烷或异丙醇萃取后采用直接涂片法染色的阳性率与晾干涂片法染色的阳性率则不一致，分别为70％vs.55％、70％vs.50％、20％vs.10％，直接涂片法阳性率高于晾干涂片法。表2和表3的实验结果显示晾干涂片法的结果更不准确，但是在实际工作中用直接涂片法染色又会出现假阳性(假阳性是指镜下出现会发生破裂的假性油滴，无法提供附图)。于是经过摸索，发现采取试管染色法进行染色，即本发明的步骤(2)染色调整为：取100μl界面层液体于Doff管中，加入100μl苏丹III醋酸乙醇溶液，混合均匀后进行染色。开盖放置5-10min挥发掉正己烷后，用一次性滴管取2-3滴置于载玻片上镜检，结果发现用试管染色法染色可以有效避免假阳性现象，这可能与正己烷已挥发有关。其它实施例也有类似效果，在此不一一赘述。实验三：本发明方法对模型样本的准确性验证按上述方法对180例模型样本进行乳糜的定性检测，同时将萃取液换成乙醚或异丙醇作为对照进行平行试验，采取1000μl+400μl反应体系，萃取后采用试管染色法进行染色，以实施例9为例，结果见表4、表5和表6，比较例1-3的结果见表7。表4乙醚/正己烷/异丙醇作为萃取液的实验结果(例数)表5乙醚/正己烷/异丙醇作为萃取液的阳性率试验结果表6正己烷与乙醚/异丙醇对模型乳糜样本检测一致性检验从表4和表5的结果可以看出：对于乳糜阴性样本(A组)和乳糜强阳性样本(C组)，乙醚和正己烷的检测结果一致(0％vs0％、100％vs100％)，与异丙醇的检测基本一致(0％vs0％、100％vs90％)。对于乳糜阳性样本(B组)，乙醚的阳性率与正己烷(95％vs90％)基本一致，但乙醚的阳性率明显高于异丙醇(95％vs40％)并且，异丙醇的阳性率明显低于正己烷(40％vs90％)。经kappa检验(见表6)，kappa值分别为0.95和0.7，kappa检验的结果大于0.75即认为两种方法得到的检测结果具有较好的一致性，表明正己烷能够达到与乙醚一致性较好的结果，而则异丙醇则不能达到与乙醚一致性较好的结果，即用正己烷作为萃取液得到的检测结果准确可信。其它实施例也有类似效果，在此不一一赘述。表7比较例1-3的实验结果(例数)从表7的结果可以看出：对于乳糜阴性样本(A组)比较例1-3的阳性率完全一致均为0.0％；而对于乳糜强阳性样本(C组)比较例1-3的阳性率分别为95％、80％、90％；对于乳糜阳性样本(B组)比较例1-3的阳性率分别为45％、50％、55％。可见，比较例1-3用于检测强阳性样本和阳性样本的阳性率明显低于实施例1-9。实验四：本发明方法对真实样本的准确性验证采用上述定性检测乳糜的方法对19例体液样本(胸水、腹水)进行检测，1000μl+400μl的反应体系，同时用乙醚、异丙醇作为萃取液进行平行检测，萃取后采用试管染色法进行染色，以实施例9方法的参数为例，结果见表8。表8乙醚/正己烷/异丙醇作为萃取液作用真实样本的实验结果将表8中乙醚和正己烷作为萃取液得到的检测结果经kappa检验，kappa值为1.0，说明两者的检验结果一致(26.3％vs26.3％)；将表8中乙醚和异丙醇作为萃取液得到的检测结果经kappa检验，kappa值为0.496(小于0.75)，说明两者的检验结果一致性较差(26.3％vs10.5％)，异丙醇会出现漏检。其它实施例也有类似效果，在此不一一赘述。实验五：本发明方法对真实样本的准确性验证在2014年1月至2015年12月期间，用本发明方法进行检测134例。其中样本类型包括尿、胸水、腹水、引流液及分泌物，各种样本的阳性率见表9。表9本发明方法用于真实样本检测中的阳性率样本类型例数阳性率尿20％胸水41％腹水03％引流液70％分泌物1100％合计13452％表9的结果表明能用本发明的方法检测各类样本，得到的结果与实际得到的结果符合率达到94.7％，说明本发明方法可用于检测的样本类型多样，应用范围广。通过以上实验，总结如下：首先，根据第三版的临床检验规程，样本和萃取液的比例是5-10ml:2-5ml,即5:2的比例进行混合，本发明的反应体系体积缩小了，可在1.5ml的Doff管里进行实验，实验结果准确可靠。其次，通过比较了直接涂片法和晾干涂片法这两种模式，发现直接涂片法技术人员在镜检时会吸入较多的溶剂，对身体有害；晾干涂片法可以减少有机溶剂的吸入，但是染色效果差，不能采用，在随后的镜检中发现部分样本会出现假阳性。于是对染色方法进行改良，采用试管染色法进行染色，染色后部分蒸发掉正己烷，排除了假阳性，再进行镜检，这样，既可以减少有机溶剂的吸入，保障了员工的安全，又提高了结果的准确性，同时还利于方法的标准化。乳糜样本并不常见，收集一定数量的样本进行研究十分困难，本发明利用血液中甘油三酯的含量建立了模拟乳糜样本模型，全面对萃取效率进行了评估，结果发现在高甘油三酯的样本(C组)三种溶剂出现了明显的不一致，异丙醇阳性率明显低于乙醚，而正己烷则与乙醚相当。在正常人血清样本(A组)和乳糜样本(B组)的平行检测结果显示正己烷与乙醚检测结果高度一致，KAPPA值达到0.95，在19例体液样本的验证试验中正己烷与乙醚的一致性完全一致，明显优于异丙醇，从而表明正己烷用于乳糜实验至少能够达到与乙醚一样的准确性，正己烷可用作做乳糜实验的萃取液。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3