一种GC‑MS检测新鲜烟叶中初生代谢物和次生代谢物的方法与流程

本发明涉及烟草代谢组学新鲜烟叶中代谢物检测的研究，具体是一种气相色谱-串联质谱法检测新鲜烟叶中初生代谢物糖、氨基酸、有机酸和次生代谢物甾醇、生物碱、多酚等的检测方法。

背景技术：

烟草作为重要的模式作物，人们对其化学组成主要局限于调制后烟叶的研究，对于新鲜烟叶，包括不同生长发育时期、采集部位、品种和产地的化学组成了解十分有限。尽管近几年国内外已经开展了关于烟叶代谢组学的研究，但是所检测和准确定性定量的代谢物数量有限，而新鲜烟叶中初生和次生代谢物与植物的抗性、信号转导、烟叶香气等密切相关。因此，建立一种GC-MS检测新鲜烟叶中初生代谢物和次生代谢物的方法是十分必要的。

针对烟叶代谢物的检测，通用的方法包括靶标分析方法和非靶标分析方法。靶标分析方法一般采用选择离子扫描模式（SIM）或多反应监测模式（SRM /MRM），其灵敏度高，受共流峰干扰少，但该方法主要用于特定种类化合物的研究，不满足代谢组学高通量快速分析的要求。同时，这种靶标分析方法根据化合物的类别进行分析，存在样品预处理复杂，需要建立不同的分析方法，只能对已知的化合物进行定性和定量分析的缺点。而非靶标分析方法一般采用全扫描模式，并能产生非偏向的全扫描信息以检测尽可能多的代谢物。然而该类方法也有一些局限性，比如其检测器容易饱和，线性范围较窄，使得浓度范围横跨几个数量级的代谢物的准确定量受到限制。另外，可匹配到的代谢物数目和峰匹配结果的准确度受到峰匹配参数的影响，由于软件算法的不完善和数据的复杂性会导致一些错误结果的产生，进而影响到数据预处理结果的准确性和批次分析数据的重复性。因此，建立一种兼具靶标方法准确定性定量和非靶标方法高通量的新鲜烟叶代谢物的检测方法是十分必要的。

技术实现要素：

本发明的目的正是针对上述现有技术中所存在的不足之处而提供一种GC-MS检测新鲜烟叶中初生和次生代谢物的方法。利用该方法可以测定不同时期、不同品种、不同产地烟叶中糖、氨基酸、有机酸、甾醇、生物碱、多酚等的含量，是一种高通量测定方法。

本发明的目的是通过以下技术措施来实现的：

本发明的GC-MS检测新鲜烟叶中初生代谢物和次生代谢物的方法采用提取溶剂低温超声萃取并衍生，通过气相色谱-质谱联用仪GC-MS实现新鲜烟叶中初生代谢物糖、氨基酸、有机酸和次生代谢物甾醇、生物碱、多酚的检测，具体步骤如下：

1）烟叶的采集、干燥和粉碎：采摘烟株指定部位烟叶，迅速用液氮迅速冷冻以保证代谢物不发生降解；其中，冻干机预冷到-40℃，冷冻干燥72h以除去烟叶中水分，之后用粉碎机粉碎，过40目筛，放于-80℃冰箱保存；

2）称量10-30mg粉碎后的烟叶置于离心管中，加入100μL的内标溶液，用1mL的异丙醇-乙腈-水萃取溶剂超声提取，超声萃取后4000r/min离心10min，取上清液并用氮吹仪吹干；

3）向吹干的提取液中加入甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液，涡旋振荡后在35-40℃条件下进行肟化反应90-120min；该反应可以对糖等代谢物的醛基进行肟化保护，减少其异构体，便于定量比较；

4）向上述溶液中加入作为衍生化试剂的N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺MSTFA，涡旋振荡后在35-40℃下进行硅烷衍生化反应30-60min；

5）采用GC-MS进行检测，色谱质谱条件如下：

GC部分：色谱柱：DB-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：He；进样量：1μL；分流比：10:1；流速：1.0mL/min；程序升温：70℃（4min）升到300℃（5min），以5℃/min的速率，进样口温度300℃；

MS部分：传输线和离子源的温度为300℃和230℃，EI电离，扫描频率5scan/s，溶剂延迟5min，全扫质量范围40-600m/z，选择离子扫描共50个组。

本发明中所述的内标溶液为用萃取溶剂配制的氘代十三酸溶液，浓度为10 μg/mL；所述的萃取溶剂是由体积比为3:3:2的异丙醇-乙腈-水组成；所述的甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液浓度为20-40mg/mL，加入量为50-80μL，反应采用空气加热、摇床进行控温；所述衍生化试剂MSTFA的加入量为50-80μL，反应采用空气加热、摇床进行控温。

本发明中所述的烟叶样品的采集需要迅速去除叶脉，三株混合为一个样品，用锡箔纸包裹叶片部分，标记样品编号后放入液氮中迅速冷冻，并用干冰包埋进行运输。

本发明中所述的质谱检测方法为选择离子监测方法（SIM），每个代谢物有其对应的保留时间和特征离子，可以准确定性定量新鲜烟叶中初生代谢物和次生代谢物199个，其中标准品验证的代谢物135个。

本发明的有益效果如下：

本发明发展了适用于新鲜烟叶的样品采集方法和提取方法，可以真实反应采集烟叶所在的生长发育时期、采集部位、品种和产地。并且可以涵盖新鲜烟叶中初生、次生代谢物，如糖、氨基酸、有机酸、甾醇、生物碱、多酚等，具有高通量检测特性。基于该方法获得的烟草代谢相关的基础数据，为发现与烟叶香型密切相关的重要代谢物及其代谢途径，以及烟叶品质的形成机理、代谢调控、分子育种等研究提供了科学基础。

表1新鲜烟叶中初生、次生代谢物的保留时间和名称

附图说明

图1为本发明检测步骤流程图。

图2为本发明实施例1中云南大理红花大金元的全扫描色谱图。

图3为本发明实施例1中河南襄县中烟100的全扫描色谱图。

具体实施方式

本发明以下将结合实施例（图1）作进一步描述：

本发明中所述的内标溶液为用萃取溶剂配制的氘代十三酸溶液，浓度为10 μg/mL；所述的萃取溶剂是由体积比为3:3:2的异丙醇-乙腈-水组成；所述的甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液浓度为20-40mg/mL，加入量为50-80μL，反应采用空气加热、摇床进行控温；所述衍生化试剂MSTFA的加入量为50-80μL，反应采用空气加热、摇床进行控温。以下不再赘述。

实施例1：采集18片云南大理种植的红花大金元的第10叶位的新鲜烟叶，快速去除叶脉并用锡箔纸包裹3片烟叶，液氮速冻，从液氮中取出锡箔纸包裹的样品，拍碎并用冻干机真空冷冻干燥72h去除水分，磨碎至40-60目。称取粉碎的烟叶20~25mg于2mL离心管中，加入100μL氘代十三酸内标溶液，1mL的萃取溶剂，超声提取30min，超声萃取后4000r/min下离心10min，取200μL上清液于尖底进样瓶并用氮吹仪吹干。向吹干的提取液中加入50μL浓度为20mg/mL的甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液，涡旋振荡后在37℃下反应90min，再向进样瓶中加入50μL MSTFA，涡旋振荡后在37℃下反应60min，用GC-MS检测。

色谱条件如下：

GC部分：色谱柱：DB-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：He；进样量：1μL；分流比：10:1；流速：1.0mL/min；程序升温：70℃（4min）升到300℃（5min），以5℃/min的速率，进样口温度300℃。

MS部分：传输线和离子源的温度为300℃和230℃，EI电离，扫描频率5scan/s，溶剂延迟5min，全扫质量范围40-600m/z，选择离子扫描共50个组。

全扫描色谱图如图2所示。

在连续10日，每日进行重复实验。随机选取10个样品峰，计算10次实验中色谱峰的面积，并计算10次实验各色谱峰“峰面积/内标面积”值（S/S_内）的相对标准偏差（RSD%）和保留时间的相对标准偏差，列于表2。其中，S/S_内的RSD<10%，保留时间RSD<0.08%，证明该方法具有较好的重现性。

表2云南大理红花大金元的部分初生、次生代谢物的相对标准偏差RSD和回收率

实施例2：采集18片河南襄县种植的中烟100的第10叶位的新鲜烟叶，快速去除主干并用锡箔纸包裹3片烟叶，液氮速冻，从液氮中取出锡箔纸包裹的样品，拍碎并用冻干机真空冷冻干燥72h去除水分，并磨碎至40-60目。称取粉碎的烟叶20~25mg于2mL离心管中，加入100μL氘代十三酸内标溶液，1mL萃取溶剂，超声提取30min，超声萃取后4000r/min下离心10min，取200μL上清液于尖底进样瓶并用氮吹仪吹干。向吹干的提取液中加入50μL的浓度为20mg/mL的甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液，涡旋振荡后在37℃下反应90min，再向进样瓶中加入50μL MSTFA，涡旋振荡后在37℃下反应60min，用GC-MS检测。

色谱质谱条件同实施例1。

全扫描色谱图如图3所示。

在连续10日，每日进行重复实验。随机选取10个样品峰，计算10次实验中色谱峰的面积，并计算10次实验各色谱峰“峰面积/内标面积”值（S/S_内）的相对标准偏差（RSD%）和保留时间的相对标准偏差，列于表3。其中，S/S_内的RSD<10%，保留时间RSD<0.08%，证明该方法具有较好的重现性。

表3河南襄县中烟100的部分初生、次生代谢物的相对标准偏差RSD和回收率