木瓜药材中天然抗氧化剂在线发现及综合抗氧化活性评价方法与流程

本发明属于中药分析与活性评价领域，具体涉及一种中药活性成分的在线筛选、鉴别及活性指纹图谱结合多指标定量综合抗氧化活性评价方法。

背景技术：

近年来，随着人们健康意识的提升抗氧化剂的研究已成热点。天然抗氧化剂的筛选更是进行的如火如荼。许多传统中药如红景天、甘草和桑叶等均含有多种抗氧化成分。从中药中发现天然抗氧化剂也已成为一个重要的发展方向。然而，传统的基于天然药化的活性成分发现和评价方法具有耗时长、成本高、过程复杂等不足；基于提取物活性测定和单指标含量测定的活性评价方法，难以全面反应药材的活性特征。研究建立中草药中活性成分的快速发现及活性评价方法具有重要意义。

基于HPLC-DPPH技术的抗氧化成分在线筛选技术具有灵敏、快速、不需要分离纯化等特点，能从复杂的中药成分中快速灵敏的筛选出抗氧化活性成分。目前为止，该技术在中药抗氧化活性成分的筛选中应用较少。基于HPLC-DPPH技术的抗氧化成分在线筛选并结合抗氧化活性指纹图谱用于中药的活性评价未见报道。

木瓜是蔷薇科木瓜属植物木瓜(Chaenomeles sinensis(Thouin)Koehne)的成熟果实，其广泛分布于我国东部，中部，西南等地。木瓜主要分为两大类：皱皮木瓜和光皮木瓜。木瓜作为一种传统中药材，在中医临床上被广泛应用于祛湿平肝等。现代研究表明：木瓜中含有有机酸类、黄酮类、三萜类、皂苷类、糖和鞣酸类等多种成分，具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等活性另外，木瓜作为一种可食瓜果，因其高效的抗氧化效果而被广泛开发利用于果脯，果酒，果醋等保健食品和化妆品中。因此，木瓜作为一种天然抗氧化剂来源，其进一步开发应用势在必行。开展木瓜中抗氧化成分的快速发现及抗氧化活性综合评价方法研究对进一步开发利用木瓜资源具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于从药食两用植物木瓜中快速发现天然抗氧化剂，并建立其抗氧化活性综合评价方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

木瓜药材中天然抗氧化剂在线发现及综合抗氧化活性评价方法，首先测定不同批次木瓜提取液的抗氧化活性；之后采用HPLC-ESI-TOF/MS测量并确定木瓜中含有的化学成分；然后再采用HPLC-DPPH在线筛选方法快速筛选出木瓜中具有抗氧化活性的化学成分，并测定部分活性成分的IC₅₀值以表征其抗氧化活性的强弱；通过对多批次木瓜样品的HPLC分析，以筛选出的具有抗氧化活性的色谱峰作为共有峰建立其抗氧化活性指纹图谱，采用指纹图谱相似度分析用于不同品种木瓜的抗氧化活性评价；再选取多个抗氧化活性成分进行含量测定；即：通过木瓜提取液的抗氧化能力初步鉴定木瓜抗氧化活性品质，通过抗氧化性指纹图谱相似度分析初步鉴定不同品种木瓜之间的品质差异，通过多个抗氧化活性成分的含量分析，从而对木瓜药材的抗氧化活性进行综合评价。

由此，本发明建立了包含木瓜提取物抗氧化活性测试、木瓜提取物中抗氧化活性成分的HPLC-DPPH在线快速筛选、木瓜抗氧化活性指纹图谱和多指标成分定量的木瓜药材综合抗氧化活性筛选和评价方法。

木瓜提取液抗氧化活性的检测方式为用酶标仪对木瓜提取物进行体外清除DPPH活性测定。

优选的，步骤为：

(1)制备木瓜提取液；(2)采用基于酶标仪的体外清除DPPH活性测定方法对木瓜提取液的抗氧化活性进行测定；(3)优化HPLC-ESI-TOF/MS的色谱条件，并检测木瓜提取液中含有的化学成分；(4)采用HPLC-DPPH在线筛选方法对木瓜提取液进行抗氧化成分快速筛选，并测定部分抗氧化活性化学成分的IC₅₀值；(5)通过对多批次木瓜样品的HPLC分析，以筛选出的具有抗氧化活性的色谱峰作为共有峰建立其抗氧化活性指纹图谱，结合相似度分析对不同品种和批次的木瓜进行抗氧化活性成分评价；(6)成分建立木瓜中多个抗氧化活性成分HPLC含量测定方法，成分并对多批次样品进行含量测定；(7)结合步骤(2)、(4)-(6)的结果对木瓜进行综合抗氧化活性评价。

进一步优选的，步骤(1)的步骤为：将木瓜加入甲醇中，水浴后加入水匀质提取，将均质后的匀质体静置去上清液过滤后即得木瓜提取液。

更进一步优选的，所述水浴温度为55-65℃。

更进一步优选的，所述水浴的时间为10-15min。

更进一步优选的，所述过滤的过滤膜采用0.22微孔滤膜。

更进一步优选的，木瓜、甲醇和水的加入比例为1:2-3:1-2，g:mL:mL。

进一步优选的，步骤(2)的步骤为：将木瓜样品与DPPH的甲醇溶液混匀，在室温避光反应后在酶标仪517nm处测定其吸光度记为A_样品，对照组采用木瓜提取液，吸光度记为A_对照，空白组采用甲醇，吸光度记为A_空白；根据测定的数据计算出清除DPPH自由基能力，清除DPPH自由基能力即为木瓜的总抗氧化活性。

更进一步优选的，清除DPPH自由基能力计算公式为W％＝(A_对照-A_样品)/(A_对照-A_空白)×100。

进一步优选的，HPLC的色谱条件为：

流动A相:水，其中，水中含有0.8％甲酸及10mM甲酸铵，流动B相:乙腈，其中，乙腈中含有0.3％甲酸；

梯度洗脱：T(min):0-25-30-40-50-65-80-95-105-110；B％:5-9-9-11-12-14-15-18-20-100，检测波长为280nm(0-67min)、345nm(67-110min)。成分采用该色谱条件能够更完全的检测木瓜中化学成分的种类，成分且该条件下各成分的峰形较好，便于分析。

进一步优选的，步骤(4)成分中筛选具有抗氧化活性成分的方法为：将木瓜提取液经过色谱柱分离后与单泵泵出的DPPH溶液混合，混合液在反应池中反应后流入HPLC系统的DAD检测器。

进一步优选的，选取的部分抗氧化活性成分为新绿原酸、儿茶素、绿原酸、花青素B1、表儿茶素、藜芦酸、芦丁、金丝桃苷、牡荆素、槲皮苷。

进一步优选的，步骤(6)的方法为，成分将抗氧化活性成分的标准品制成标准溶液，然后将制成的标准溶液稀释至不同浓度并进行HPLC检测，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制得到抗氧化活性成分的标准曲线，根据得到的标准曲线及HPLC检测的木瓜中该抗氧化活性成分的峰面积计算木瓜中抗氧化活性成分的含量；根据上述方法测定出不同批次木瓜中多种抗氧化活性成分的含量。

本发明的意义：鉴于中药中多成分，多靶点的特点，并不能通过单一的指标无目的来进行药材的活性质量评价，本发明首次建立了一种基于HPLC-DPPH在线抗氧化成分筛选技术的抗氧化活性指纹图谱结合多指标定量和抗氧化活性评价用于木瓜药材综合抗氧化活性评价的方法体系。该方法是一套包含木瓜提取物抗氧化活性测试、木瓜提取物中抗氧化活性成分的HPLC-DPPH在线快速筛选、木瓜抗氧化活性指纹图谱和多指标成分定量的木瓜药材综合抗氧化活性评价方法。其中，木瓜提取液的抗氧化能力可以初步鉴定木瓜抗氧化活性品质，在线抗氧化活性筛选可以鉴定木瓜中含有的抗氧化活性成分种类，活性指纹图谱相似度分析可以初步鉴定不同品种木瓜之间的品质差异，最后选取木瓜中部分抗氧化活性成分进行含量测定，并对其中的抗氧化活性成分的抗氧化能力与含量进行综合分析，从而对木瓜药材进行综合抗氧化活性评价。传统抗氧化活性评价方法一般需经过复杂的分离、纯化过程，周期长、成本高；而且主要是对少量成分进行活性和含量测定。本发明发展的快速筛选方法弥补了传统筛选方法周期长、成本高的不足；建立了包含木瓜提取物抗氧化活性测试、木瓜提取物中抗氧化活性成分的HPLC-DPPH在线快速筛选、木瓜抗氧化活性指纹图谱和多指标成分定量的木瓜药材综合抗氧化活性评价方法。体现了中药化学成分的整体性和特征性，能够更加客观、全面地评价木瓜药材的抗氧化活性。

附图说明

图1为1-20号木瓜样品的外表图片；

图2为木瓜样品液相色谱图及抗氧化成分在线筛选图，其中，a为在0-67min时280nm处的HPLC图谱，b为在67-110min时345nm处的HPLC图谱，c为木瓜样品与DPPH溶液反应后在517nm处的HPLC图谱，517nm下的负峰大小代表此保留时间下的该成分清除DPPH能力强弱。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明。

(一)制备木瓜提取液

取木瓜鲜样5g，加入10mL甲醇60℃水浴10min，之后加入5mL水混匀后均质机均质闪提1min。静置后取上清液过0.22微孔滤膜得到木瓜提取液备用。

(二)木瓜提取液抗氧化活性测定

将DPPH用甲醇溶解，定容至终浓度为：0.04mg/mL，4℃下避光储存。分别取木瓜样品50μL与DPPH(0.04mg/mL)溶液100μL混匀室温避光反应30min。之后混合液在酶标仪517nm处测定其吸光度记为A_样品，对照组用样品提取溶剂代替提取液，吸光度记为A_对照，空白组用样品提取溶剂代替提取液，用甲醇代替DPPH溶液，吸光度记为A_空白。清除DPPH自由基能力计算公式：清除率(％)＝(A_对照-A_样品)/(A_对照-A_空白)×100，不同品种木瓜自由基清除率如表1所示。由表1可以看出，不同批次木瓜样品清除DPPH的能力各有不同，其中7批达到90％以上，8批在80％-90％之间，说明大部分木瓜的总抗氧化能力都很强，可以作为天然抗氧化剂的获取来源。

表1 不同品种木瓜抗氧化活性评价

(三)木瓜提取物的HPLC-ESI-TOF/MS分析

将处理得到的样品按照优化好的色谱条件：XSELECT^TM HSS T3色谱柱(waters,USA)；流动相：A:水(0.8％甲酸，10mM甲酸铵)B:乙腈(0.3％甲酸)梯度洗脱：T(min):0-25-30-40-50-65-80-95-105-110-120；B％:5-9-9-11-12-14-15-18-20-100-100；检测波长：280nm，345nm；进样量：10μL进行HPLC-ESI-TOF/MS分析。从中鉴定出36个化学成分，见表2。

表2 木瓜提取液鉴别结果

(四)HPLC-DPPH法在线筛选木瓜提取液中抗氧化活性成分

DPPH溶液配制：将DPPH用80％乙腈溶解定容至终浓度为6×10^-5M，4℃下避光储存。将一个Rigol L-3245四元泵与一台Angilent 1260液相色谱连接起来。木瓜样品通过最优化的色谱条件进样分析，在经过色谱柱分离后与四元泵以流速0.6mL/min泵出的DPPH溶液混合，混合液在PEEK管中反应后流入HPLC系统的DAD检测器。鉴于DPPH在波长517nm(如图2c所示)处的特征峰由于DPPH与抗氧化活性成分反应而形成一个倒峰。对比样品在280nm(如图2a所示)和345nm(如图2b所示)处的HPLC图谱确定筛选出的24种活性成分。

(五)测定部分抗氧化活性成分的IC₅₀值

将选定的十种抗氧化活性成分分别稀释至不同浓度，采用(二)中提到的方法分别测定其对DPPH的清除能力。以浓度为横坐标，抑制率为纵坐标做出标准曲线即可得到每一种单标的IC₅₀(具有半数清除DPPH能力的成分浓度)值，如表3。由表3可以看出，所测定的10个成分中共有4个黄酮类，3个有机酸类，3个多酚类成分，说明这几类成分均具有抗氧化活性，其中9种的IC₅₀值均低于阳性对照Vc，表明其均具有较强的抗氧化活性。

表3 木瓜中活性成分的抗氧化活性评价

a:表示各抗氧化活性单标在浓度为8mg/L时所具有的清除DPPH自由基的能力Vc:维生素C(Vc)作为阳性对照用来比较各成分的活性

(六)建立抗氧化活性指纹图谱结合相似度分析对木瓜进行活性评价

通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(《中国药典》2004A版)对20批不同品种木瓜样品的指纹图谱进行相似度分析。首先将色谱工作站数据导人中药指纹图谱相似度计算软件，以筛选出的24种活性成分作为共有峰进行谱峰匹配，采用共有模式作为对照指纹图谱，采用相关系数法进行相似度评价分析，建立木瓜抗氧化活性指纹图谱，结果如表4所示。

表4 20个品种木瓜相似度评价结果

从表中可以看出，不同品种木瓜样品的抗氧化活性指纹图谱的相似度相差较大。其中，20号木瓜样品与所选定的标准样品10号木瓜相似度最大，综合其总抗氧化能力10号：0.831；20号:0.849，可以得出10号木瓜样品与20号木瓜样品抗氧化活性质量差异较小，即品质差异较小。

(七)木瓜中活性成分的含量测定

选定指标进行含量测定，从筛选出的24种活性成分中选择10种成分如表5所示：新绿原酸，儿茶素，绿原酸，花青素B1，表儿茶素，藜芦酸，芦丁，金丝桃苷，牡荆素和槲皮苷作为指标对20个不同品种的木瓜样品(如图1所示)进行含量测定。将筛选出的这10种活性成分的标准品配制混标，并稀释到不同浓度进行HPLC分析。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制得到这10种活性成分的标准曲线，如表5所示。

表5 10种活性成分线性关系

结合20个不同品种的木瓜样品的HPLC色谱图定量分析得到这10种成分在不同品种木瓜中的含量，如表6所示。从表中可以看出，这20批木瓜样品中所测10种活性成分的总含量最低为7号：423.83μg/g，最高为9号：4785.22μg/g，均值为2545.29μg/g。其中3、9、10、13、14、15、18、19、20号总含量均高于平均值，其余样品的所测活性成分总量均低于均值。

表6 20个品种木瓜活性成分含量测定结果

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。