一种基于荧光能量共振转移法的GFAP检测方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于荧光能量共振转移法（fret）的gfap检测方法。

背景技术：

流行病学调查研究表明，目前脑血管疾病与心脏病、恶性肿瘤构成人类疾病死亡的三大原因。与西方发达国家相比，我国脑血管病的发病率和死亡率明显高于心血管病。据估算，全国每年新发脑卒中患者约为200万人；每年死于脑卒中的患者约150万人；存活患者人数600万～700万；且70％～80％的存活者遗留瘫痪、失语等严重残疾，给社会和家庭带来沉重负担。其中，脑出血是一种致死率和致残率均高的常见病、多发病，严重危害人类特别是老年人的健康，威胁病人的生命，严重影响病人生活质量。

胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，gfap)是一种分子量为50～52kda的酸性蛋白，属细胞骨骼蛋白，是星形细胞胞质内的特异性蛋白，标志蛋白。gfap在星形胶质细胞受到刺激引起反应时，其表达发生变化，在星形细胞中有丰富的、唯一的表达。研究发现gfap和痴呆、多发性硬化及脑卒中有明显相关性。脑出血后神经元和神经胶质细胞受到损害，大量的胞浆蛋白质漏出细胞进入细胞间液，可溶性的gfap通过细胞间液进入脑脊液，穿过破坏的血脑屏障进入血液循环。有研究表明脑出血患者发病6小时内血清gfap水平即明显升高，而缺血性脑卒中患者6小时内血清gfap水平与正常对照组无明显差异，因此认为gfap是急性脑出血的生物学标志物。此外，还有研究表明，急性脑出血患者血清中的gfap与脑出血体积之间有着密切的正相关关系，因此可以通过脑出血患者血清gfap水平来判断患者的病情和预后。

目前，临床诊断上对gfap的检测主要是elisa实验方法，该方法因其特异性、灵敏度高而在近二十年来被广泛应用，但该方法步骤繁琐，所需检验时间较长。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于荧光能量共振转移法的gfap检测方法，该方法特异性高，准确性好，检测用时短，操作方便。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开的一种基于荧光能量共振转移法的gfap检测方法，包括以下步骤：

1）采集待检测全血样品的血清；

2）用纯化的神经胶质纤维酸性蛋白抗体包被微孔板，制成固相抗体；

3）向包被抗体的微孔中加入神经胶质纤维酸性蛋白，然后再与alexafluor488以及alexafluor594标记的神经胶质纤维酸性蛋白抗体结合，形成抗体-抗原-两个荧光标记抗体复合物；

4）利用荧光能量共振转移法，用酶标仪测定吸光度，通过标准曲线计算出待检测全血样品中神经胶质纤维酸性蛋白浓度。

步骤1）中，采集血清具体操作为：将全血样品于室温下放置2h或4℃过夜后，于1000×g离心20min，取上清既得到血清。

步骤2）中，是将抗神经胶质纤维酸性蛋白抗体按1:200倍进行稀释，然后每孔加入100μl，于4℃过夜包被，制得固相抗体。

步骤3）中，每孔加入1:200倍稀释的alexafluor488以及alexafluor594标记的神经胶质纤维酸性蛋白抗体100μl，加上覆膜，于37℃温育30min。

步骤4）中，是在激发波长为409nm，发射波长为617nm的条件下测定吸光度。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开的基于荧光能量共振转移法的gfap检测方法，用纯化的人神经胶质纤维酸性蛋白（gfap）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入神经胶质纤维酸性蛋白（gfap），再与alexafluor488标记的以及alexafluor594标记的gfap抗体结合，形成抗体-抗原-两个荧光标抗体复合物，利用fret原理用荧光酶标仪（在490/617nm波长下）测定吸光度（od值），通过标准曲线计算样品中人神经胶质纤维酸性蛋白（gfap）浓度。由于用到了三个抗体同时识别，特异性更高，准确性更好，并比现有方法检测时间大大缩短。为临床诊断提供了参考信息，有助于临床医生诊断和评估脑卒中进展情况，改善病人的预后。

附图说明

图1为用r&d公司humangfapelisa检测试剂盒所作标曲；

图2为用r&d公司humangfapelisa检测正常对照以及stroke病人血清结果；

图3为用本发明所述方法所作标曲；

图4为用本发明所述方法检测正常对照以及stroke病人血清结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明的公开的基于荧光能量共振转移法的gfap检测方法，需要三个抗体同时识别，具有比elisa更高的特异性，避免了elisa法的一些假阳性。同时利用两个荧光标价抗体间fret直接检测，省去了elisa中多部清洗，底物显色的步骤，大大缩短检测时间。

本发明公开的基于荧光能量共振转移法的gfap检测方法，包括以下操作：

1、收集血清：

全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测；收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2、酶标板包被：

将抗gfap抗体按1:200稀释，每孔加入100μl，4℃过夜包被。

3、弃去孔内液体，甩干，用washbuffer（pbst）洗板3次，大约300μl/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。

4、加样：

分别设空白孔、标准孔、待测样品孔；

空白孔加标准品和样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

给酶标板覆膜，37℃孵育40分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

5、弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约30μl/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。

6、每孔加1:200稀释的荧光（alexafluor488及alexafluor594）标记的gfap抗体100μl，加上覆膜，37℃温育30分钟。

7、弃去孔内液体，甩干，洗板2次，每孔加入100μlpbs。

8、立即用酶标仪在490/617nm波长下测定吸光度（od值）。

实验结果参见附图，图1和图2是用国际知名品牌r&d公司的gfap检测试剂盒检测的5个stroke病人血清结果，图3和图4是用本发明方法检测同样的血清，得出的结果。从结果上看，本发明方法与r&d试剂盒检测结果基本一致。但r&d的一次检测，操作时间大约在8h左右，而本发明方法除去酶标板包被时间（因为不需要每次都包被，可以一次包被多块，储存备用），可以在2h之内完成检测。另外，结合几位病人最终临床诊断结果，发现本发明三个抗体同时识别，特异性更高，准确性更好。