本发明涉及临床血液诊断领域中的凝血酶原时间(Prothrombin Time，PT)检测，尤其是指一种凝血酶原时间测试卡的制备方法。
背景技术：
凝血功能检测是一项重要的临床检测项目，对于临床各科疾病诊断具有重要意义。通常测定凝血功能的测定包括4项检查内容，即凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原(FIB)。其中，凝血酶原时间(PT)是临床上主要的凝血性能测试指标之一。
PT可用于监测口服抗凝剂用量和疗效、相关凝血因子和抑制剂情况、证实相关凝血酶原和纤维蛋白原等的缺陷和抑制物存在情况。PT延长常见于维生素K缺乏、DIC、服用抗凝药物等情况。凝血因子缩短见于血栓性疾病等。另外，由于凝血因子Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ主要由肝脏合成，因此PT结果也是反应肝功能的一项重要指标。因此，PT检测具有重要的实际意义。PT的测量结果常用凝血酶原时间(PT)、国际标准化比值(INR)等形式表示。
体内存在有内源性及外源性两种凝血激活系统。一般认为，无活性的凝血因子Ⅶ与组织因子结合，会很快被活化的因子Ⅹ激活为Ⅶa，从而形成Ⅶa组织因子复合物，进而启动外源性凝血过程。外源性凝血所需的时间短，反应迅速。PT检测方法就是利用外源性凝血的反应原理，通过向血液样本中加入PT检测试剂，基于一系列酶促反应，测定血浆或全血形成血块所需要的时间，实现对相关疾病或缺陷的诊断。
PT试剂通常由自然或重组来源的组织因子、磷脂等物质组成。其中，主要活性成分为组织因子。组织因子也称促凝血酶原激酶、凝血因子Ⅲ等，是由263个氨基酸组成、分子质量为47kDa的跨膜受体蛋白质。组织因子分子中有三个结构域，其中1-219残基组成胞外区，能够与凝血因子Ⅶ高亲和性结合，并作为Ⅶa的辅因子，促进凝血因子Ⅹ转化为因子Ⅹa。磷脂也是试剂的重要组成部分，这是因为充分发挥组织因子的生物学活性，必须在体外与磷脂充分结合。PT检测方法有光化学方法(美国专利US5418141)、电化学方法(美国专利US6060323，中国专利CN201310301617)等，他们都是通过检测血样流动性或血浆浓度改变，完成对凝血酶原时间的测定。
美国专利US5314695是制备了一种由磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺组成的脂质体，将重组组织因子与制备的磷脂双分子层结合，制备了一种PT检测试剂。但是整个工艺过程十分繁琐，增大了时间成本和生产成本，不利于广泛应用。目前，常规的PT检测也是通过PT试剂完成的，但是这往往需要PT试剂与大型的血凝仪配合使用，这对于设备水平、操作人员的操作技能等都有较高要求。而且，PT测试不仅可以用于检测评估肾脏疾病、凝血缺陷，也常用于华法林抗凝疗法的INR值动态监测，而试剂和血凝仪配套使用，延长了PT测试的周期。不仅如此，市售的凝血试剂往往为干粉状，在使用前还需要预先进行复溶、预热 等操作才能进行测试，这就使得实验过程更加繁琐。这都使得PT值的即时检验(point-of-care testing，POCT)变得几乎不可能。鉴于PT检测在临床上的重要作用，制备一种准确度高、重复性好，并且能够实现PT值即时检测的试剂具有重要现实意义。
美国专利US5418141将组织因子、磷脂、盐、Ca2+等在缓冲溶液中充分分散，固定在特殊材质的材料上烘干成膜，制备成一种PT检测卡。所制备检测卡可以通过检测光信号变化，配合小型光电探测器即可完成凝血酶原时间测定，这为实现通过光化学方法测定PT值临床检验提供一种新思路。
结合上述经验，目前基于电化学方法，检测PT的文献和专利仍鲜有报道。本发明的创新之处在于通过电化学的方法，制备了一种能够实现PT检测的检测卡，所制备的PT检测卡与本司研发的小型设备配套使用，即可完成对PT的临床即时检测。所制备的凝血酶原时间检测卡特征在于，无需与大型设备配套使用，大大降低的测试成本；对操作者的技术水平要求较低，甚至患者自己就能够完成PT检测；所制备的检测卡中的反应试剂以固态形式与血样反应，无需复溶；所制备的检测卡每次使用一条，并且试剂被固定在检测卡上，不存在试剂污染。因此，本发明制备的检测卡有望应用于POCT领域，尤其是PT检验的临床实验，具有重要的研究和实践价值。此外，该检测卡制备方法简单、准确度高、易于接受，具有很高的的市场价值。
技术实现要素：
根据凝血酶原时间(PT)检测方面的相关研究进展及成果，本发明的创新之处在于提供了基于电化学这一方法的凝血酶原时间检测卡，解决在PT检测在POCT领域的技术不足，能够简单快捷的完成对患者PT检测，并且结果具有良好的准确性、重复性。
本发明制备的凝血酶原时间检测卡，由凝血酶原时间试剂、电化学基板等部分组成。当未经凝血处理的新鲜指尖血或静脉血滴加到附着有凝血酶原时间试剂的导电基板上时，启动外源性凝血过程，相关设备能够采集到电信号的变化，进而测定出PT值。所述凝血酶原时间试剂由组织因子脂化物和缓冲液体系组成。具体步骤包括：
(1)将磷脂溶解在含有表面活性剂，pH值为7.0-7.5Tris缓冲溶液(50-200mM)中，搅拌30-60min。其中磷脂含量为0.01％-0.1wt％；
(2)将rTF溶解在步骤(1)的溶液中，得到组织因子含量0.005wt％的溶液，超声处理10-30min，工作时间3s，间歇时间2s，使二者充分混合得到组织因子脂化物；
(3)将该组织因子酯化物于常温下，在pH 7.0-7.5的Tris缓冲溶液(10mM)中，透析6-72h；
(4)制备pH 7.0-7.5的50mM Tris缓冲溶液，并且含有：10-200mM氯化钠、8.2-10.5％wt％海藻酸钠、1.0-4.2wt％甘氨酸、4.5-5.5wt％PEG 8000、0.4-1.0wt％硫柳汞、2-4mM氯化钙；
(5)采用步骤(4)制备的溶液将步骤(3)制备的溶液稀释1-100倍；
(6)将步骤(5)制备的溶液以涂覆或滴加的方式加入在导电基板的特定区域内，在40-80℃下烘干5-30min制备得到凝血酶原时间检测卡。
其中，步骤(1)所选择的磷脂为磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺中的至少一种，优选为磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸按照质量比2:1混合。此外，用所选磷脂能够起到相同作用的磷脂也应视为被保护内容。
其中，步骤(1)和(4)可选用的缓冲溶液可以为Tris、HEPES、TES、PBS等，浓度范围20-300mM且pH范围为5.0-8.0，但优选为Tris缓冲溶液(pH为7.0-7.5，50mM)。能够在所需pH范围内起到缓冲左右的缓冲体系，也应视为被保护内容。
其中，步骤(1)所选择的溶解条件可以为振荡、超声、搅拌等凡能促进和分散作用的手段，均应视为被保护内容，其目的在于使得磷脂充分分散，其中搅拌条件优选为30-60min。
其中，步骤(1)所选择的表面活性剂为TritonX-100、Tween-80等中的至少一种，优选为TritonX-100。此外，在体系中能够与所选TritonX-100起到类似同作用的表面活性剂也应视为保护内容。
其中，步骤(2)所选择的rTF来源为人、兔、猪等来源中的至少一种，优选为重组人组织因子，且组织因子含量0.001-0.01wt％，优选为0.005wt％。
其中，步骤(2)加入rTF后的处理方式为振荡、超声、搅拌等，目的在于充分分散rTF，并使rTF与磷脂充分结合，其中超声条件10-30min，工作时间3s，间歇时间2s，优选15min，具体超声条件因所选材料和超声设备不同，可能略有差异，凡与该手段相似的操作也应列为被保护内容。
其中，步骤(3)选用的透析液可以为Tris、HEPES、PBS等中的至少一种，浓度范围为5-300mM且pH范围为5.0-8.0，优选为7.0-7.5的Tris缓冲溶液(10mM)凡能够在所需pH范围内起到缓冲作用的缓冲体系，也应视为被保护内容。
其中，步骤(3)选用的透析条件为0-40℃环境，透析时间可以为6-72h，优选为常温透析24h。此外，该步骤中其他能够与透析起到相似作用的分离手段，例如树脂吸附，也应视为被保护内容。
其中，步骤(4)所选择的多糖可以选择海藻酸钠、蔗糖、淀粉、纤维素等中的至少一种，含量为8.2-10.5％wt％，优选为海藻酸钠。
其中，步骤(4)所选择的电解质可以选择氯化钠、氯化钾、硫酸钠等中的至少一种，含量为10-200mM，优选为20mM氯化钠。
其中，步骤(4)所选择的甘氨酸还可以为牛血清白蛋白、人血清白蛋白等中的至少一种，含量为1.0-10.0wt％，优选为甘氨酸。
其中，步骤(4)所选择的PEG 8000还可以为其他分子量的PEG、PVA等中的至少一种，含量为4.5-5.5wt％，优选为PEG 8000。其他能够起到相似作用的聚合物也应视为被保护内容。
其中，步骤(4)所选择的硫柳汞，其他能够起到相似作用的防腐剂或抑菌剂也应视为被保护内容。
其中，步骤(4)所选择的引入Ca2+的试剂可以为氯化钙、硝酸钙等易溶性钙盐的至少一种，含量为2-4mM，优选为的氯化钙。未列举的其他含有Ca2+的相关试剂也应视为被保护内容。
其中，步骤(5)所选择稀释倍数可以为1-100倍，优选为10-30倍。具体倍数因所选组织因子活力、磷脂的不同而有所不同，也应视为被保护内容。
其中，步骤(6)所选择的将试剂加到导电基板的反应区的方法可以是吸附法、交联法、粘合剂法等中的至少一种；由于吸附法操作简单，本发明选择吸附法，即直接将试剂滴加或涂抹于导电基板的反应区内，进行烘干。其他将试剂固定在导电基板上的方法也应视为被保护内容。
其中，步骤(6)所选择烘干条件为40-80℃，烘干时间为5-30min，优选为70℃条件下，烘干10min。具体条件因所选组织因子活力、磷脂的不同而有所不同，也应视为被保护内容。
本发明提供了一种基于电化学方法的凝血酶原时间(PT)检测卡的制备方法，制备PT检测卡的性能优劣，主要是由试纸条反应区组分中的rTF和磷脂等关键因素决定的。因此，在开发本发明中尤其注意(1)组织因子的活性和特异性；(2)磷脂的种类、浓度、用量等。
本发明的优势在于：基于电化学方法，提供了一种凝血酶原时间检测卡及其制备方法，能够完成对指尖血和未做抗凝处理新鲜血样的PT检测；无需大型仪器即可对患者的凝血酶原时间予以检测；操作简单，对操作人的技术水平要求不高；制备方法简单，便于大规模应用；检测过程快速，检测结果准确、重复性好。基于以上优点，该凝血酶原时间检测卡可应用于POCT领域，在临床检验等方面具有广阔前景。
附图说明
附图为凝血酶原时间检测试剂和所制备的凝血酶原时间检测卡测定血样的PT值的对比情况。其中横、纵坐标分别为凝血酶原时间检测卡在配套设备上测定的INR值和市售凝血酶原试剂在血凝仪上测定的血样INR值。
具体实施方式
关于本专利的具体实施过程将在以下实施例中详细描述，具体实施过程包括但不限于下述实施例。
实施例1磷脂溶液的制备
本发明制备的凝血酶原时间检测卡检测功能的发挥主要基于成分中组织因子脂化物的作用，组织因子脂化物由重组组织因子和磷脂制备得到。其中磷脂是辅助组织因子发挥作用的重要组成部分，是该凝血酶原时间检测卡能够完成检测的重要成分。因而制备均一、稳定的磷脂溶液是制备该凝血酶原时间检测卡的重要前提。
具体地，将冻干的磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸按质量比2:1混合(0.6g)加入1L该缓冲溶液中，30-40℃条件下磁力搅拌30min，充分分散溶解。
实施例2组织因子脂化物的制备
组织因子脂化物是该凝血酶原时间检测卡中具有生物活性的主要成分，参与启动外源性凝血过程。具体地，将rTF溶解于实施例1所制备的磷脂混合溶液中，室温混合并超声15min(设置工作时间3s，间歇时间2s)，即可获得组织因子脂化物溶液。将该组织因子酯化物于常温下，在pH 7.0Tris缓冲溶液(10mM)中，透析48h。
实施例3点膜工艺
本发明制备的凝血酶原时间检测卡(电化学法)与传统凝血酶原时间试剂盒的具有很多不同之处，例如二者有效成分与待测血样反应时的存在状态。对于前者，有效成分以固态薄膜形式均匀分散在导电基板的反应区内；而对于后者，参与反应时反应试剂则以液体形式存在。为在导电基板上制备均匀分散的固态薄膜，制备具体实施方法是：
制备含量为50mM氯化钠、10％wt％海藻酸钠、3.5wt％甘氨酸、5.0wt％PEG 8000、0.8wt％硫柳汞、4mM氯化钙，pH 7.0浓度为50mM的Tris缓冲溶液。将该缓冲液体与经透析处理的组织因子脂化物按照50:1的体积比混合均匀，滴加导电基板的特定区域内，并在70℃条件下干燥10min，即得到带有附着有组织因子脂化物的凝血酶原时间检测卡。将制备完成的检测卡放入含有硅胶干燥剂的密封袋中，密封并于4℃条件下保存，使用时恢复至室温使用。
实施例4基于所制备的凝血酶原时间检测卡(电化学法)的血样PT值检测
所制备的凝血酶原时间检测卡(电化学法)可用于凝血酶原时间(PT)的临床检验。为检验测试条测量结果的准确性，将本发明制备的PT检测卡与市售的PT试剂进行了对照。具体地，采用本发明制备的PT检测卡和配套测试仪测定了50例指尖血样本的PT值，样本信息如表1所示。
表1样本信息
所测定血样的PT和INR值可以直接从测试仪中读出。购买市售的凝血酶原时间(PT)试剂盒(上海太阳生物技术有限公司)，利用血凝仪(普朗PUN-2048A半自动血凝分析仪)测定相同50人的静脉血的PT和INR值。对比二者测量结果，如附图所示。由图可知，所制备的基于电化学法制备凝血酶原时间检测卡与市售的凝血酶原时间检测试剂的测试结果具有很高的吻合度。
以上实施例对本发明进行了详尽的描述，旨在让本领域或相关技术人员认识、了解本发明的内容并能够加以实施，但本发明的内容并不限于此。凡以本发明为基础，进行相关的延伸、等效变换或修饰，都应包括在本发明的保护范围内。