一种用于免疫沉淀的离心柱及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，尤其涉及分子相互作用研究中应用免疫沉淀及类似方法分离相互作用的分子的方法。

背景技术：

随着蛋白质组学研究的兴起，生物大分子间的相互作用越来越引起研究者的兴趣。其中包括蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用，和蛋白质-调控RNA的相互作用等。在此背景下，实验方法和研究手段成为实验成功的重要因素。免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）技术及其衍生方法，就是蛋白质组学研究非常重要的手段。

免疫沉淀技术的是专门研究蛋白质之间或者蛋白质与遗传物质之间相互作用的方法，其凭借特异性强、灵敏度高等优点已逐渐被人们应用于蛋白质与基因的研究领域。免疫沉淀技术基于抗原-抗体的特异性反应，从未知样品或者细胞裂解液中寻找特异性的目标蛋白。

目前免疫沉淀技术已经广泛应用在蛋白质蛋白质相互作用研究，蛋白质DNA相互作用研究等。在医学上，用于丙型肝炎患者补体研究【Sshifferli JA Clin Exp Immunol 42:387】,鉴定抗大肠杆菌分子伴侣GroEL抗体研究【Vandenbroeck K Eur J Biochem 251(1/2):181】,鼠疫监测【Yue MX Journal of Chinese endemic prevention 19(6):342】。由于检测试剂盒药品还比较昂贵，限制了免疫沉淀技术的应用。然而免疫沉淀技术提供的新式实验方法和良好实验结果已逐渐被大部分研究者所接受，终有一天随着技术的改进以及试剂价格的降低，免疫沉淀技术会代替以往那些繁杂和粗糙的方法成为研究蛋白质与蛋白质、蛋白质与遗传物质之间相互作用的最好方法，将会有更广泛的应用。

典型的免疫沉淀实验包括几个实验步骤，1.样本裂解处理，主要是细胞裂解液；2.抗体与细胞裂解液中的目标蛋白结合；3.上述步骤形成的抗原-抗体复合物与ProteinA/G偶联的琼脂糖凝胶孵育，使抗体与ProteinA/G反应，形成ProteinA/G琼脂糖凝胶-抗体-目标抗原复合物；4.将形成的琼脂糖凝胶复合物离心、洗涤后重悬于电泳上样缓冲液；5.在电泳上样缓冲液中加入还原剂，煮沸后电泳检测。

在上述的实验操作中，ProteinA/G偶联的琼脂糖凝胶要经过多次的洗涤、离心。在此过程中由于ProteinA/G偶联的琼脂糖凝胶本身固有的特性，离心并不能将凝胶完全沉于离心管底部，变成非常结实的沉淀。这样在去掉上清的过程中，不可避免的会有ProteinA/G偶联的琼脂糖凝胶会随着上清而损失。由于免疫沉淀用的抗体和ProteinA/G偶联的琼脂糖凝胶都是非常昂贵的试剂。凝胶的损失不但会造成金钱的浪费，更重要的由于抗体以及结合的目标抗原随着凝胶丧失，会影响免疫沉淀实验的结果。

典型的免疫沉淀操作见说明书附图图8

从图上可以看出，典型的免疫沉淀操作包括5-6次的离心操作。由于琼脂糖凝胶固有的特性，每次离心去上清都会有10%-20%的凝胶损失。并且还是由于琼脂糖凝胶的固有特性，去上清并不能去除的很干净，凝胶中还是有部分的上清存在。这样，为了使ProteinA/G琼脂糖凝胶-抗体-抗原复合物背景更干净，很多研究者会增加洗涤的步骤。这样会进一步增加琼脂糖凝胶总量的损失。

为了解决这一问题，研究者通常都会自行想一些解决办法，通常的做法是增加一些普通的琼脂糖凝胶，就是没有偶联ProteinA/G的空白琼脂糖凝胶，混合在ProteinA/G琼脂糖凝胶中一起洗涤，离心。由于空白琼脂糖凝胶价格较低，这样在最后实验完成后，尽管会有50%-60%的总的琼脂糖凝胶损失掉，但是由于在琼脂糖凝胶中混合了空白的琼脂糖凝胶，这样ProteinG/A琼脂糖凝胶-抗体-抗原的总体损失比例会降低。但是这种方法有几个缺点。1.混合空白琼脂糖凝胶的方法并没有彻底解决离心过程中琼脂糖凝胶损失的问题，至少降低了ProteinG/A琼脂糖凝胶的损失比例；2.空白琼脂糖凝胶不能与抗体结合，并不参与免疫沉淀反应，实际上降低了免疫沉淀的效率。

解决这一问题的另一个方法是在免疫沉淀实验中不选择ProteinG/A偶联的琼脂糖凝胶，而选择ProteinG/A偶联的磁珠。在公布号为CN 101726603 A的专利中描述了一种蛋白A/G偶联的金磁微粒进行免疫沉淀的方法。尽管该专利的目的并不是为了解决免疫沉淀中琼脂糖凝胶的损失问题，但Protein G/A偶联磁珠应用于免疫沉淀的缺点是，1.ProteinA/G偶联的磁珠价格较高，相对于琼脂糖凝胶来说，磁珠的成本较高，因而ProteinA/G磁珠的售价也高于ProteinA/G偶联的琼脂糖凝胶。甚至高出几倍；2.ProteinA/G偶联的磁珠并不能完全解决损失问题，尽管比琼脂糖凝胶传统离心方法损失少，但是在整个实验中，ProteinA/G偶联磁珠也会有10%-20%的损失，并不能彻底解决损失问题。

相对于传统方法与磁珠法，本发明的有点在于，1.操作损失少，在整个免疫沉淀反应实验中，应用本发明的离心柱，ProteinA/G偶联的琼脂糖凝胶的损失少用2%。2.实验时间缩短，在免疫沉淀实验中，传统的ProteinA/G琼脂糖凝胶离心法每次离心的时间在5分钟左右，整个实验离心时间约为30分钟；ProteinA/G磁珠法，磁珠贴壁时间每次约为1-2分钟，整个实验过程中磁珠贴壁时间约为10-15分钟。而本发明所用的离心柱每次离心时间只有5秒，整个实验过程中离心时间不超过2分钟。大大缩短了实验时间。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一套用于免疫沉淀的离心柱组件，该组件包含一个离心柱以及一个离心柱套管。该组件在免疫沉淀实验中针对不同的实验操作可以分开也可以合并使用。见图1

本发明所描述的离心柱，其特征在于离心柱柱管包括柱体、上盖、筛板、密封圈和下堵头。见图2、图3

本发明所描述的离心柱，其柱管材料包括但不限于聚丙烯，聚苯乙烯，高密度聚乙烯等。其中优选聚丙烯材料

本发明所描述的离心柱筛板，其筛板材料包括但不限于聚丙烯，混合纤维或者超高分子量聚乙烯。其中优选超高分子量聚乙烯

本发明所描述的离心柱筛板，其特征在于筛板孔径在5-200μm之间，其中优选5-100μm

本发明所描述的密封圈，其特征在于密封圈外径与离心柱柱体内径一致，或稍大于柱体内径，以保证密封效果

本发明所描述的下堵头，其特征在于下堵头为一个帽型设计，下堵头的内径与柱体出口的外径一致以保证密封效果

本发明所描述的离心柱上盖，其特征在于上盖与柱体连为一体，且上盖规格与柱体进液口相匹配。盖上上盖后不会有液体漏出

本发明所描述的离心柱组件，离心柱套管的材质包括但不限于聚丙烯，聚苯乙烯，高密度聚乙烯等，其中优选聚丙烯

本发明所描述的离心柱组件，离心柱套管的内径小于柱体最粗处的外径，以保证离心时，离心柱不会陷入离心柱套管内

本发明可用于免疫沉淀实验中抗原-抗体复合物与ProteinA/G偶联的琼脂糖凝胶的反应。本发明所示的离心柱，在盖上上盖和下堵头的情况下。可以将细胞裂解液、抗体以及Protein A/G偶联的琼脂糖凝胶加在离心柱中，然后将离心柱放于摇床或者振荡器上进行免疫沉淀反应。如图4

本发明所描述的用于免疫沉淀的离心柱，免疫沉淀反应结束后，打开下堵头，将离心柱放于离心柱套管中。通过离心可以将反应废液与琼脂糖凝胶分离。在漂洗和洗涤的过程中，可以通过离心可以将漂洗液与琼脂糖凝胶分离。漂洗液或反应废液被收集于离心柱套管中，而凝胶保留在离心柱内。如图5

本发明所描述的用于免疫沉淀的离心柱，免疫沉淀反应结束后，在不堵上下堵头的情况下，可以通过真空负压分离设备，将反应废液或者漂洗液与琼脂糖凝胶分离。反应废液与漂洗液收集到负压收集设备中，琼脂糖凝胶保留在里离心柱内。如图6

本发明所描述的用于免疫沉淀的离心柱，免疫沉淀反应结束后，在不堵下堵头的情况下，可以将普通医用注射器接在离心柱出口实现反应废液或者漂洗液与琼脂糖凝胶的分离。反应废液与漂洗液收集到注射器中，而琼脂糖凝胶保留在离心柱内。如图7。

本发明的有益效果包括

1.在本发明中，包括一个带有上盖和下堵头的离心柱，在盖上上盖和堵上下堵头的情况下，整个离心柱成为了一个密闭的空间。在免疫沉淀反应过程中，可以将反应液中的全部组分都加入离心柱中进行反应。在反应过程中还可进行颠倒、振荡等操作，而不会造成液体的泄露

2.在本发明的离心柱中增加了一块筛板，筛板的孔径小于ProteinA/G偶联的琼脂糖凝胶颗粒的粒径。因此在离心的过程中。琼脂糖凝胶被截留在离心柱内部，而反应的废液或者洗涤液被离心分离

3.在本发明所描述的离心柱组件中包括一个离心管和一个套管，在反应结束离心的过程中，反应废液或者洗涤液被离心收集到外面的套管中。省却了传统免疫沉淀反应离心过程中倾倒或者吸取上清液的过程

4.本发明所描述的用于免疫沉淀的离心柱还可以通过和真空负压抽吸装置或者注射器连接而进行免疫沉淀实验。从而免去了离心的过程，适用于不具备离心机条件的免疫沉淀实验研究人员。

附图说明

图1用于免疫沉淀的离心柱组件模式图

图2离心柱部件细节

图3离心柱俯视图

图4用本发明的离心柱进行免疫沉淀反应的模式图

图5用离心法利用本发明的离心柱组件进行免疫沉淀实验，反应产物以及洗涤废液分离的模式图

图6用真空分离器利用本发明的离心柱进行免疫沉淀实验，反应产物以及洗涤废液分离的模式图

图7用注射器利用本发明的离心柱进行免疫沉淀实验，反应产物以及洗涤废液分离的模式图例

图8典型的免疫沉淀操作图例

1.用于免疫沉淀的离心柱；

2.用于免疫沉淀的离心柱套管

3.离心柱柱体

4.离心柱上盖

5.离心柱密封圈

6.离心柱筛板

7.离心柱出液口

8.离心柱下堵头

9.离心柱连接臂

10.进行免疫沉淀反应的蛋白A/G偶联琼脂糖-抗体-抗原反应混合物

11.离心机转子

12.离心机

13.真空分离器

14.连接软管

15.真空泵

16.硅胶管

17.医用注射器。

本发明的具体实施方式

本发明所指的用于免疫沉淀的离心柱组件包括一个离心柱1和配套的离心柱套管2，其中离心柱套管的内径小于离心柱的外径，保证离心时离心柱不会掉到套管中

离心柱包括一个带有上盖4的离心柱柱体3，上盖通过一个连接臂9与柱体相连。离心柱内装有一块筛板6，筛板的孔径低于200μm，既保证反应废液能顺利的流出又防止琼脂糖凝胶漏过发生损失。筛板上方装有一个圆圈状的密封圈5，主要功能是密封筛板边缘，防止筛板在离心柱柱体内移动甚至掉出离心柱外。离心柱1配有一个下堵头，下堵头的口径与离心柱出口7的外径相匹配，保证装上后出口处不会有液体漏出。

实施例1 利用本发明的免疫沉淀离心柱组件分离鉴定培养细胞中的CD8蛋白

1.材料与试剂

细胞：培养的T淋巴细胞

抗体：抗CD8单克隆抗体

琼脂糖凝胶：Protein G偶联的琼脂糖凝胶4B

细胞裂解液：RIPA缓冲液， Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4， NP-40: 1%，去氧胆酸钠：0.25%， NaCl: 150 mM， EDTA: 1 mM， PMSF: 1 mM，抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 μg/ml， Na3VO4: 1 mM， NaF: 1 mM PH7.4

磷酸盐缓冲液 PBS缓冲液， NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L PH7.4

离心柱本发明所示的免疫沉淀离心柱组件

2.实验步骤

1)用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS

2)加入预冷的RIPA缓冲液(1ml缓冲液/10⁷个细胞)

3)用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min

4)4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中

5)准备Protein G琼脂糖凝胶，吸取200ul Protein G琼脂糖凝胶，放入离心柱中，盖上上盖，不加下堵头。然后将离心柱放入离心柱套管中

6)将离心柱和套管一起放入离心机中，4℃，12000g离心5秒钟，取出。倒掉套管中的废液

7)在离心柱中加入500ulPBS ，盖上离心柱上盖，然后将离心柱放回套管4℃，12000g离心5秒钟，取出，倒掉套管中的废液。重复此洗涤步骤一次

8)(Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响

9)用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度

10)去含总蛋白量约500μl的细胞裂解液上清到离心柱中，加入50ul的兔多的克隆抗体，盖上上盖，堵上离心柱下堵头。室温缓慢摇动抗原抗体混合物反应2小时

11)反应完成后，在离心柱中加入100μl Protein G琼脂糖凝胶来捕捉抗原抗体复合物，盖上离心柱上盖，堵上下堵头，室温缓慢摇动抗原抗体混合物反应1小时

12)打开离心柱下堵头，将离心柱放于离心柱套管中，12000rpm瞬时离心5s，收集ProteinG琼脂糖凝胶-抗原抗体复合物，丢弃离心废液

13)在离心柱中加入预冷的PBS缓冲液800μl，混匀，4℃，12000g离心5秒钟丢弃洗涤废液

14)用预冷的PBS缓冲液重复洗涤3遍，4℃，12000g离心5秒钟，丢弃洗涤废液，反应后的ProteinG琼脂糖凝胶-抗原抗体复合物保留在离心柱中

15)用60μl的 2×上样缓冲液将Protein G琼脂糖凝胶-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀

16)将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清用SDS-PAGE电泳检测。

实施例2 用本发明的免疫沉淀离心管组件进行免疫沉淀实验与传统方法的比较

【目的】用免疫沉淀实验，比较使用本发明的离心管组件与传统方法的凝胶回收量

【材料与试剂】

靶蛋白：CD8蛋白

细胞：培养的T淋巴细胞

抗体：抗CD8单克隆抗体

琼脂糖凝胶：Protein G偶联的琼脂糖凝胶4B

细胞裂解液：RIPA缓冲液， Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4， NP-40: 1%，去氧胆酸钠：0.25%， NaCl: 150 mM， EDTA: 1 mM， PMSF: 1 mM，抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 μg/ml， Na3VO4: 1 mM， NaF: 1 mM PH7.4

磷酸盐缓冲液 PBS缓冲液， NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L PH7.4

离心柱：本发明所示的免疫沉淀离心柱组件

离心管：实验室用1.5ml离心管

【实验操作】

1.用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；

2.加入预冷的RIPA 缓冲液(1ml缓冲液/10⁷个细胞)；

3.用预冷的细胞刮子将细胞从培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min；

4.将细胞平均分成两份，一份用本发明的离心柱组件处理，另一份用传统的离心方法处理；

5.4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中。以下步骤两种方法同时处理，分别以（a本发明方法）和（b传统方法）表示；

6.洗涤Protein G琼脂糖凝胶；

a.准备Protein G琼脂糖凝胶，吸取200ul Protein G琼脂糖凝胶，放入离心柱中，盖上上盖，不加下堵头。然后将离心柱放入离心柱套管中

将离心柱和套管一起放入离心机中，4℃，12000g离心5秒钟，取出。倒掉套管中的废液

在离心柱中加入500ulPBS ，盖上离心柱上盖，然后将离心柱放回套管4℃，12000g离心5秒钟，取出，倒掉套管中的废液。重复此洗涤步骤一次

b.吸取200ul Protein G琼脂糖凝胶，放入1.5ml离心管中。将离心管放入离心机，4℃，10000g离心5分钟，取出。用移液枪轻轻吸取上清液。吸取的时候小心，尽量避免吸到琼脂糖凝胶。重复此洗涤步骤一次

7.用(Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响；

8.用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度；

9.免疫沉淀，抗原-抗体反应；

a.取含总蛋白量约500μl的细胞裂解液上清到离心柱中，加入50ul的兔多的克隆抗体，盖上上盖，堵上离心柱下堵头。室温缓慢摇动抗原抗体混合物反应2小时

b.取含总蛋白量约500μl的细胞裂解液上清到1.5ml离心管中，加入50ul的兔多的克隆抗体，盖上上盖。室温缓慢摇动抗原抗体混合物反应2小。

10. Protein G琼脂糖凝胶捕捉抗原-抗体复合物；

a.反应完成后，在离心柱中加入200μl Protein G琼脂糖凝胶来捕捉抗原抗体复合物，盖上离心柱上盖，堵上下堵头，室温缓慢摇动抗原抗体混合物反应1小时

b.反应完成后，在1.5ml离心管中加入200μl Protein G琼脂糖凝胶来捕捉抗原抗体复合物，盖上离心管上盖，室温缓慢摇动抗原抗体混合物反应1小时

11. 分离Protein G琼脂糖凝胶-抗原-抗体复合物；

a.打开离心柱下堵头，将离心柱放于离心柱套管中，12000rpm瞬时离心5s，收集ProteinG琼脂糖凝胶-抗原抗体复合物，丢弃离心废液

b.将离心管放于离心机中，10000rpm离心5分钟，用移液枪小心吸取离心上清，操作时尽量小心，避免吸到琼脂糖凝胶，尽量将离心上清去除干净

12. 洗涤Protein G琼脂糖凝胶-抗体-抗原复合物；

a.在离心柱中加入预冷的PBS缓冲液800μl，混匀，4℃，12000g离心5秒钟丢弃洗涤废液

用预冷的PBS缓冲液重复洗涤3遍，4℃，12000g离心5秒钟，丢弃洗涤废液，反应后的ProteinG琼脂糖凝胶-抗原抗体复合物保留在离心柱中

b.在离心管中加入预冷的PBS缓冲液800μl，混匀，4℃，12000g离心5分钟。离心后用移液枪小心吸取离心上清。尽量不吸到琼脂糖凝胶，尽量将上清吸取干净

c.用预冷的PBS缓冲液重复洗涤3遍，4℃，12000g离心5分钟，小心去掉离心上清，反应后的ProteinG琼脂糖凝胶-抗原抗体复合物保留在离心柱中

13. 用400ul冷的PBS缓冲液将Protein G琼脂糖凝胶-抗体-抗原复合物充分重悬后吸出至一个干净的离心管中，测量沉淀后的凝胶体积；

【实验结果】

用本发明中的离心柱组件进行免疫沉淀实验，操作后ProteinG琼脂糖凝胶体积为约200ul，几乎没有损失。而用传统方法操作后的ProteinG琼脂糖凝胶体积约为70ul，凝胶损失达到60%-70%. 实验结果显示，用本发明的离心柱组件进行免疫沉淀实验，能最大限度的保留Protein G琼脂糖凝胶，从而更有效的检测目的蛋白。

实施例3 用本发明的免疫沉淀离心管组件进行磁珠法免疫沉淀实验的比较

【目的】用免疫沉淀实验，比较使用本发明的离心管组件与磁珠方法的回收量

【材料与试剂】

靶蛋白：CD8蛋白

细胞：培养的T淋巴细胞

抗体：抗CD8单克隆抗体

琼脂糖凝胶：Protein G偶联的琼脂糖凝胶4B

磁珠：Protein G偶联的磁珠

细胞裂解液：RIPA缓冲液，Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4， NP-40: 1%，去氧胆酸钠：0.25%， NaCl: 150 mM， EDTA: 1 mM， PMSF: 1 mM，抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 μg/ml， Na3VO4: 1 mM， NaF: 1 mM PH7.4

磷酸盐缓冲液 PBS缓冲液， NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L PH7.4

离心柱：本发明所示的免疫沉淀离心柱组件

磁力架和离心管：实验室用1.5ml离心管和磁珠专用磁力架

【实验操作】

1.用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS

2.加入预冷的RIPA 缓冲液(1ml缓冲液/10⁷个细胞)

3.用预冷的细胞刮子将细胞从培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min

4.将细胞平均分成两份，一份用本发明的离心柱组件处理，另一份用传统的离心方法处理

5.4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中。以下步骤两种方法同时处理，分别以（a本发明方法）和（b磁珠分离法）表示

6.洗涤Protein G琼脂糖凝胶（ProteinG磁珠）

a.准备Protein G琼脂糖凝胶，吸取200ul Protein G琼脂糖凝胶，放入离心柱中，盖上上盖，不加下堵头。然后将离心柱放入离心柱套管中

将离心柱和套管一起放入离心机中，4℃，12000g离心5秒钟，取出。倒掉套管中的废液

在离心柱中加入500ulPBS ，盖上离心柱上盖，然后将离心柱放回套管4℃，12000g离心5秒钟，取出，倒掉套管中的废液。重复此洗涤步骤一次

b.吸取50ul Protein G琼脂糖凝胶，放入1.5ml离心管中。将离心管放到磁力架上，静止待磁珠贴壁。用移液枪轻轻吸取上清液。吸取的时候小心，尽量避免吸到磁珠。重复此洗涤步骤一次

7.用(Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响

8.用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度

9.免疫沉淀，抗原-抗体反应

a.取含总蛋白量约500μl的细胞裂解液上清到离心柱中，加入50ul的兔多的克隆抗体，盖上上盖，堵上离心柱下堵头。室温缓慢摇动抗原抗体混合物反应2小时

c.取含总蛋白量约500μl的细胞裂解液上清到1.5ml离心管中，加入50ul的兔多的克隆抗体，盖上上盖。室温缓慢摇动抗原抗体混合物反应2小时

10. Protein G琼脂糖凝胶（Protein G磁珠）捕捉抗原-抗体复合物

a.反应完成后，在离心柱中加入200μl Protein G琼脂糖凝胶来捕捉抗原抗体复合物，盖上离心柱上盖，堵上下堵头，室温缓慢摇动抗原抗体混合物反应1小时

b.反应完成后，在1.5ml离心管中加入50μl Protein G磁珠来捕捉抗原抗体复合物，盖上离心管上盖，室温缓慢摇动抗原抗体混合物反应1小时

11. 分离Protein G琼脂糖凝胶-抗原-抗体复合物

a.打开离心柱下堵头，将离心柱放于离心柱套管中，12000rpm瞬时离心5s，收集ProteinG琼脂糖凝胶-抗原抗体复合物，丢弃离心废液

c.将离心管放于离心机中，10000rpm离心5分钟，用移液枪小心吸取离心上清，操作时尽量小心，避免吸到琼脂糖凝胶，尽量将离心上清去除干净

12. 洗涤Protein G琼脂糖凝胶-抗体-抗原复合物

a.在离心柱中加入预冷的PBS缓冲液800μl，混匀，4℃，12000g离心5秒钟丢弃洗涤废液

用预冷的PBS缓冲液重复洗涤3遍，4℃，12000g离心5秒钟，丢弃洗涤废液，反应后的ProteinG琼脂糖凝胶-抗原抗体复合物保留在离心柱中

b.在离心管中加入预冷的PBS缓冲液800μl，混匀，4℃，12000g离心5分钟。离心后用移液枪小心吸取离心上清。尽量不吸到琼脂糖凝胶，尽量将上清吸取干净

用预冷的PBS缓冲液重复洗涤3遍，4℃，12000g离心5分钟，小心去掉离心上清，反应后的ProteinG琼脂糖凝胶-抗原抗体复合物保留在离心柱中

13. 用400ul冷的PBS缓冲液将Protein G琼脂糖凝胶-抗体-抗原复合物充分重悬后吸出至一个干净的离心管中，测量沉淀后的凝胶(磁珠)体积

【实验结果】

用本发明中的离心柱组件进行免疫沉淀实验，操作后ProteinG琼脂糖凝胶体积为约200ul，几乎没有损失。用磁珠方法操作后的ProteinG磁珠体积约为40ul，磁珠损失约为20%. 实验结果显示，用本发明的离心柱组件进行免疫沉淀实验，能最大限度的保留Protein G琼脂糖凝胶，从而更有效的检测目的蛋白。

实施例4 采用真空分离器利用本发明的免疫沉淀离心柱组件分离鉴定培养细胞中的CD8蛋白

【目的】试验本发明的免疫沉淀离心柱组件采用真空负压分离器进行免疫沉淀试验的可行性

【材料与试剂】

细胞：培养的T淋巴细胞

抗体：抗CD8单克隆抗体

琼脂糖凝胶：Protein G偶联的琼脂糖凝胶4B

细胞裂解液：RIPA缓冲液， Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4， NP-40: 1%，去氧胆酸钠：0.25%， NaCl: 150 mM， EDTA: 1 mM， PMSF: 1 mM，抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 μg/ml， Na3VO4: 1 mM， NaF: 1 mM PH7.4

磷酸盐缓冲液 PBS缓冲液， NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L PH7.4

离心柱本发明所示的免疫沉淀离心柱组件

真空分离器实验室用16孔真空分离器

3.实验步骤

1)用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS

2)加入预冷的RIPA 缓冲液(1ml缓冲液/10⁷个细胞)

3)用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min

4)4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中

5)准备Protein G琼脂糖凝胶，吸取200ul Protein G琼脂糖凝胶，放入离心柱中，不盖上盖，不加下堵头。然后将离心柱放入真空分离器中，使离心柱出口插入分离器小孔中

6)开启真空泵，真空抽吸2分钟，吸掉Protein G琼脂糖凝胶中的废液

7)在离心柱中加入500ulPBS ，然后将离心柱放回真空分离器，真空抽吸2分钟，吸掉废液。重复此洗涤步骤一次

8)(Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响

9)用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度

10) 去含总蛋白量约500μl的细胞裂解液上清到离心柱中，加入50ul的兔多的克隆抗体，盖上上盖，堵上离心柱下堵头。室温缓慢摇动抗原抗体混合物反应2小时

11) 反应完成后，在离心柱中加入100μl Protein G琼脂糖凝胶来捕捉抗原抗体复合物，盖上离心柱上盖，堵上下堵头，室温缓慢摇动抗原抗体混合物反应1小时

12) 打开离心柱上盖和下堵头，将离心柱放于真空分离器上，开启真空泵抽吸2分钟，吸掉废液

13) 在离心柱中加入预冷的PBS缓冲液800μl，混匀，离心柱放于真空分离器上，开启真空泵抽吸2分钟，吸掉废液

14) 用预冷的PBS缓冲液重复洗涤3遍，真空吸掉洗涤废液，反应后的ProteinG琼脂糖凝胶-抗原抗体复合物保留在离心柱中

15) 用60μl的 2×上样缓冲液将Protein G琼脂糖凝胶-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀

16) 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清用SDS-PAGE电泳检测。

实施例5 采用注射器利用本发明的免疫沉淀离心柱组件分离鉴定培养细胞中的CD8蛋白

【目的】试验本发明的免疫沉淀离心柱组件采用注射器进行免疫沉淀试验的可行性

【材料与试剂】

细胞：培养的T淋巴细胞

抗体：抗CD8单克隆抗体

琼脂糖凝胶：Protein G偶联的琼脂糖凝胶4B

细胞裂解液：RIPA缓冲液， Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4， NP-40: 1%，去氧胆酸钠：0.25%， NaCl: 150 mM， EDTA: 1 mM， PMSF: 1 mM，抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 μg/ml， Na3VO4: 1 mM， NaF: 1 mM PH7.4

磷酸盐缓冲液 PBS缓冲液， NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L PH7.4

离心柱本发明所示的免疫沉淀离心柱组件

注射器

4.实验步骤

1)用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS

2)加入预冷的RIPA 缓冲液(1ml缓冲液/10⁷个细胞)

3)用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min

4)4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中

5)准备Protein G琼脂糖凝胶，吸取200ul Protein G琼脂糖凝胶，放入离心柱中，不盖上盖，不加下堵头

6)将离心柱出口与硅胶管相连，硅胶管另一端套入医用注射器出口处（去掉注射针头）

7)抽动注射器的活塞，吸掉Protein G琼脂糖凝胶中的废液

8)在离心柱中加入500ulPBS ，充分重悬，然后用注射器按照上述方法吸掉废液。重复此洗涤步骤一次

9)取下离心柱，将注射器中残留的废液倒入废液缸

10)(Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响

11) 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度

12) 去含总蛋白量约500μl的细胞裂解液上清到离心柱中，加入50ul的兔多的克隆抗体，盖上上盖，堵上离心柱下堵头。室温缓慢摇动抗原抗体混合物反应2小时

13) 反应完成后，在离心柱中加入100μl Protein G琼脂糖凝胶来捕捉抗原抗体复合物，盖上离心柱上盖，堵上下堵头，室温缓慢摇动抗原抗体混合物反应1小时

14) 打开离心柱上盖和下堵头，将离心柱按照上述方法连接注射器，抽动注射器活塞，吸掉废液

15) 在离心柱中加入预冷的PBS缓冲液800μl，混匀，用注射器吸掉废液

16) 用预冷的PBS缓冲液重复洗涤3遍，注射器吸掉洗涤废液，反应后的ProteinG琼脂糖凝胶-抗原抗体复合物保留在离心柱中

17) 用60μl的 2×上样缓冲液将Protein G琼脂糖凝胶-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀

18) 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清用SDS-PAGE电泳检测。