本发明属于新型功能纳米材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种赭曲霉毒素A光电化学传感器的制备方法及应用。
背景技术：
近年来，食品污染日趋严重和频繁，不仅造成巨额的经济损失，还会严重影响人类的健康。赭曲霉毒素A是由多种生长在粮食(小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等)、花生、蔬菜等农作物上的曲霉和青霉产生的。由于分布广泛，很容易通过污染的粮食或饲料以及该饲料喂养的动物等进入食物链，间接的进入人体内，最终造成肝肾损伤、繁殖障碍、免疫抑制、致癌致畸等严重后果。
食品检测是保证食品安全的重要环节，本发明提供了一种快速、简便、灵敏度和选择性高的光电化学免疫分析方法。光电化学传感器是基于物质的光电转换来确定待测物浓度的一类检测装置，光电化学检测方法具有灵敏度高、设备简单、易于微型化的特点，已经成为一种极具应用潜力的分析方法，在食品、环境、医药等领域具有广阔的应用前景。
本实验成功构建了在可见光激发下检测赭曲霉毒素A的光电化学免疫传感器。该传感器以TiO2和BiVO4为基底，其优良的导电性和大的表面积能有效减小背景信号。通过在电极表面直接滴加AgNO3和Na2S溶液，原位生成高光电转换率的窄带隙Ag2S作为信号放大材料。本发明制备的基于原位生成Ag2S的光电化学传感器，具有低成本、高灵敏、特异性好、检测快速、制备过程简单等优点，在可见光区域实现了对赭曲霉毒素A的快速、灵敏检测，有效克服了目前赭曲霉毒素A检测方法的不足。
技术实现要素：
本发明提供了一种赭曲霉毒素A光电化学传感器的制备方法及应用，实现了对赭曲霉毒素A的超灵敏检测。
本发明的目的之一是提供一种赭曲霉毒素A光电化学传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的赭曲霉毒素A光电化学传感器，用于检测赭曲霉毒素A。
本发明的技术方案，包括以下步骤。
1. 一种赭曲霉毒素A光电化学传感器的制备方法，包括以下几个步骤：
（1）将ITO导电玻璃切割至2.5 cm × 1.0 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超纯水清洗30 min，氮气吹干；
（2）取8 ~ 12 µL、5 mg/mL的TiO2滴加到导电玻璃的导电面，室温下晾干，4 ~ 6 µL、3 mg/mL的BiVO4滴加到TiO2上，室温下晾干，450℃煅烧30 min，冷却，得到BiVO4/TiO2，然后在其上面原位生长Ag2S, 制得Ag2S@BiVO4/TiO2修饰电极；
（3）继续在Ag2S@BiVO4/TiO2修饰电极表面滴加2 ~ 4 µL、3 mmol/L的巯基乙酸，室温下晾干，滴加3 ~ 5 μL 的含 1×10-2 mol/L1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺EDC和2×10-3 mol/L N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合溶液，4 ℃冰箱中干燥，超纯水冲洗；
（4）继续将3 ~ 5 µL、10 µg/mL的赭曲霉毒素A抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥，超纯水冲洗；
（5）继续将3 µL、质量分数为1% ~ 2% 的BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗电极表面；
（6）将4 µL、5 pg/mL-750 ng/mL的一系列不同浓度的赭曲霉毒素A抗原溶液滴加到电极表面，4 ℃冰箱中孵化30 min，超纯水冲洗电极表面除去未结合的赭曲霉毒素A抗原，制得一种赭曲霉毒素A光电化学传感器。
2.所述 TiO2的制备，步骤如下：
取0.02~0.03 mol钛酸四丁酯溶解于30 mL乙醇中，30 ℃下加入10 mL超纯水，搅拌120 min后，将混合溶液转移到高压釜中，200 ℃下反应10 ~ 14 h，所得产物用超纯水和无水乙醇离心洗涤，50 ℃真空干燥24 h，得到TiO2粉末。
3.所述 BiVO4的制备，步骤如下：
称取1.90 ~ 1.98 g的Bi(NO3)3·5H2O和0.77 ~ 0.79 g柠檬酸溶于10 mL乙二醇，形成溶液A；称取0.46 ~ 0.47g NH4VO3 溶于25 mL蒸馏水，形成浅黄色溶液B，将B溶液逐滴加入A溶液，再加入30 mL无水乙醇，搅拌30 min，再加入0.85 g Na2CO3调节pH，将混合溶液转移到高压釜中，180 ℃下反应20 ~ 24 h，所得产物用超纯水和无水乙醇离心洗涤三次，60 ℃真空干燥18 ~22 h，得到BiVO4。
4.所述Ag2S@BiVO4/TiO2的制备，包括以下几个步骤：
（1）BiVO4/TiO2的制备
取8 ~ 12 µL、5 mg/mL的TiO2滴加到导电玻璃的导电面，室温下晾干，4 ~ 6 µL、3 mg/mL的BiVO4滴加到TiO2上，室温下晾干，450℃煅烧30 min，冷却，得到BiVO4/TiO2；
（2）Ag2S@BiVO4/TiO2的合成
取2 ~ 4 µL、0.1 mol/L 的巯基乙酸滴加到BiVO4/TiO2，室温晾干，超纯水冲洗，取2 ~ 4 µL、0.08 mol/L 的AgNO3滴加到巯基乙酸修饰的BiVO4/TiO2，避光反应30 ~35 min，超纯水冲洗，最后取2 ~ 4 µL、0.1 mol/L的Na2S滴加到BiVO4/TiO2，室温下反应30 ~ 40 min，超纯水冲洗，得到Ag2S@BiVO4/TiO2。
5.赭曲霉毒素A的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，如权利要求1所制备的光电化学传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在10 mL、pH 7.4的含0.1 mol/L抗坏血酸的PBS缓冲溶液进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，设置电压为0.1 V，运行时间100 s，照射LED灯波长为400 ~ 450 nm；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔10 s开灯持续照射10 s，然后记录光电流，绘制工作曲线；
（4）将待测的赭曲霉毒素A样品溶液代替赭曲霉毒素A标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。
本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
（1）本发明使用了以TiO2和BiVO4为基底，TiO2拥有良好的光电活性、大的表面积、高稳定性和低成本；表面多孔结构的BiVO4，不但促进可见光的吸收，而且可加速电子空穴对的分离和增加其导电性；有效减小背景信号，以巯基乙酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺为交联剂，促进了抗体的有效结合。
（2）采用在电极表面直接滴加AgNO3和Na2S溶液，原位生成高光电转换率的窄带隙Ag2S作为信号放大材料, Ag2S作为光敏剂拥有高可见光吸收和快速电子转移路径，在BiVO4表面原位生长窄带隙的Ag2S，得到的Ag2S@BiVO4/TiO2有效促进电子转移和降低电子空穴对的符合，从而提高光电转化效率。在可见光区域实现了对赭曲霉毒素A的快速、从而提高了传感器的灵敏度，降低了检测限；
（3）一种赭曲霉毒素A光电化学传感器对赭曲霉毒素A的检测，操作简单，信号响应范围宽，实现高灵敏检测，其线性范围5 pg/mL ~ 750 ng/mL，检测限最低1.6 pg/mL，表明一种赭曲霉毒素A光电化学传感器可以达到准确测定的目的。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此
实施例1一种赭曲霉毒素A光电化学传感器的制备方法，包括以下几个步骤：
（1）将ITO导电玻璃切割至2.5 cm × 1.0 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超纯水清洗30 min，氮气吹干；
（2）取8 µL、5 mg/mL的TiO2滴加到导电玻璃的导电面，室温下晾干，4 µL、3 mg/mL的BiVO4滴加到TiO2上，室温下晾干，450℃煅烧30 min，冷却，得到BiVO4/TiO2，然后在其上面原位生长Ag2S, 制得Ag2S@BiVO4/TiO2修饰电极；
（3）继续在Ag2S@BiVO4/TiO2修饰电极表面滴加2 µL、3 mmol/L的巯基乙酸，室温下晾干，滴加3 μL 的含 1×10-2 mol/L1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺EDC和2×10-3mol/L N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合溶液，4 ℃冰箱中干燥，超纯水冲洗；
（4）继续将3 µL、10 µg/mL的赭曲霉毒素A抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥，超纯水冲洗；
（5）继续将3 µL、质量分数为1% 的BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗电极表面；
（6）将4 µL、5 pg/mL-750 ng/mL的一系列不同浓度的赭曲霉毒素A抗原溶液滴加到电极表面，4 ℃冰箱中孵化30 min，超纯水冲洗电极表面除去未结合的赭曲霉毒素A抗原，制得一种赭曲霉毒素A光电化学传感器。
实施例2一种赭曲霉毒素A光电化学传感器的制备方法，包括以下几个步骤：
（1）将ITO导电玻璃切割至2.5 cm × 1.0 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超纯水清洗30 min，氮气吹干；
（2）取10 µL、5 mg/mL的TiO2滴加到导电玻璃的导电面，室温下晾干，5 µL、3 mg/mL的BiVO4滴加到TiO2上，室温下晾干，450℃煅烧30 min，冷却，得到BiVO4/TiO2，然后在其上面原位生长Ag2S, 制得Ag2S@BiVO4/TiO2修饰电极；
（3）继续在Ag2S@BiVO4/TiO2修饰电极表面滴加3 µL、3 mmol/L的巯基乙酸，室温下晾干，滴加4 μL 的含 1×10-2 mol/L1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺EDC和2×10-3mol/L N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合溶液，4 ℃冰箱中干燥，超纯水冲洗；
（4）继续将4 µL、10 µg/mL的赭曲霉毒素A抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥，超纯水冲洗；
（5）继续将3 µL、质量分数为1.5% 的BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗电极表面；
（6）将4 µL、5 pg/mL-750 ng/mL的一系列不同浓度的赭曲霉毒素A抗原溶液滴加到电极表面，4 ℃冰箱中孵化30 min，超纯水冲洗电极表面除去未结合的赭曲霉毒素A抗原，制得一种赭曲霉毒素A光电化学传感器。
实施例3一种赭曲霉毒素A光电化学传感器的制备方法，包括以下几个步骤：
（1）将ITO导电玻璃切割至2.5 cm × 1.0 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超纯水清洗30 min，氮气吹干；
（2）取12 µL、5 mg/mL的TiO2滴加到导电玻璃的导电面，室温下晾干，6 µL、3 mg/mL的BiVO4滴加到TiO2上，室温下晾干，450℃煅烧30 min，冷却，得到BiVO4/TiO2，然后在其上面原位生长Ag2S, 制得Ag2S@BiVO4/TiO2修饰电极；
（3）继续在Ag2S@BiVO4/TiO2修饰电极表面滴加4 µL、3 mmol/L的巯基乙酸，室温下晾干，滴加5 μL 的含 1×10-2 mol/L1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺EDC和2×10-3mol/L N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合溶液，4 ℃冰箱中干燥，超纯水冲洗；
（4）继续将5 µL、10 µg/mL的赭曲霉毒素A抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥，超纯水冲洗；
（5）继续将3 µL、质量分数为2% 的BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，4 ℃冰箱中晾干，超纯水冲洗电极表面；
（6）将4 µL、5 pg/mL-750 ng/mL的一系列不同浓度的赭曲霉毒素A抗原溶液滴加到电极表面，4 ℃冰箱中孵化30 min，超纯水冲洗电极表面除去未结合的赭曲霉毒素A抗原，制得一种赭曲霉毒素A光电化学传感器。
实施例4所述 TiO2的制备，步骤如下：
取0.02 mol钛酸四丁酯溶解于30 mL乙醇中，30 ℃下加入10 mL超纯水，搅拌120 min后，将混合溶液转移到高压釜中，200 ℃下反应10 h，所得产物用超纯水和无水乙醇离心洗涤，50 ℃真空干燥24 h，得到TiO2粉末。
实施例5所述 TiO2的制备，步骤如下：
取0.025 mol钛酸四丁酯溶解于30 mL乙醇中，30 ℃下加入10 mL超纯水，搅拌120 min后，将混合溶液转移到高压釜中，200 ℃下反应12 h，所得产物用超纯水和无水乙醇离心洗涤，50 ℃真空干燥24 h，得到TiO2粉末。
实施例6所述 TiO2的制备，步骤如下：
取0.03 mol钛酸四丁酯溶解于30 mL乙醇中，30 ℃下加入10 mL超纯水，搅拌120 min后，将混合溶液转移到高压釜中，200 ℃下反应14 h，所得产物用超纯水和无水乙醇离心洗涤，50 ℃真空干燥24 h，得到TiO2粉末。
实施例7所述 BiVO4的制备，步骤如下：
称取1.90 g的Bi(NO3)3·5H2O和0.77 g柠檬酸溶于10 mL乙二醇，形成溶液A；称取0.46 g NH4VO3 溶于25 mL蒸馏水，形成浅黄色溶液B，将B溶液逐滴加入A溶液，再加入30 mL无水乙醇，搅拌30 min，再加入0.85 g Na2CO3调节pH，将混合溶液转移到高压釜中，180 ℃下反应20 h，所得产物用超纯水和无水乙醇离心洗涤三次，60 ℃真空干燥18 h，得到BiVO4。
实施例8所述 BiVO4的制备，步骤如下：
称取1.94 g的Bi(NO3)3·5H2O和0.78 g柠檬酸溶于10 mL乙二醇，形成溶液A；称取0.465 g NH4VO3 溶于25 mL蒸馏水，形成浅黄色溶液B，将B溶液逐滴加入A溶液，再加入30 mL无水乙醇，搅拌30 min，再加入0.85 g Na2CO3调节pH，将混合溶液转移到高压釜中，180 ℃下反应22 h，所得产物用超纯水和无水乙醇离心洗涤三次，60 ℃真空干燥20 h，得到BiVO4。
实施例9所述 BiVO4的制备，步骤如下：
称取1.98 g的Bi(NO3)3·5H2O和0.79 g柠檬酸溶于10 mL乙二醇，形成溶液A；称取0.47g NH4VO3 溶于25 mL蒸馏水，形成浅黄色溶液B，将B溶液逐滴加入A溶液，再加入30 mL无水乙醇，搅拌30 min，再加入0.85 g Na2CO3调节pH，将混合溶液转移到高压釜中，180 ℃下反应24 h，所得产物用超纯水和无水乙醇离心洗涤三次，60 ℃真空干燥22 h，得到BiVO4。
实施例10所述Ag2S@BiVO4/TiO2的制备，包括以下几个步骤：
（1）BiVO4/TiO2的制备
取8 µL、5 mg/mL的TiO2滴加到导电玻璃的导电面，室温下晾干，4 µL、3 mg/mL的BiVO4滴加到TiO2上，室温下晾干，450℃煅烧30 min，冷却，得到BiVO4/TiO2；
（2）Ag2S@BiVO4/TiO2的合成
取2 µL、0.1 mol/L 的巯基乙酸滴加到BiVO4/TiO2，室温晾干，超纯水冲洗，取2 µL、0.08 mol/L 的AgNO3滴加到巯基乙酸修饰的BiVO4/TiO2，避光反应30 min，超纯水冲洗，最后取2 µL、0.1 mol/L的Na2S滴加到BiVO4/TiO2，室温下反应30 min，超纯水冲洗，得到Ag2S@BiVO4/TiO2。
实施例11所述Ag2S@BiVO4/TiO2的制备，包括以下几个步骤：
（1）BiVO4/TiO2的制备
取10 µL、5 mg/mL的TiO2滴加到导电玻璃的导电面，室温下晾干，5 µL、3 mg/mL的BiVO4滴加到TiO2上，室温下晾干，450℃煅烧30 min，冷却，得到BiVO4/TiO2；
（2）Ag2S@BiVO4/TiO2的合成
取3 µL、0.1 mol/L 的巯基乙酸滴加到BiVO4/TiO2，室温晾干，超纯水冲洗，取3 µL、0.08 mol/L 的AgNO3滴加到巯基乙酸修饰的BiVO4/TiO2，避光反应33 min，超纯水冲洗，最后取3 µL、0.1 mol/L的Na2S滴加到BiVO4/TiO2，室温下反应35 min，超纯水冲洗，得到Ag2S@BiVO4/TiO2。
实施例12所述Ag2S@BiVO4/TiO2的制备，包括以下几个步骤：
（1）BiVO4/TiO2的制备
取12 µL、5 mg/mL的TiO2滴加到导电玻璃的导电面，室温下晾干，6 µL、3 mg/mL的BiVO4滴加到TiO2上，室温下晾干，450℃煅烧30 min，冷却，得到BiVO4/TiO2；
（2）Ag2S@BiVO4/TiO2的合成
取4 µL、0.1 mol/L 的巯基乙酸滴加到BiVO4/TiO2，室温晾干，超纯水冲洗，取4 µL、0.08 mol/L 的AgNO3滴加到巯基乙酸修饰的BiVO4/TiO2，避光反应35 min，超纯水冲洗，最后取4 µL、0.1 mol/L的Na2S滴加到BiVO4/TiO2，室温下反应40 min，超纯水冲洗，得到Ag2S@BiVO4/TiO2。
实施例13赭曲霉毒素A的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，如权利要求1所制备的光电化学传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在10 mL、pH 7.4的含0.1 mol/L抗坏血酸的PBS缓冲溶液进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，设置电压为0.1 V，运行时间100 s，照射LED灯波长为400 ~ 450 nm；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔10 s开灯持续照射10 s，然后记录光电流，绘制工作曲线；
（4）将待测的赭曲霉毒素A样品溶液代替赭曲霉毒素A标准溶液进行检测，其线性范围5 pg/mL ~ 750 ng/mL，检测限最低1.6 pg/mL。