本发明涉及一种基于手性高效液相色谱-质谱/质谱联用技术检测和监测生物样品中(r)-特鲁曲班和(s)-特鲁曲班光学异构体含量的方法，属于药物分析领域。
背景技术：
早在20世纪初发现，不同的手性药物对映体，具有不同的性质。通过对手性药物的深入研究，它的研究方法及技术得到了快速发展，人们对手性药物的药理活性也有了更深入的了解，并在短短几十年的时间里，将更多新的手性药物应用于临床。目前，常用的药物中，多数为手性分子，尤其是天然和半合成药物中的手性药物达99％以上，且其存在形式多为单一的对映体。但是，在上市的合成药物中手性药物只占40％，且以单一对映体形式存在的药物仅有六十余种，其余均为不同对映体混合物。手性药物对映体进入人体内后，与生物大分子相互识别、相互作用的过程具有立体选择性，因此导致其生物活性、药动学、药理学活性等方面的差异，有时甚至会引起严重的毒副作用。例如20世纪60年代震惊世界的“沙利度胺事件”导致大约8000个婴儿先天畸形。后来，经过大量的毒理学实验，人们发现，(r)-沙利度胺具有良好的抑制妊娠反应作用，但(s)-沙利度胺可强烈致畸。因此，建立手性药物光学异构体的体内检测方法对药物安全是非常重要的。
特鲁曲班(terutroban，cas:165538-40-9)，有一个手性中心，两个光学异构体，即(r)-特鲁曲班和(s)-特鲁曲班，是一种口服血小板和血管壁中血栓素-前列腺素受体选择性阻断药，属于非前列腺素类可逆的血栓烷受体拮抗剂，是一种非选择性的具有高度亲和力且无内源性拟交感作用的β-受体阻滞剂。
最近的研究表明，特鲁曲班的微出血的概率明显高于阿司匹林，尚未有重大或危及生命出血或颅内出血等报道。但有报道称，该副反应可能与其另外一个对映异构体(s)-特鲁曲班有关。因此，全面和深入的了解特鲁曲班不同对映异构体在生物体内的活性是非常重要的。同时，根据新药申报及临床药物管理的规定，不同的光学异构体应按照不同的化学实体对待。因此，同时建立(r)和(s)-特鲁曲班体内/外药物浓度的分析方法是非常必要的，也是手性药物进一步体内研究的基础。
反相手性高效液相色谱-质谱/质谱联用技术结合了手性色谱柱对光学异构体的分离能力和质谱/质谱联用技术的高灵敏度，可以较好的解决手性药物的光学异构体的体内/外检测问题。然而，针对不同的分离对象，需要对进样量、柱温、洗脱剂(即流动相)、流速、母离子/子离子选择、碰撞能量、锥孔电压等大量条件和参数进行优化和筛选，既要保证光学异构体的分离，还要达到微量或痕量药物的检测要求，难度极大。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于手性高效液相色谱-质谱/质谱联用技术定量检测特鲁曲班光学异构体含量的方法，特别适合临床药物检测/监测的应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
1)样品的准备：将生物样品或生物样品的匀浆液与乙腈混合以沉淀蛋白，通过离心分离沉淀，将离心所得上清液吹干，得到待分析样品；或将非生物样品用乙腈溶解、定容后得到待分析样品；
2)确定手性色谱分离条件：根据(r)-特鲁曲班和(s)-特鲁曲班的分离度≥1.5的要求，手性高效液相色谱分离中采用的流动相为甲醇或乙腈与水、易挥发性缓冲盐以及易挥发性酸的混合溶液，混合溶液中所述缓冲盐的浓度为0.1-10mm，所述酸的体积分数为0.01-0.5％，甲醇或乙腈与水的体积比为1.5-4:1；柱温为5-50℃；进样量为1-10μl；流动相流速为0.1-1ml/min，等度洗脱；
3)确定质谱/质谱工作条件：采用三重四级杆质谱以及多反应监测扫描模式(mrm)；母离子和子离子分别为408.1和223.1；锥孔电压为30-50v；碰撞能量为35-50ev；
4)光学异构体含量测定：对待分析样品进行手性高效液相色谱-质谱/质谱分析，然后利用外标法计算样品中的(r)-特鲁曲班和(s)-特鲁曲班的含量。
所述生物样品选自血浆、组织液、淋巴液、脑脊液、尿液、汗液等，或生物组织，如肝脏、肾脏、心脏、胰脏、大脑等。
所述步骤1)中，沉淀蛋白所用乙腈的体积为生物样品体积的至少4倍。
所述非生物样品包括特鲁曲班的制剂，如片剂、散剂、胶囊剂等，或者是需要检测的土壤、水、粪便等环境监测物。
所述手性高效液相色谱采用反相涂敷型或键合型手性色谱柱，手性填料包括多糖衍生物类填料。
所述缓冲盐包括甲酸铵、乙酸铵、碳酸铵或碳酸氢铵，所述酸包括甲酸、乙酸或三氟乙酸。
所述质谱/质谱的工作条件还包括：驻留时间为0.12-0.16s；esi离子源温度为100-130℃；干燥气的温度为300-450℃，干燥气的流速为400-700l/h；毛细管电压为2.0-3.5kv。
所述外标法(即配制(r)-特鲁曲班和(s)-特鲁曲班的标准溶液，制作标准曲线，利用标准曲线计算待分析样品中的(r)-特鲁曲班和(s)-特鲁曲班的含量)采用的标准曲线的范围为0.1-100ng/ml。
本发明的有益效果体现在：
1)光学异构体的分析灵敏度高、检出限低。对于手性药物的光学异构体的分析，现有方法是利用手性hplc实现的，但是限于方法本身的限制，灵敏度较差，其最低检出限一般在μg/ml，无法实现微量和痕量样品的分析，在生物体内的应用较差；本发明中采用三重四级杆中的mrm扫描模式，在保证光学异构体分离的同时，极大的提高了灵敏度(ng/ml)，可以满足特鲁曲班临床检测的需要(最低检出限为0.1ng/ml)。
2)可同时实现(r)-特鲁曲班和(s)-特鲁曲班的检测。对于生物样品中药物浓度的检测，现有方法可以得到特鲁曲班异构体的总浓度，但是无法实现单一异构体的检测；本发明通过大量实验对手性高效液相色谱-质谱/质谱的条件进行优化，确定了母离子和子离子以及流动相的相关关键参数，首次实现了体内/外特鲁曲班对映异构体的定量分析，为特鲁曲班光学异构体的体内/外检测提供了技术支持，为研究手性药物的体内转化提供了新的思路。
3)可实现自动化的检测，符合临床大样本监测的需要：本发明利用hplc的自动进样功能、可实现无人值守；极大的节省了人力物力，满足多样品、大数据处理的需要。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1血浆中外消旋特鲁曲班的浓度检测
基于手性高效液相色谱-质谱/质谱联用技术定量检测特鲁曲班光学异构体含量的方法，以外消旋特鲁曲班为例，但本发明的保护范围不局限于该实验，具体步骤如下：1)样品的准备；2)确定手性色谱分离条件；3)确定质谱条件；4)光学异构体含量测定。
一、样品准备
①采集生物样品：取给予外消旋特鲁曲班的sd大鼠(5mg/kg，灌胃给药)血浆100μl(采血时间点1h)；
②向上述生物样品中加入400μl乙腈，旋混30s后，12500转/分离心10min，取上清液室温下氮气吹干，得待分析样品，-80℃冻存；
二、确定手性色谱分离条件
上述待分析样品加入50μl的流动相中复溶，采用watersxevotqd分析(r)和(s)-特鲁曲班，条件如下：
色谱柱：大赛璐
色谱条件：
①自动进样，体积5μl；
②流动相是乙腈:水＝80:20(体积比)的混合液(含体积分数0.01％的甲酸和10mm的甲酸铵)，流速为0.3ml/min，等度洗脱；
③柱温箱温度为40℃；
该条件下(r)-特鲁曲班和(s)-特鲁曲班的保留时间分别为：15.24和16.08min，分离度为1.8。
三、确定质谱条件
采用waterstqd的多反应监测扫描模式(mrm)，条件如下：
母离子和子离子分别为408.1和223.1；
锥孔电压为50v；
碰撞能量为35ev；
驻留时间为0.12s；
esi离子源温度为100℃；
n2(干燥气)的温度及流速为300℃和700l/h；
毛细管电压为3.5kv。
四、光学异构体含量测定
数据采集和处理采用masslynxsoftware(version4.1)，定量计算采用targetlynxtmsoftware。配制外消旋特鲁曲班的标准溶液(溶剂为体积分数50％乙腈的水溶液)，浓度分别为：0.10ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml，100ng/ml；上述标准溶液样品与待分析样品采用本实施例中的色谱和质谱条件分析，targetlynxtmsoftware自动计算待分析样品中(r)-和(s)-特鲁曲班的含量。
该实施例中，(r)-特鲁曲班和(s)-特鲁曲班的血药浓度分别为45.6ng/ml和61.5ng/ml。
实施例2尿液中(r)-特鲁曲班的浓度检测
除以下条件外，其他条件与实施例1相同：
①采集生物样品：取已注射(r)-特鲁曲班的sd大鼠尿液100μl(24h的总尿液)；
②色谱柱：大赛璐
③流动相是甲醇:水＝80:20(体积比)的混合液(含体积分数0.5％的乙酸和1mm的乙酸铵)，流速为1ml/min，等度洗脱；
④自动进样，体积10μl；
⑤锥孔电压为30v；
⑥碰撞能量为50ev；
⑦驻留时间为0.16s；
⑧esi离子源温度为130℃；
⑨n2(干燥气)的温度及流速为450℃和400l/h；
⑩毛细管电压为2.0kv；
该实施例中，(r)-特鲁曲班和(s)-特鲁曲班的保留时间分别为：6.93和8.06min；其尿药浓度分别为11.2ng/ml和1.14ng/ml；表明(r)-特鲁曲班在体内能够部分转化为(s)-特鲁曲班，存在体内手性转化现象。
实施例3心脏中(s)-特鲁曲班的浓度检测
除以下条件外，其他条件与实施例1相同：
①采集生物样品：取已注射(s)-特鲁曲班的sd大鼠心脏0.1g(给药后12小时断颈处死，迅速解剖取出心脏)；
制备匀浆液：向生物样品中加入pbs缓冲溶液0.5ml，4℃匀浆，离心后取上清液100μl；
向上述匀浆液中加入400μl乙腈，旋混30s后，12500转/分离心5min，取上清液室温下氮气吹干，得待分析样品；
②色谱柱：大赛璐
③流动相是乙腈:水＝60:40(体积比)的混合液(含体积分数0.5％的三氟乙酸和0.1mm的碳酸氢铵)，流速为0.5ml/min，等度洗脱；
④柱温箱温度为10℃；
⑤锥孔电压为45v；
⑥碰撞能量为40ev；
⑦驻留时间为0.15s；
⑧esi离子源温度为105℃；
⑨n2(干燥气)的温度及流速为400℃和600l/h；
⑩毛细管电压为3kv；
该实施例中，(r)-特鲁曲班和(s)-特鲁曲班的保留时间分别为：7.66和8.52min；其心脏药物浓度分别为0.43ng/ml和23.64ng/ml；表明(s)-特鲁曲班在心脏中能够部分转化为(r)-特鲁曲班，存在体内手性转化现象。
实施例4特鲁曲班口服片的光学异构体含量检测
除以下条件外，其他条件与实施例1相同：
①取非生物样品特鲁曲班片(购于上海波以尔化工有限公司，10mg/片)一片，溶解于1ml乙腈(超声助溶)，离心后取上清液100μl，加入9.9ml乙腈，定容(10ml)；即非生物样品可直接用乙腈溶解、定容后进行分析；
②色谱柱：大赛璐
③流动相是乙腈:水＝60:40(体积比)的混合液(含体积分数0.1％的三氟乙酸和5mm的碳酸氢铵)，流速为0.5ml/min，等度洗脱；
④自动进样，体积1μl；
该实施例中，(r)-特鲁曲班和(s)-特鲁曲班的保留时间分别为：7.12和8.26min。
本发明所针对的是特鲁曲班的光学纯异构体的检测，不同来源的样品(包括环境监测样品)，受样品中其他内源性物质的干扰，其色谱分离条件、质谱检测参数等均不相同，据此得出本发明中的条件范围。
本发明选择反相手性高效液相色谱-质谱/质谱联用技术定量检测特鲁曲班光学异构体含量的方法，解决了在实际生产、科研、临床中特鲁曲班光学异构体的检测/监测所存在的问题，诸如，灵敏度较低以及无法同时检测各光学异构体等。本发明为体内/外特鲁曲班光学异构体的检测提供了一条新的思路和方法，可应用于针对光学纯特鲁曲班在体内/外发生消旋化或部分消旋化而可能引起的药物不良反应问题的科学以及临床研究中，特别适用于临床药物检测/监测的需要。